Name: 셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 Vibrio natriegens를 이용한 셀 프리 단백질 발현 방법으로, 고속 성장 박테리아에서 추출한 활성 거친 추출물을 사용합니다. 플라스미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 템플릿으로 신속한 단백질 합성이 가능하며, 고처리량 스크리닝과 합성생물학 응용에 효과적입니다.

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이 작품은 일반 의료 과학의 국립 연구소 1U01GM110714-01 부의 에너지 드-FG02-02ER63445에 의해 투자 되었다. 저자 박사 리처드 Kohman, 닥터 제니 탐, 및 박사 에드거 Goluch이이 원고에 대 한 프로토콜 섹션을 생성에 도움이 되는 조언에 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li>
<li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+high+yielding+streptomyces%E2%80%90based+cell%E2%80%90free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li>
<li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678(2017).</li>
<li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003(2018).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li>
<li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li>
<li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146(2018).</li>
<li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li>
<li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+natriegens%2C+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li>
<li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li>
<li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens%2C+a+new+genomic+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487(2016).</li>
<li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+in+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088(2017).</li>
<li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537(2018).</li>
<li>Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046(2017).</li>
<li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li>
<li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li>
<li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li>
<li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524(2017).</li>
<li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell-Free+Translation+Systems%22%5BJournal%5D)">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
</ol>

DJW, 아니, GMC이이 작품에 관련 된 특허를 신청 했 고.

