마우스 기관에서 브러시 셀의 격리 및 정량 평가
2019년 6월 12일
브러쉬 세포는 순진한 마우스 기관에서 발견되는 희귀한 해 화학 감각 상피 세포이다. 그들의 한정된 수 때문에, 기도 면제 및 리모델링에 있는 그들의 기능적인 역할의 ex vivo 평가는 도전적입니다. 우리는 유세포에 의한 기관 브러시 세포의 격리 방법을 설명합니다.
우리는 콜린 아세틸 트랜스퍼라제 형광 기자 마우스에서 기관 브러시 세포, 희귀 전문 화학 감각 상피 세포의 격리를위한 절차를 개발했다. 이 방법은 아막코사로부터 의 기관 상피의 초기 분리를 기반으로 하여 파통과 함께 상피 시트의 후속 짧은 잠복이 허용된다. 이를 통해 기관 브러시 세포의 강력한 회복을 가능하게 하며 RNA 시퀀싱에 의한 브러시 세포의 격리 및 전사 분석에 성공적으로 사용되었습니다.
소화 효소를 가진 긴 잠복은 세포 생존력을 감소시키고 조직에서 고립된 세포의 전사 단면도를 바꿀 수 있습니다. 여기서 우리는 디스파스로 기관 상피를 분리하고 그 후 실행 가능한 브러시 세포의 높은 수율을 생산하는 짧은 시간 동안 papain로 배양합니다. 우리의 방법은 상부 기도 상피의 연구에 기여할 수 있습니다.
동일한 프로토콜은 비강 조직과 같은 다른 점막 부위에서 브러시 세포를 격리하는 데 적용될 수 있다. 우리의 매우 재현 가능한 기술의 데모는 동료 과학자가 기관 브러시 세포를 격리하고 더 조사할 수 있게 합니다. 이 절차를 시작하려면 디스파스 소화 용액을 준비하기 위해 여기에 표시된 최종 농도에서 PBS에 디스파스 및 DNase I를 추가하십시오.
섭씨 37도에서 수조에서 용액을 예열하기 전에 디스파스 분말이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 다음으로 DMEM에 5%의 열 비활성화 FBS를 추가하여 정지 솔루션을 준비합니다. 티로데 1완충을 준비하려면 칼슘 없이 HEPES 티로데의 완충에 패아픔과 L-시스테인을 넣으세요.
티로데II 버퍼를 준비하려면 밀리리터당 2마이크로리터의 농도로 칼슘 없이 HEPES 티로데의 버퍼에 루페틴을 넣으세요. FACS 버퍼를 준비하려면 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없이 행크의 균형 잡힌 소금 용액을 2밀리머 EDTA와 2%FBS로 보충합니다. 마우스를 안락사한 후, 21 게이지 바늘을 사용하여 상하 사지가 확장된 척추 위치의 수술 판에 고정하십시오.
70%에탄올로 모피를 스프레이하여 이 지역을 살균합니다. 직선 집게를 사용하여 복부의 피부와 털을 들어 올리고 해부 가위를 사용하여 중앙에 절개를 합니다. 가위를 사용하여, 맨디불라에 복부에서 피하 조직에서 피부를 분리합니다.
피하 조직을 집게로 들고 있는 동안 복벽 중앙에 가위를 작은 절개를 합니다. 그런 다음 V자 절개를 한 복막을 엽니다. 집게를 사용하여 소장을 옆으로 부드럽게 이동합니다.
복부 대오르타와 베나 카바를 찾아 급속한 퇴출을 허용하기 위해 해부 가위와 절개를합니다. 다이어프램을 찾습니다. 18 게이지 바늘을 사용하여 흉골 바로 아래에 있는 다이어프램에서 개구부를 만들어 폐를 수축시합니다.
날카로운 뾰족한 직선 해부 가위를 사용하여 갈비뼈의 베이스를 따라 잘라 흉곽에서 다이어프램을 조심스럽게 분리합니다. 집게를 사용하여 흉골의 노출된 끝을 들어 올리고 흉골을 흉곽 의 기지에서 목으로 세로로 자른다. 짧은 직선 가위를 사용하여 중앙 자궁 경부 절개를 하고 복종선의 두 엽을 분리하십시오.
