Name: 마우스 기관에서 브러시 셀의 격리 및 정량 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 마우스 기관에서 브러시 셀을 격리하고 정량 평가하는 방법을. 파파인 단백질 분해 효소를 짧게 처리하여 세포 생존율을 유지하고 RNA 시퀀싱을 통한 전사체 분석이 가능합니다.

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브리검 여성 인간 면역학 센터 플로우 코어의 아담 치코인(Adam Chicoine)에게 유동 세포 측정 분류에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), 및 K08 AI132723 (L.G.B), 및 알레르기, 천식 및 면역학의 미국 아카데미 (AAAAI)/ 미국 폐 알레르기 호흡기 질환 상 (N.A.B.), AAAI 재단 교수 개발 상 (L.G.B.), 스티븐과 주디 케이 젊은 혁신상 (N.A.B.), 여성 의사 과학자의 경력 개발을위한 조이셀린 C. 오스틴 기금에 의해 (L.G.B.), 그리고 에 의해 비닉 가족(L.G.B.)의 후원금 기부.

다음 실험을 수행하기 전에 모든 동물 관리 사용 및 프로토콜이 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받고 국립 연구 위원회의 "치료 및 사용 가이드"에 따라 수행되었는지 확인하십시오. 실험실 동물"(8 판, 2011) 및 도착 지침. 아래에 설명된 모든 절차는 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토하고 승인했습니다.
1. 시약의 준비
<ol><li>16 U/mL 디스파스 및 20 μg/mL DNase I. 37°C의 수조에서 용액을 예열하기 전에 디스파스 분말이 완전히 용해되었는지 확인하는 PBS 용액인 디스파제 소화 용액을 준비합니다.</li>
	<li>5% 열불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS)을 덜베코 변형 독수리 배지 (DMEM)에 첨가하여 중지 용액을 만듭니다.</li>
	<li>티로드 I 버퍼 준비: 칼슘이 없는 HEPES-Tyrode의 완충액에 26 U/mL 파파인(48 U/mg 파파인 용액 의 20 μL/mL)과 10 μL/mL L-시스테인을 추가하십시오.</li>
	<li>티로드 II 완충제 준비: 칼슘이 있는 HEPES-Tyrode의 완충제에 2 μL/mL leupeptin(5 mg/mL)을 추가합니다.</li>
	<li>FACS 완충제 준비: 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드가 없는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 사용하여 2 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 보충하고 2% FBS를 첨가합니다.</li>
</ol>2. 마우스 기관의 해부
참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스는ChAT(BAC)-eGFP(B6)이다. Cg-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik /J), 남녀 모두의 생후 3-6 개월. eGFP의 광표백을 줄이기 위해 직접 빛에 조직의 노출을 최소화합니다.