이 프로토콜은 야생-타입 natriegens 대 와 세균성 성장 미디어 파운드 V2 소금 (자료 테이블)와 보완의 구성에 대 한 최적화 되었습니다. Natriegens 대 의 다른 긴장 마찬가지로 원유 셀 추출 셀 무료 반응;에 대 한 생성 하 경작 될 수 있습니다. 그러나, 그들의 사용이이 프로토콜의 추가 최적화를 해야합니다. 또한,이 셀 무료 단백질 표정 시스템 기본 에너지 재생 소스로 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA)를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 다른 재생 에너지를 사용할 수 있습니다; 그러나, 시 약 및 교정의 최적화 높은 저조한 단백질 식10,11를 얻을 필요가 있을 것 이다.
이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계에 특정 관심 높은 저조한에 대 한 최대한 추출 생산성을 보장 것입니다 셀-무료 단백질 생산. 첫째, 원유 세포 추출 물 세포 배양 natriegens 대 성장;의 중간 지 수 단계에서 수확에서 준비 해야 합니다 문화 도달 OD600 단백질 수확량은 최대 1.0 ± 0.2 =. 광학 밀도의 범위에서 수확 하는 셀에서 셀 무료 단백질 생산 가능한 동안, 우리는 이전 발견 세포의 성장 지 수 상태에서 수확 훨씬 더 많은 단백질9항복. 조 셀 추출 성능에 광학 밀도의 관찰 된 효과 그 배치 문화 조건1에서 성장 하는 세포에서 파생 된 다른 셀 무료 식 시스템에 대 한 보고와 일치. Natriegens 대 는 빠른 속도로 성장 하기 때문에 그것은 밀접 하 게 모니터 문화 광학 밀도 중요입니다. 일반적으로, 그것은 natriegens 대 문화 reproducibly 1−1.5 h;이 프로토콜을 사용 하 여 내 1.0의 OD600 를 도달 해야 예상 그러나,의 사용과 같은 개별 성장 조건 대 비 당황 플라스 크, 어떤 영향을 미치는 폭 기, 또는 물 외피, 속도 안정성의 외피 온도 영향을 미치는, 대 공기 성장 시간을 변경할 수 있습니다 당황. 또한, 그것은 적어도 250 mL natriegens 대 1 L 당황 하 고 플라스 크에서 쉽게 조작 및 전송에 대 한 수확에 큰 셀 펠 릿을 위해 문화 일반적으로 것이 좋습니다. 이 원유 셀 추출 물 준비는 펠 릿에서 추출의 총 볼륨 생산 증가의 성공을 크게 향상 시킵니다. 작은 규모의 준비를 사용 하 여, 문화 및 시 약 조정할 수 있습니다 적절 하 게. 대규모 발효에 대 한 추가 문화 조건의 최적화 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 높은 단백질 수율을 보장 하기 위해, 그것은 중요 한 셀 펠 릿, 수확 직후 또는-80 ° c.에 저장의 1−2 일 이내 처리 됩니다.
펄스 쥡니다에 의해 셀 펠 릿의 적절 한 세포 단백질 세포 자유로운 식의 성공에 중요 한 이며 종종 새로운 사용자를 위해이 프로토콜의 가장 어려운 부분입니다. 일반적으로, 잘 lysed 펠 릿 하 파편의 액체 추출의 중요 한 볼륨을 얻을 것입니다. 추출 물은 약간 점성 해야 하지만 저장소에 aliquoting 플래시 액체 질소에서 동결 전에 튜브 때 쉽게 pipetted. 그림 3 게시물 세포 원심 분리 단계 후 저조한 lysed 펠 릿 (그림 3B)에 비해 잘 lysed 펠 릿 (그림 3A)의 표현을 보여 줍니다. 완전 한 세포 세포의 용 해의 주요 표시 원유 셀 추출 총 단백질 농도 > 20 mg/mL 총계 단백질 분석 결과 (단계 2.13)에 의해 결정 되는. -쥡니다 또는 원유 셀 추출의 과도 한 난방 셀 무료 반응 하지 않고 확인할 수 없는 세포 기계를 손상 됩니다. 따라서, 다운스트림 단백질 식 응용 프로그램을 상당한 시간과 노력을 할애 하기 전에 제어 반응 추출 효율 테스트에 매우 유리 하다. 추가 최적화 다른 쥡니다 장비에 필요한 있을 수 있습니다, 하는 동안 설명 하는 펄스 쥡니다 단계 높은 우리 손에 재현 되었습니다.
선형 DNA 템플렛 PCR 증폭, 금지 효소 소화, 또는 상업적 유전자 합성에서 파생 된를 사용 하 여 크게 셀 무료 식 시스템24높은 처리량 및 빠른 단백질 생산을 위한 수 용량을 증가할 수 있다. PCR 증폭 선형 템플릿에서 단백질 생산 입증 되었습니다,이 반응의 수확량은 약 13.5-fold 낮은 아데닌 비율9서식 파일 DNA 플라스 미드를 사용 하 여 반응에 비해. 이것은 주로 생 nucleases 원유 세포 추출 물 natriegens 대 에 의해 저하 가능성이 있는 선형 DNA 템플렛의 불안정성. 람다 파지 단백질 GamS는 이전에 사용 된 선형 DNA 템플릿24,25를 보호 하기 위해, 하는 동안 natriegens 대 와 호환 되도록 추출9발견 했다. 또한, 선형 DNA 템플렛의 농도 증가 더 높은 단백질 생산량에 대 한 수 있습니다, 반면 원유 세포 추출 물에 그것의 빠른 저하 여전히 주요 문제 것입니다.
선형 DNA 템플릿 저하를 극복 하는 솔루션 선형 DNA의 생체 외 녹음에서 생성 된 mRNA 서식 파일 셀 무료 반응을 보충 될 수 있습니다. 다른 한편으로, RNase 억제제를 사용 하 여 mRNA 사본 저하에 대 한 중요 한 보호를 제공 하 고 감지할 수 단백질 수율 10 μ 셀 무료 반응 형식 (그림 5AB)에서 구할 수 있습니다. TA 결 찰을 통해 원형 템플릿으로 선형 DNA의 복제, 템플릿 저하 회피 TOPO 클로닝, 골든 게이트 어셈블리 또는 다른 재조합 방법을 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 더 접근 nuclease 활동의 저해에 대 한 선형 DNA 템플렛을 사용 하 여 효율적인 단백질 표정에 필요한 있을 것입니다.
날짜 하려면, 몇 가지 다른 방법은 셀 무료 단백질 식9,10,,1126원유 추출의 준비에 대 한 제안 되었습니다. 이 프로토콜을 개발, 우리 사용자 접근성을 극대화, 전반적인 비용을 삭감 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 최소화 하고자 했다. 예를 들어 높은 단백질 수율 간단한 2 단계 쥡니다 원심 분리 과정을 사용 하 여 달성 되 고 셀 균질, 긴 투 석 단계 또는 실행 반응 필요 하지 않습니다. 그것은 시간의 짧은 기간에 실행을 간단 하 고 실험실 전문성의 높은 레벨을 필요로 하지 않습니다. 따라서, 그것은 변환 학술 연구 및 산업 공정 설계에 대 한 표준으로 셀 자유 식 용이 하 게 도울 수 있다.
이 프로토콜은 조사 및 natriegens 대, 독특한 생물 학적 특성을 가진 비 모델 생물의 유틸리티에 사용할 수 있는 도구 키트를 확장합니다. 높은 단백질 수율 세미-또는 완전히-연속 셀 무료 반응, 에너지 재생 허용을 사용 하 여 달성 될 수 있다 아미노산, 그리고 폐기물3,,527의 제거의 재공급. 또한, 야생-타입 natriegens V. DNAse 불충분 또는 RNAse 한 종자를 생산 하기 위해의 공학, 해로운과 경쟁 변화 통로의 제거 및 추가 tRNAs 표현의 크게 향상 시킬 수 있는 단백질의 생산 이 시스템28,29. 우리가 그것의 급속 한 성장 기본 생물학 해명, natriegens V. 셀 무료 시스템의 추가 개발 수 있습니다 bioproduction 기능을 촉진과 치료 펩 티 드, 작은 분자, 및 합성의 강력한 표현 사용 재료입니다.