그 후, 미세 한 포인트 고정밀 집게를 사용하여 주변 결합 조직과 카리나 위에 있는 흉선을 조심스럽게 제거하십시오. 먼저 후두개증의 수준에서 근위 쪽 끝을 분리한 다음 기관지의 양분의 수준에서 해부함으로써 기관을 무료로 해부한다. 후두를 찾아 간구에서 카리나까지 세로로 기관을 잘라냅니다.
우선, 기관지는 섭씨 37도까지 예열된 디스파스 소화용액 750마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 직접 조명에 대한 노출을 줄이고 200 RPM의 셰이커와 실온에서 40 분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 5%의 FBS로 DMEM의 750 마이크로리터를 추가하여 반응을 멈추고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
기관을 페트리 요리로 옮는다. 상피 측이 위를 향하여 기관체를 방향을 지정합니다. 세로적으로 해부된 기관체는 간질 고리에 의해 유지되는 반 원통형 모양을 가지고 있습니다.
상피는 오목한 표면에 있습니다. 직선 집게를 사용하여, 페트리 접시에 기관의 epiglottis 영역을 밧줄과 기관 떨어져 상피를 긁어 크기 22 처리 메스를 사용합니다. 상피 층은 반투명 시트로 분리됩니다.
메스를 사용하여 상피를 다진 후 상피 층을 2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 페트리 접시에 750 마이크로리터의 타이로데 1편을 버퍼링하고 상피층을 포함하는 튜브로 옮기다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 직접 조명에 대한 노출을 줄이고 30 분 동안 200 RPM에서 셰이커에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.
그런 다음 콜드 티로드 II 버퍼 750 마이크로리터를 추가합니다. 소화된 조직을 20~30초 동안 힘차게 소용돌이시다. 18 게이지 바늘에 부착 된 주사기를 사용하여, 호모게이지네이트를 10 번 삼중화.
이 후, 21 게이지 바늘로 전환하고 10 ~ 20 더 세리세게. 100 마이크로미터 여과기를 통해 50 밀리리터 원내 튜브로 세포를 필터링합니다. 30대 1의 체적 비율로 콜드 FACS 버퍼를 추가합니다.
원심분리기는 350배, 섭씨 4도에서 10분간. 상체를 버리고 차가운 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다. 이 서스펜션을 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브로 옮기십시오.
원심분리기는 다시 350배, 섭씨 4도에서 10분간 다시 원심분리기를 사용한다. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 다음으로, 항체를 차단하는 항마우스 CD1632의 마이크로리터 를 추가하여 비특이적 결합을 차단하고 15분 동안 얼음에 배양합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각각의 등류형 컨트롤에 항체를 추가합니다. 직접 조명으로부터 보호하면서 45분 동안 얼음에 배양합니다. 그 후, 차가운 FACS 버퍼의 4.5 밀리리터를 추가하고 혼합합니다.
원심분리기는 350배, 섭씨 4도. 상체를 버리고 300 마이크로리터의 콜드 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다. 유동 세포 계수 정렬 직전에 프로피듐 요오드를 추가합니다.
이 연구에서는, ChAT eGFP 아세틸콜린 형광 기자 마우스로부터의 기관 브러시 세포는 RNA 시퀀싱을 위해 성공적으로 분리된다. 세포는 전방 및 측면 산란 각도로 이물질에서 식별됩니다. 더블은 전방 산란 높이와 너비 및 측면 산란 높이 및 너비를 사용하여 제외됩니다.
두 배는 너비 값이 높은 셀입니다. 단일 세포 내에서, 살아있는 세포는 프로디듐 요오드 음성인 집단으로 확인된다. 살아있는 단일 세포 내에서, CD45는 상류형 대조군을 기반으로 낮은 음수 세포로 확인된다.