<ol><li>100 mg/kg 펜토바르비탈 안락사 용액으로 마우스를 복강 내 로 주입하거나 IACUC에서 승인한 표준 프로토콜을 사용하여 마우스를 안락사시하십시오.</li>
	<li>상지와 하반신이 확장된 21G 바늘로 수술용 보드에 마우스를 고정합니다. 70% EtOH로 모피를 살포하여 이 지역을 살균합니다.</li>
	<li>직선 집게를 사용하여 복부의 피부와 털을 들어 올리고 해부 가위 (직선 가위, 3cm)로 중앙에 절개를합니다. 가위를 사용하여 피부를 복부에서 망막으로 피하 조직에서 분리하십시오. 피하 조직을 집게로 들고복벽 중앙에 가위로 작은 절개를하십시오.</li>
	<li>V자 형 절개로 복막을 엽니다. 집게를 사용하여 소장을 옆으로 부드럽게 움직이고 복부 대강과 정맥을 찾고 해부 가위로 절개를하여 신속한 퇴출을 허용합니다.</li>
	<li>다이어프램을 찾습니다. 18 G 바늘을 사용하여 흉골 바로 아래 의 횡격막에서 구멍을 만들어 폐를 수축시됩니다. 날카로운 직선 해부 가위를 사용하여 다이어프램을 리브 케이지에서 조심스럽게 분리하여 갈비뼈의 밑부분을 따라 자른다.</li>
	<li>집게를 사용하여 흉골의 노출 된 끝을 들어 올리고 흉골을 흉골의 기지에서 목으로 세로로 자른다. 짧은 직선 가위 (2cm)로 중앙 자궁 경부 절개를하고 하악선의 두 개의 로브를 분리합니다.</li>
	<li>조심스럽게 주변 결합 조직과 시뮤가 미세 한 쌍의 미세 한 부분 높은 정밀 집게로 카리나 위에 놓인 것을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>먼저 후두개 염의 수준에서 근위 쪽 끝을 분리한 다음 기관의 분기 수준에서 말단을 해부하여 기관을 무료로 해부합니다.</li>
	<li>후두개염을 찾아 후두개에서 카리나까지 세로로 기관을 자른다.</li>
</ol>3. 기관 상피 소화
<ol><li>기관을 미리 데운(37°C)의 디스파스 소화 액의 750 μL을 함유하는 1.5 mL 튜브에 놓습니다. 실온에서 40 분 동안 200 rpm에서 셰이커에 인큐베이션하십시오. 직접 적인 빛에 노출을 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 튜브를 덮습니다.</li>
	<li>750 μL의 차가운 DMEM을 5% FBS로 첨가하여 반응을 멈춥시합니다. 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>기관을 페트리 접시(100mm x 15mm)로 옮기고 해부 현미경으로 놓습니다. 상피 측이 위를 향하여 기관을 방향을 지정합니다. 세로 해부 된 기관은 연골 고리에 의해 유지되는 반 원통형 모양을 가지고 있습니다. 상피는 오목한 표면에 있습니다.</li>
	<li>페트리 접시에 직선 집게로 기관의 후두개 부위를 밧줄과 크기 22 일회용 메스를 사용하여, 기관에서 상피를 긁어. 상피 층은 반투명 시트로 분리됩니다.</li>
	<li>메스로 상피를 다듬습니다. 상피 층을 2 mL 튜브로 옮김.</li>
	<li>750 μL의 티로데 I 완충액으로 페트리 접시를 헹구고 상피층을 함유하는 2 mL 튜브로 옮김.</li>
	<li>티로드 I에서 기관 상피 층을 200 rpm에서 셰이커상에서 37°C에서 30분 동안 완충한다. 직접 적인 빛에 노출을 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 튜브를 덮습니다.</li>
	<li>차가운 티로데 II 버퍼 750 μL을 추가합니다. 20-30 s. 18 G 바늘에 부착 된 주사기로 동종 을 10 회 격렬하게 소화 된 조직을 소용돌이.  21 G 게이지 바늘로 전환하고 10-20 번 더 삼중화하십시오.</li>
	<li>100 μm 스트레이너를 통해 세포를 50 mL 원엽 튜브로 필터링합니다. 차가운 FACS 버퍼의 30:1 vol/vol을 추가합니다.</li>