셀 무료 단백질 합성은 귀중 한 단백질 또는 펩 티 드1,2,,34의 표현에 대 한 다양 하 고 비용 효율적인 방법입니다. 역사적으로, 셀 무료 단백질 합성 수행 된 대장균 식 시스템을 사용 하 여 그러나, 거기를 사용 하 여 대체, 비 모델 생물 소설 속성 섀시로 셀 자유 식5,6,7,,89 으로 최근 급등이 하고있다 , 10 , 11 , 12. 생물 고유의 대사 프로필은 주요한 후보자 대장균 세포-무료 시스템 대안. 예를 들어 비 브리 오 natriegens 는 관찰 된 모든 알려진된 생물의 급성장은 해양 박테리아1310 분 미만의 시간을 두 배로. 이 대 한 연구와 생명 공학14,15,,1617,18신흥 미생물 호스트 natriegens V. 상당한 관심을 얻고 있다. Natriegens 대 의 급속 한 성장 속도 그 단백질 합성과 대사 효율19,20,21, 셀-무료에 대 한 그것의 세포질 기계 활용의 높은 속도에 연결 되어있다 합성 크게 빠른 단백질 생산 및 높은 처리량 검열에 대 한 도구 키트를 확장 수 있습니다.
최근, 한 셀-무료 식 시스템 natriegens V. T7 발기인93 h에서 > 260 μ g/mL의 농도에서 슈퍼 폴더 GFP (sfGFP) 생산 능력은 입증 되었습니다. 이 방법을 개발의 전반적인 목표는 시간의 짧은 금액에 일반 실험실 장비를 사용 하 여 준비 될 수 있다 매우 액세스할 수, 비용 효율, 재현성, 및 높은 저조한 셀 무료 단백질 표정 시스템 사용자를 제공 했다. 이 프로토콜에 쉐이크 플라스 크 1 L 문화, 펄스 쥡니다, 및 병렬화 및 심사 처리량을 최대화 하기 위해 96 또는 384 잘 형태로 소규모 일괄 처리 반응에 의해 세포 세포의 용 해를 사용 합니다. 긴, 지속적인 단백질 표정은 가능 하 게 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA)의 보충에 의해 에너지 소스8,,2223으로. 이 프로토콜을 성공적으로 완료 되 면 사용자는 원하는 단백질을 표현 하는 능력 있을 것 이다 또는 natriegens 대 원유 셀을 사용 하 여 셀 무료 형태로 단백질의 집합 추출.
조 셀 추출 물 natriegens 대 600에서 광학 밀도에서 수확 하는 세포에서 준비가 글리세롤 재고에서 시작 해 서, 1.0 nm (OD600). 1 L 문화 25% 원유 세포 추출 물에서 800 개 이상의 셀 무료 반응에 대 한 충분 한 추출 물의 약 2−3 mL를 얻을 것입니다. 단백질은 플라스 미드 DNA, 선형 DNA 나 mRNA 템플릿;를 사용 하 여 표현 될 수 있다 그러나, 내 생 nucleases에 의해 선형 DNA 템플릿 저하 야생 타입 natriegens V. 셀-무료 시스템9를 사용 하 여 주요 단점은 남아 있습니다. Natriegens 대 문화에서 시작 해 서, 단백질 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 유용한 얻을 수 있습니다 단일 사용자에 의해 1−2 전체 일에서.