CD45 낮은 음수 세포 내에서 FITC 채널에서 eGFP 양성인 EpCAM 양성 세포는 브러시 셀의 집단이다. 브러쉬 세포 수는 미생물 대사 산물과 원생동물에 노출에 의해 변경되고 그러므로 기관 microbiota의 가변성을 반영합니다. 따라서, 우리는 유동 세포 분류에 의해 고립 된 브러시 세포의 예상 수를 측정하기 위해 형광 현미경 검사법에 의해 브러시 세포의 수를 추정하는 것이 좋습니다.
격리된 브러시 셀의 수율을 결정할 때 기관지의 상피 층을 올바르게 분리해야 합니다. 상기 분리된 기관 브러시 세포는 RNA 염기서열 분석, 세포 배양 및 기능분석과 같은 광범위한 분석에서 사용될 수 있다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
이 연구는 마우스 기관지에서 드문 콜린성 화학수용 상피 세포인 기관지 브러시 세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 기도 면역 및 리모델링에서 기능 분석을 위해 이러한 세포의 회복을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경 과학
- 세포 생물학
- 호흡 생리학
배경
- 기관지 브러시 세포는 특수화된 상피 세포입니다.
- 기도 면역에서 역할을 합니다.
- 드물기 때문에 이러한 세포의 분리는 어렵습니다.
- 기존 방법은 세포 생존율을 손상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 기관지 브러시 세포를 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 그들의 기능적 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.
- RNA 시퀀싱을 통한 전사 분석을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 기관 상피와 점막 하층을 분리합니다.
- 세포 생존율을 유지하기 위해 파파인으로 단기 배양합니다.
- 효과적인 상피 분리를 위해 디스페이스를 사용합니다.
- 생존하는 브러시 세포의 높은 수율 회복합니다.
주요 결과
- 기관지 브러시 세포의 성공적인 분리.
- 분리된 세포의 높은 생존율.
- 이 방법은 후속 전사 분석을 허용합니다.
- 상부 기도 상피 연구에 기여합니다.
결론
- 개발된 방법은 브러시 세포를 분리하는 데 효과적입니다.
- 세포 생존율과 전사 무결성을 보존합니다.
- 이 기술은 기도 생물학 연구를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolation of rare chemosensory epithelial cells enables mechanistic de-risking of airway biology targets by providing a validated biological system for functional interrogation. This method supports target validation and assay development in respiratory disease research by delivering viable, transcriptionally intact brush cells for downstream analysis. The procedure enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability associated with enzymatic dissociation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cholinergic chemosensory pathways in airway epithelial cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible source of viable brush cells for functional validation of airway targets.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through transcriptional profiling of isolated brush cells via RNA sequencing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized epithelial sheets for consistent preparation of brush cell suspensions in assay workflows.
- Operational Value: Short papain incubation preserves cell viability and transcriptional integrity for reliable functional readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative evaluation of brush cell responses to microbial metabolites and protozoa exposure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling of upper airway epithelium for preclinical target validation.
- Operational Value: Offers a transferable protocol applicable to brush cell isolation from nasal and other mucosal tissues.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by linking brush cell variability to institutional microbiota exposure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling isolation of rare epithelial cells for hypothesis-driven target validation and pathway clarification prior to screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of airway targets through viable brush cell isolation and transcriptional analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions suitable for compound screening and functional assay development.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry and RNA sequencing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant upper airway epithelium modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for brush cells across multiple mucosal sites and respiratory disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of cell viability and transcriptional profiles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined enzymatic dissociation steps and buffer preparations.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early functional analysis of rare chemosensory cells.
- Portfolio Impact: Informed go/no-go decisions based on brush cell response variability to microbial metabolites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epithelial dissection and enzymatic tissue processing.
- Dependent on access to dispase, papain, and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardization of epithelial sheet separation for consistent brush cell yields.
- Involves adaptation considerations for applying the protocol to nasal or other mucosal tissues.
- Limited by the rarity of brush cells, necessitating fluorescence microscopy for yield estimation prior to sorting.