	<li>4 °C에서 10 분 동안 350 x g에서 회전하고 상류를 버립니다. 차가운 FACS 버퍼에 펠릿을 다시 일시 중단하고 서스펜션을 12mm x 75mm(5mL) 폴리스티렌 튜브로 옮김을 옮니다. 4 °C에서 10 분 동안 350 x g에서 다시 회전하고 상류를 버립니다.</li>
	<li>FACS 완충제의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단시다.</li>
	<li>1 μL의 항 마우스 CD16/32 차단 항체를 추가하여 비특이적 결합을 차단하고 얼음에 15분 동안 배양합니다. 씻지 마십시오.</li>
	<li>다음 항체 및 각각의 등각형 대조군을 추가한다: 퍼시픽 블루 항마우스 CD45 또는 래트 IgG2a, k(0.25 μg/106 세포 100 μL 부피) 및 알로피코시아닌(APC) 항마우스 EpCAM 또는 래트 IgG2b, k(100 μL에서 0.5 μg/106 세포) 단일 클론 항체. 직접 빛으로부터 보호된 얼음에 45분 간 배양합니다. 4.5 mL의 차가운 FACS 버퍼를 넣고 4 °C에서 10 분 동안 350 x g에서 혼합하고 돌릴 수 있습니다. FACS 버퍼를 폐기하고 300 μL의 차가운 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>유세포세포측정 선별 직전에 프로피듐 요오드화물(PI)(5 μg/mL)을 추가합니다. 참고: 브러시 셀은 잠재적으로 필터준수를 증가시킬 수 있는 여러 프로세스를 가진 불규칙한 모양을 가지고 있습니다(그림3C). 우리는 30mm에서 70mm 및 100mm 필터를 비교한 결과, 더 큰 기공 필터가 더 나은 수율을 보장한다는 것을 발견했습니다. 또한, 파파인 소화 후 세포 현탁액의 철저한 삼각은 브러시 세포 수율을 현저하게 향상시킨다. 우리는 세포의 미세한 해리를 위한 더 작은 보어 (21 또는 23 G 바늘)에 선행된 초기 삼조를 위한 18G 바늘을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 유세포 분석 게이팅 전략
<ol><li>전방 및 측면 산란 각도로 이물질에서 세포를 식별합니다. 전진 분산 높이와 너비 및 측면 분산 높이 및 너비를 사용하여 doublet를 제외합니다. doublets는 너비 값이 높은 셀입니다.</li>
	<li>단일 셀 내에서 라이브 셀을 PI 음성인 집단으로 식별합니다.</li>
	<li>살아있는 단 하나 세포 내, 이소형 대조군을 기초로 CD45 낮음에서 음성 세포를 확인한다.</li>
	<li>CD45 저/음세포 내에서 eGFP 양성(FITC 채널)인 EpCAM 양성 세포를 식별합니다. 이것은 브러시 셀의 모집단입니다(그림2A).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 40 분 동안 고용량 디스파스 치료의 조합과 짧은 파파인 치료 (30 분)가 기관 소화 및 브러시 세포 격리를위한 최적의 프로토콜을 제공한다는 것을 발견했습니다. 이 조합은 광범위한 소화를 방지하고 대체 프로토콜에 비해 브러시 셀의 가장 높은 수율을 생성합니다.
조혈 세포를 추출하는 폐 소화는 콜라게나아제 IV15와같은 가벼운 소화 효소에 고전적으로 의존해 왔지만 상피 세포의 분리는 더 복잡한 프로토콜을 필요로 한다. 상피 세포의 단세포 현탁액은 서로 및 지하 막에 결합하는 접합부와 세포 자체의 약점 때문에 단단하고 부착하기 때문에 달성하기가 더 어렵습니다. 상피 세포 소화를 위한 대부분의 프로토콜은 2개의 단계를 관련시킵니다 - 첫번째 단계는 지하 막에서 상피의 분리이고 상피 세포를 서로 붙이는 단단한 접합및 desmosomes를 방해하는 후속 단계가 뒤따릅니다 16세 ,</s...