<table><tbody><tr><td>15 mL 튜브,</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 튜브,</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>384웰 Black Assay 플레이트,</td><td>Corning</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>384웰 PCR 플레이트,</td><td>Eppendorf</td><td>951020702</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td>, <td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96웰 PCR 플레이트,</td><td>Eppendorf</td><td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 3',5'-고리형 모노포스페이트 나트륨 염 일수화물</td><td>시그마</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트 - 100mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4388444</td><td></td></tr><tr><td>분석 플레이트 접착제</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 수화물(NAD)</td><td>Sigma/Roche</td><td>10127965001</td><td></td></tr><tr><td>코엔자임 A 수화물</td><td>Sigma</td><td>C4283</td><td></td></tr><tr><td>시티딘 5'-트리포스페이트 - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-3-포스포글리세르산 다이소듐 염 (3-PGA)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>듀어 플라스크 - 4L</td><td>ThermoScientific</td><td>10-194-100C</td><td></td></tr><tr><td>DL-디티오트레이톨 용액 - 1 M</td><td>시그마</td><td>42816</td><td></td></tr><tr><td>폴린산 칼슘 염 수화물</td><td>시그마</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5'-트리포스페이트 - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 헤미마그네슘 염 사수화물</td><td>시그마</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 칼륨염 일수화물</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수(Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)Sigma</td><td></td> <td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 pJL1-sfGFP</td><td>Addgene</td><td>69496</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 플러스 Maxi 키트</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) -8000</td><td>시그마</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td> <td>시그마</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼륨 펠렛</td><td>시그마 / 로슈</td><td>1050121000</td><td></td></tr><tr><td>Q125 초음파 발생기 및 CL-18 프로브 (?-inch 팁 포함</td>) <td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>RNA 클린 및 농축기 키트</td><td>Zymo</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제, 쥐</td><td>NEB</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RTS 아미노산 샘플러</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0251</td><td></td></tr><tr><td>Tris 용액(pH 8.0) - 1 m</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>대장균 MRE 600</td><td>Sigma/Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5'-triphosphate - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Vibrio natriegens (야생형) 동결건조 원료</td><td>ATCC</td><td>14048</td><td></td></tr></tbody></table>

셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

해양 박테리아 비 브리 오 natriegens 그것의 빠른 성장 속도 때문에 생명 공학에 대 한 새로운 미생물 호스트로 상당한 관심을 얻고 있다. 일반적인 프로토콜은 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여 원유 셀 추출 natriegens 대 의 준비에 대 한 설명 합니다. 이 높은 저조한 프로토콜은 특별히 되었습니다 사용자 액세스에 대 한 최적화 및 비용 감소. 셀 무료 단백질 합성 (CFPS) 작은 규모 10 μ 배치 반응 96 또는 384 잘 형식에서에서 실행 될 수 있습니다 그리고 reproducibly 전반적 > 260 μ g/mL 슈퍼 GFP (sfGFP) 내의 폴더 3 헤의 농도 산출, 원유 셀 추출 준비 및 CFPS 단일 사용자에 의해 1−2 일에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 바이오 생산 및 합성 생물학 응용 프로그램을 촉진 하기 위해 기존 단백질 합성 파이프라인에 쉽게 통합할 수 있습니다.

셀-무료 식 시스템은 높은 처리량 합성과 중요 한 단백질의 심사에 대 한 강력 하 고 비용 효율적인 도구입니다. 여기, 우리는 플라스 미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 서식 파일을 사용 하 여 급속 한 단백질 생산에 대 한 비 브리 오 natriegens 를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 시스템의 준비를 설명 합니다.

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

세포 없는 단백질 발현을 위한 당사의 프로토콜은 단순하고 시간 효율적인 2단계 초음파 처리-원심분리 공정을 사용하여 제조되는 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens로부터 고활성 원유 추출물을 사용합니다. 원유 세포 추출물 제제 및 세포 없는 단백질 합성은 단일 사용자가 1~2일 이내에 달성하여 이 기술을 생물 생산 또는 합성 생물학 애플리케이션을 위한 파이프라인에 쉽게 통합될 수 있도록 합니다. 하룻밤 사이에 비브리오 나트리겐 문화의 1 밀리리터를 10, 600배 의 벤치탑 원심분리기로 원심분리하여 1분간 씻어주세요.펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인하고 신선한 LB-V2 미디어의 1밀리리터로 재보선다. 1 밀리리터의 세척된 하룻밤 문화를 오토클레이브 4리터 당황한 에렌마이어 플라스크에 신선한 LB-V2 성장 매체 1리터로 접종하여 1-100개의 희석 배급을 달성합니다. 225 RPM으로 흔들면서 섭씨 30도에서 문화를 성장시다.분광계를 사용하여 배양 OD 600을 모니터링합니다. 그리고 1.0 플러스 또는 마이너스 0.2에 도달하면 섭씨 4도에서 20 분 동안 3, 500 배 에서 두 개의 500 밀리리터 튜브에서 원심분리하여 문화를 수확한 다음 얼음 위에 놓습니다. 상류체를 흡인하고 펠릿을 즉시 처리합니다.셀 리시스 시술을 시작하기 전에 신선하게 준비된 S30 용해 버퍼 pH 7.7에서 약 4도까지, 이 차가운 S30 용해 버퍼의 10 밀리리터를 사용하여 동일한 1리터 배양에서 발생하는 모든 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 그리고 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 이송합니다. 이 서스펜션은 섭씨 4도에서 10분 동안 3, 500배 g에서 10분간 이 서스펜션을 한 다음 펠릿을 방해하지 않고 초퍼를 흡인하고 얼음 위에 놓습니다.차가운 방에서 일하는 것은 얼음 위에 놓인 50 밀리리터 튜브의 펠릿에 차가운 S30 용해 버퍼 500 마이크로리터를 추가합니다. 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 재일시 중단하고 얼음 위에 있는 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 이송하십시오. 매우 활성 원유 추출물을 생산하기 위해서는 세포가 S30 버퍼로 희석되지 않고 효율적인 초음파 처리를 위한 충분한 액체를 가지고 있는지 확인해야 합니다.600밀리리터 비커를 얼음으로 채우고 얼음 위에 2밀리리터 튜브 홀더를 놓습니다. 세포를 균질화하기 위해 튜브를 잠시 소용돌이시다. 캡 의 하단에있는 모든 세포를 제거하고 캡을 열고 튜브 홀더에 배치합니다.낮은 초음파 처리기는 튜브의 세포 현탁액으로 팁을 주어 액체 표면 바로 아래에 있습니다. 1/8인치 팁 직경의 초음파 처리기와 프로브를 사용하여 초음파 처리 설정을 준비합니다. 초음파 처리기는 20 킬로 헤르츠 주파수와 50 % 진폭으로 설정합니다.펄스 온 시간 10초, 펄스 오프 시간 60초. 펄스 초음파 처리 프로토콜을 세 사이클로 실행합니다. 그리고 원심분리기 조세포 추출물은 16, 000배, 섭씨 4도에서 섭씨 30~45분 동안 000배 추출하여 세포 이물질이 없습니다.초음파 처리가 수행됨에 따라 셀 리시스를 시각적으로 검사하는 것은 초음파 처리가 예상대로 작동하는지 확인하는 데 중요합니다. 차가운 방에서 일알리쿼트 50 새로운 2 밀리 리터 튜브에 결과 슈퍼 나티의 마이크로 리터는 펠릿을 방해하지 않도록. 