브러쉬 세포는 미각 세포에서 발견되는 쓴 맛 수용체 및 미각 수용체 형질전환 기계의 발현을 특징으로 하는 화학 감각 상피 세포의 클래스에 속한다. 미각 세포와는 달리, 화학 감각 상피 세포는 상피 표면에 흩어져 있으며 비강 상피 1,2,기관내의 브러시 세포에서 독방 화학 감각 세포 (SCC) 및 마이크로 빌러스 세포라고합니다. 3,4,소장 5,6의터프 세포. 쓴 맛 수용체및 쓴 맛의 트랜스덕션 기계를 발현하는 상피 세포는또한 요도 7,8 및 청각 튜브9에서발견된다. 기도 브러쉬 세포는 신경 발생 및 면역 기도 반응에 있는 유일한 기능이 있습니다. 그들은 아세틸 콜린 생산 화학 감각 세포는 정족수 감지 물질10과 같은 쓴 화합물 및 세균 대사 산물로 활성화시 보호 호흡 반사를 불러 일으킨다. 기도 브러쉬 세포는 또한 기도 3에 있는 에어로알러겐 유도제 유도한 타입-2 염증을 통제하는IL-25의 지배적인 기도 상피 근원입니다.
하부 기도 브러쉬 세포의 전체 전사체의 특성및 환경 자극에 대한 이들의 반응은 기관상피의 낮은 수와 큰 기관지(10)를넘어서는 매우 제한된 수에 의해 제한되었다. 장 상피에서 화학 감각 세포의 격리에 사용되는 기술은 아마도 신경 종말10 또는 다른 기관 브러시 세포의 친밀한 접촉 때문에 기관에서 비례적으로 높은 숫자를 산출하지 않았습니다. 부착물 및 단단한 접합 단백질의 조성과 같은 호흡기 점막의 조직 별 인자. 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 높은 수치로 기관 브러시 세포의 성공적인 격리에 대한 최근의 보고는 파파인을 사용한 2시간 배양 또는 18시간 배양과 pronase11,12. 소화 효소를 가진 더 긴 배양은 세포 생존을 감소시키고 소화한 조직13에서세포의 전사 단면도를 바꿀 수 있기 때문에, 이것은 그밖 화학 감각 상피 인구와 비교 분석을 편향할 수 있었습니다.
여기서, 우리는 RNA 시퀀싱 3에 대한 기관 브러시 세포의격리를위한 방법을보고합니다. 고용량 디스파스로 기관을 치료하여 상피를 점막과 분리합니다. 파파인과 상피 시트의 후속 소화는이 구조 세포의 우수한 회복을 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (Polyclonal goat Ig)</td><td>Abcam</td><td>cat# ab5450</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD326 (EpCAM)&nbsp; (깨8.8)</td><td>바이오레전</td>드 <td>고양이#118214</td><td></td></tr><tr><td>APC 쥐 IgG2a, k 동형 대조군</td><td>바이오레전</td>드 <td>고양이#400511</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>바이오레전</td>드 <td>고양이#422801</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG (H+L) 고도 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>cat#A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat IgG</td><td>R& D Systems</td><td>cat#AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td><td>Biolegend</td><td>cat#103126</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td><td>Biolegend</td><td>cat#400627</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) 항체</td><td>Biolegend</td><td>cat#101320</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>cat# 17105041&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마&nbsp;</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Tyrode' 칼슘이 없는 s 완충액(10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM 포도당. 18.2 메가 옴의 물에서 준비하고 0.22 &마이크로를 통해 여과; m 필터</td><td>Boston BioProducts</td><td>cat# PY-912</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s 용액(HEPES 완충) 140mM NaCl, 5mM KCl, 25mM HEPES, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2 및 10mM 포도당. 18.2 메가 옴의 물에서 준비하고 0.22 &마이크로를 통해 여과; M 