이러한 원유 세포 추출물을 얼리려면 튜브를 침지 끈이 부착된 튜브 홀더에 넣고 액체 질소가 함유된 데워로 잠기고 얼어 붙었는지 확인합니다.DNA 템플릿을 사용하여 세포 없는 단백질 발현을 수행하기 위해 실온에서 10X 에너지 솔루션 마스터 믹스, 4X 아미노산 마스터 믹스 알리쿼트 및 DNA 템플릿을 해동한다. 그런 다음 T7 RNA 폴리머라제 및 RNA효소 억제제 스톡을 영하 20도의 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 일단 DNA 템플릿, 10X 에너지 솔루션 마스터 믹스, 4X 아미노산 마스터 믹스해동, 얼음에 배치.각 성분을 얼음 위에 2밀리리터 튜브에 정확한 순서로 추가하여 세포 없는 반응 마스터 믹스를 준비하고, 마스터 믹스에 추가된 후 튜브를 부드럽게 쓸어넣습니다. 비브리오 나트리겐스 원유 셀은 영하 80도 냉동고에서 제거하여 해동될 때까지 10~20분 동안 얼음 위에 놓습니다. 해동된 조세포 추출물의 적절한 부피를 세포없는 반응 마스터 믹스에 넣고 파이펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다.써모사이클러를 사용하여 엔드포인트 세포 없는 단백질 발현을 수행하기 위해 먼저 96웰 PCR 플레이트의 하단에 셀 프리 반응 마스터 믹스 10마이크로리터를 추가하여 PCR 플레이트로 의 각 전달 사이에 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어가 마스터 믹스를 혼합합니다. 10초 동안 1, 000배 g의 플레이트원심분리기를 원심분리하여 우물 의 측면에 붙어있을 수 있는 마스터 믹스를 풀링합니다. 그리고 증발을 방지하기 위해 플레이트 접착제로 우물을 밀봉.플레이트를 섭씨 26도에 설정된 열순환기에 넣고 105도의 가열된 뚜껑을 설치합니다. PCR 플레이트내의 반응을 최소 3시간 동안 배양한 후, 발현 단백질은 정제, 정량화 및 다운스트림 공정에 사용될 수 있다. 투명 유리 바닥이 있는 블랙 384-음 분석 플레이트의 바닥에 세포 없는 반응 마스터 믹스의 웰당 플레이트 판독기 파이펫 10 마이크로리터를 사용하여 세포 없는 단백질 발현 운동학을 모니터링한다.그리고 증발을 방지하기 위해 투명 플레이트 접착제로 우물을 밀봉. 분석 플레이트를 섭씨 26도에 설정된 플레이트 판독기에 넣고 3~6시간 동안 배양하고 발현 된 단백질에 해당하는 적절한 형광/방출 파장을 모니터링합니다. 이 프로토콜에 기재된 세포 자유 발현 시스템은 플라스미드 DNA 템플릿을 통해 종점 및 운동 분석에 의해 도시된 것과 동일한 양의 선형 DNA보다 훨씬 더 많은 양의 단백질을 산출하여 최상의 결과를 달성한다.생체 내 전사 반응에 의해 생성된 mRNA는 또한 사용될 수 있었습니다, 그러나 mRNA의 더 높은 양이 요구됩니다. 단백질 생산의 수율은 마그네슘과 칼륨 이온의 농도에 의해 현저하게 영향을 받았다. 최적화된 조건에서 최적의 마그네슘 이온 농도는 3.5 밀리몰러와 칼륨 이온, 80 밀리몰러인 것으로 나타났다.따라서 이러한 최적의 이온 농도에서 편차는 단백질의 상당한 수율을 생성하기 위해 이 발현 시스템에 대한 용량 감소의 결과를 초래할 수 있다. 모든 시약을 얼음에 보관하거나 가능한 한 차가운 방에서 일하는 것이 중요합니다. 또한 적절하고 완전한 초음파 처리는 이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다.이 프로토콜에 따라 사용자는 많은 다른 단백질의 활동을 위해 정제하고 화면에 사용할 수있는 높은 처리량 형식으로 단백질을 표현할 수있는 능력을 갖게됩니다. 이 기술은 세포 없는 발현을 위한 독특한 특성을 가진 새로운 유기체의 사용을 보여줍니다. Vibrio natriegens는 기존 모형 유기체에서 이전에 미개척되지 않은 단백질 또는 작은 분자의 발현을 위한 유일한 조건을 제공할 수 있는 할로필 급속하게 성장하는 박테리아입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Wiegand, DJ, Lee, et al., 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 사용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 조추출물 생성을 위한 박테리아 펠릿을 준비하기 위해 폭기 조건에서 빠르게 성장하는 박테리아인 Vibrio natriegens의 배양 및 수확을 보여줍니다.

빠르게 성장하는 박테리아 비브리오 natriegens 배양

출처: Wiegand, DJ, et al. 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 이용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019).이 비디오는 높은 단백질 합성 속도로 잘 알려진 빠르게 성장하는 박테리아인 Vibrio natriegens에서 세포 추출물을 제조하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 펠릿은 세포 분해를 방지하기 위해 얼음 위에서 초음파 처리하기 전에 용해 완충액에 세척하고 재현탁합니다. 용해물을 원심분리하여 불용성 세포 파편을 분리하고, 세포 추출물을 수집하여 급속 냉동하여 향후 사용을 위해 보관합니다.

Vibrio natriegens에서 조세포 추출물의 제조

출처: Wiegand, DJ, et al. 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 이용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019).이 비디오는 Vibrio natriegens 조 용해물을 기반으로 하는 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템을 사용하여 결합된 시험관 내 전사 및 번역을 수행하는 방법을 보여줍니다. 필수 성분이 포함된 마스터 믹스의 준비와 DNA 주형에서 기능성 단백질의 단계별 합성을 강조합니다.

박테리아 조세포 추출물을 사용한 무세포 단백질 발현

일렉트로 변형으로 알려진 공정에서 박테리아로 DNA를 도입하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. electrocompetent 세포의 제조를위한 기존의 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 문서는 다른, 빠른, 그리고 현재 일부 실험실에서 사용 electrocompetent 세포의 준비를위한 효율적인 방법을 설명합니다.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

이 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 세균성 용해를 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명하며, 대장균의 엔지니어링 된 균주를 사용하고 표준 실험실 장비만 필요합니다.

세균 세포 없는 Lysate의 신속하고 저렴하며 단순한 생산

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

본 프로토콜은 세포외 막 결합 소포 내부에 포장된 전형적으로 불용성 또는 이황화 결합 함유 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 박테리아 생산을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 이것은 응용 생명 공학 및 의학을 포함한 과학 연구의 다양한 영역에 적용될 가능성이 있습니다.

E. coli의 재조합 단백질 충전 소포의 최적화된 생산 및 분석

이 기사에서는 C41(DE3) 발현 시스템에서 독성 뉴클레아제인 재조합 Nsp15를 과발현한 다음 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 태그가 지정된 단백질을 정제하는 방법론에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 다른 까다로운 독성 단백질에 적용될 수 있습니다.

대장균에서 독성 뉴클레아제를 과발현 및 정제

배우세요 Vibrio natriegens를 이용한 셀 프리 단백질 발현 방법으로, 고속 성장 박테리아에서 추출한 활성 거친 추출물을 사용합니다. 플라스미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 템플릿으로 신속한 단백질 합성이 가능하며, 고처리량 스크리닝과 합성생물학 응용에 효과적입니다.

셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

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