필터. Boston</td> <td>BioProducts</td><td>cat# BSS-355</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>cat# C7352</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin trifluoroacetate salt</td><td>Sigma</td><td>cat# L2023</td><td></td></tr><tr><td>Papain from papaya latex</td><td>Sigma</td><td>cat# P3125</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>cat# P4170</td><td></td></tr><tr><td>실험 모델: Organisms/Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7902</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 with Airyscan confocal system&nbsp; 에 &nbsp; Zeiss Axio Observer Z1 도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>647465</td><td></td></tr><tr><td>Disposable equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL sterile tubeThomas</td><td>Scientific</td><td>1157C86</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 포이스테렌 라운드 바텀 튜브, 12 mm x 75 mm 스타일</td><td>Falcon</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 폴리 프로필렌 원뿔형 튜브, 30 mm x 115 mm 스타일</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Feather 일회용 메스 no.12</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 100 mm x 15 mm 스타일</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 여과기, 100 &mu; m</td><td>피셔브랜드</td><td>고양이#22363549</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 기관에서 브러시 셀의 격리 및 정량 평가

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

기관 브러쉬 세포는 면역 및 신경계에 기도 루멘에서 신호를 전송하는 태세 해 화학 감각 상피 세포입니다. 그(것)들은 장 점막에 있는 tuft 세포, 기관에 있는 브러쉬 세포, 및 비강 점막에 있는 고독한 화학 감각 및 microvillous 세포를 포함하는 화학 감각 상피 세포의 가족의 일부입니다. 상피 구획에 있는 화학 감각 세포는 중요한 세포 내 마커 및 핵심 전사 서명을 공유합니다, 그러나 또한 중요한 전사 이질성을 표시합니다, 현지 조직 환경의 가능성이 반사. 단세포 현탁액에서 기관 브러쉬 세포의 격리는 이 희소한 상피 세포의 기능을 상세히 정의하는 데 필요하지만, 기관 브러시 세포와 신경 종말 사이의 밀접한 상호 작용으로 인해 이들의 격리가 어려울 수 있습니다. 또는 단단하고 접합부의 기도 특정 조성으로 인해. 여기서, 우리는 마우스 기관 상피로부터 브러시 세포의 분리를 위한 절차를 기술한다. 이 방법은 점막에서 기관 상피의 초기 분리를 기반으로하여 파파인이있는 상피 시트의 후속 짧은 배양을 허용합니다. 이 절차는 실행 가능한 기관 브러시 세포의 유세포 측정 선별 및 기능 분석을위한 신속하고 편리한 솔루션을 제공합니다.

이 절차는 RNA 시퀀싱3에대한 기관 브러시 세포를 격리하기 위해 성공적으로 구현되었습니다. 2단계 프로토콜로 조직의 기관 및 소화를 분리한 후(그림1), PI로 죽은 세포를 배제한 후 형광표지된 CD45 및 EpCAM으로 세포를 수집하고 염색하였다. 전진 및 측면 산란 특성에 따라 이중을 게이팅한 후 브러시 셀을 CD45의 낮음/음수, EpCAM에 대해 양수, eGFP에 대해 양수로 정의했습니다(그림2A). 브러쉬 세포는 유세포측정에 의해 CD45저/부정 세포의 ~0.16-0.42%를 나타내고 기관당 250-600개의 세포를 차지했다(그림2B). 우리는 기관 브러쉬 세포의 우리의 간행된 광대한 면역 조직학 평가에 근거를 둔 ChAT(BAC...

브러쉬 세포는 순진한 마우스 기관에서 발견되는 희귀한 해 화학 감각 상피 세포이다. 그들의 한정된 수 때문에, 기도 면제 및 리모델링에 있는 그들의 기능적인 역할의 ex vivo 평가는 도전적입니다. 우리는 유세포에 의한 기관 브러시 세포의 격리 방법을 설명합니다.

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

우리는 콜린 아세틸 트랜스퍼라제 형광 기자 마우스에서 기관 브러시 세포, 희귀 전문 화학 감각 상피 세포의 격리를위한 절차를 개발했다. 이 방법은 아막코사로부터 의 기관 상피의 초기 분리를 기반으로 하여 파통과 함께 상피 시트의 후속 짧은 잠복이 허용된다. 이를 통해 기관 브러시 세포의 강력한 회복을 가능하게 하며 RNA 시퀀싱에 의한 브러시 세포의 격리 및 전사 분석에 성공적으로 사용되었습니다.소화 효소를 가진 긴 잠복은 세포 생존력을 감소시키고 조직에서 고립된 세포의 전사 단면도를 바꿀 수 있습니다. 여기서 우리는 디스파스로 기관 상피를 분리하고 그 후 실행 가능한 브러시 세포의 높은 수율을 생산하는 짧은 시간 동안 papain로 배양합니다. 우리의 방법은 상부 기도 상피의 연구에 기여할 수 있습니다.동일한 프로토콜은 비강 조직과 같은 다른 점막 부위에서 브러시 세포를 격리하는 데 적용될 수 있다. 우리의 매우 재현 가능한 기술의 데모는 동료 과학자가 기관 브러시 세포를 격리하고 더 조사할 수 있게 합니다. 이 절차를 시작하려면 디스파스 소화 용액을 준비하기 위해 여기에 표시된 최종 농도에서 PBS에 디스파스 및 DNase I를 추가하십시오.섭씨 37도에서 수조에서 용액을 예열하기 전에 디스파스 분말이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 다음으로 DMEM에 5%의 열 비활성화 FBS를 추가하여 정지 솔루션을 준비합니다. 티로데 1완충을 준비하려면 칼슘 없이 HEPES 티로데의 완충에 패아픔과 L-시스테인을 넣으세요.티로데II 버퍼를 준비하려면 밀리리터당 2마이크로리터의 농도로 칼슘 없이 HEPES 티로데의 버퍼에 루페틴을 넣으세요. FACS 버퍼를 준비하려면 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없이 행크의 균형 잡힌 소금 용액을 2밀리머 EDTA와 2%FBS로 보충합니다. 마우스를 안락사한 후, 21 게이지 바늘을 사용하여 상하 사지가 확장된 척추 위치의 수술 판에 고정하십시오.70%에탄올로 모피를 스프레이하여 이 지역을 살균합니다. 직선 집게를 사용하여 복부의 피부와 털을 들어 올리고 해부 가위를 사용하여 중앙에 절개를 합니다. 가위를 사용하여, 맨디불라에 복부에서 피하 조직에서 피부를 분리합니다.피하 조직을 집게로 들고 있는 동안 복벽 중앙에 가위를 작은 절개를 합니다. 그런 다음 V자 절개를 한 복막을 엽니다. 집게를 사용하여 소장을 옆으로 부드럽게 이동합니다.복부 대오르타와 베나 카바를 찾아 급속한 퇴출을 허용하기 위해 해부 가위와 절개를합니다. 다이어프램을 찾습니다. 18 게이지 바늘을 사용하여 흉골 바로 아래에 있는 다이어프램에서 개구부를 만들어 폐를 수축시합니다.날카로운 뾰족한 직선 해부 가위를 사용하여 갈비뼈의 베이스를 따라 잘라 흉곽에서 다이어프램을 조심스럽게 분리합니다. 집게를 사용하여 흉골의 노출된 끝을 들어 올리고 흉골을 흉곽 의 기지에서 목으로 세로로 자른다. 짧은 직선 가위를 사용하여 중앙 자궁 경부 절개를 하고 복종선의 두 엽을 분리하십시오.그 후, 미세 한 포인트 고정밀 집게를 사용하여 주변 결합 조직과 카리나 위에 있는 흉선을 조심스럽게 제거하십시오. 먼저 후두개증의 수준에서 근위 쪽 끝을 분리한 다음 기관지의 양분의 수준에서 해부함으로써 기관을 무료로 해부한다. 후두를 찾아 간구에서 카리나까지 세로로 기관을 잘라냅니다.우선, 기관지는 섭씨 37도까지 예열된 디스파스 소화용액 750마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 직접 조명에 대한 노출을 줄이고 200 RPM의 셰이커와 실온에서 40 분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 5%의 FBS로 DMEM의 750 마이크로리터를 추가하여 반응을 멈추고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.기관을 페트리 요리로 옮는다. 상피 측이 위를 향하여 기관체를 방향을 지정합니다. 세로적으로 해부된 기관체는 간질 고리에 의해 유지되는 반 원통형 모양을 가지고 있습니다.상피는 오목한 표면에 있습니다. 직선 집게를 사용하여, 페트리 접시에 기관의 epiglottis 영역을 밧줄과 기관 떨어져 상피를 긁어 크기 22 처리 메스를 사용합니다. 상피 층은 반투명 시트로 분리됩니다.메스를 사용하여 상피를 다진 후 상피 층을 2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 페트리 접시에 750 마이크로리터의 타이로데 1편을 버퍼링하고 상피층을 포함하는 튜브로 옮기다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 직접 조명에 대한 노출을 줄이고 30 분 동안 200 RPM에서 셰이커에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.그런 다음 콜드 티로드 II 버퍼 750 마이크로리터를 추가합니다. 소화된 조직을 20~30초 동안 힘차게 소용돌이시다. 18 게이지 바늘에 부착 된 주사기를 사용하여, 호모게이지네이트를 10 번 삼중화.이 후, 21 게이지 바늘로 전환하고 10 ~ 20 더 세리세게. 100 마이크로미터 여과기를 통해 50 밀리리터 원내 튜브로 세포를 필터링합니다. 30대 1의 체적 비율로 콜드 FACS 버퍼를 추가합니다.원심분리기는 350배, 섭씨 4도에서 10분간. 상체를 버리고 차가운 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다. 이 서스펜션을 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브로 옮기십시오.원심분리기는 다시 350배, 섭씨 4도에서 10분간 다시 원심분리기를 사용한다. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 다음으로, 항체를 차단하는 항마우스 CD1632의 마이크로리터 를 추가하여 비특이적 결합을 차단하고 15분 동안 얼음에 배양합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각각의 등류형 컨트롤에 항체를 추가합니다. 직접 조명으로부터 보호하면서 45분 동안 얼음에 배양합니다. 그 후, 차가운 FACS 버퍼의 4.5 밀리리터를 추가하고 혼합합니다.원심분리기는 350배, 섭씨 4도. 상체를 버리고 300 마이크로리터의 콜드 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 놓습니다. 유동 세포 계수 정렬 직전에 프로피듐 요오드를 추가합니다.이 연구에서는, ChAT eGFP 아세틸콜린 형광 기자 마우스로부터의 기관 브러시 세포는 RNA 시퀀싱을 위해 성공적으로 분리된다. 세포는 전방 및 측면 산란 각도로 이물질에서 식별됩니다. 더블은 전방 산란 높이와 너비 및 측면 산란 높이 및 너비를 사용하여 제외됩니다.두 배는 너비 값이 높은 셀입니다. 단일 세포 내에서, 살아있는 세포는 프로디듐 요오드 음성인 집단으로 확인된다. 살아있는 단일 세포 내에서, CD45는 상류형 대조군을 기반으로 낮은 음수 세포로 확인된다.CD45 낮은 음수 세포 내에서 FITC 채널에서 eGFP 양성인 EpCAM 양성 세포는 브러시 셀의 집단이다. 브러쉬 세포 수는 미생물 대사 산물과 원생동물에 노출에 의해 변경되고 그러므로 기관 microbiota의 가변성을 반영합니다. 따라서, 우리는 유동 세포 분류에 의해 고립 된 브러시 세포의 예상 수를 측정하기 위해 형광 현미경 검사법에 의해 브러시 세포의 수를 추정하는 것이 좋습니다.격리된 브러시 셀의 수율을 결정할 때 기관지의 상피 층을 올바르게 분리해야 합니다. 상기 분리된 기관 브러시 세포는 RNA 염기서열 분석, 세포 배양 및 기능분석과 같은 광범위한 분석에서 사용될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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마우스 기관에서 브러시 셀의 격리 및 정량 평가

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