Name: 인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 학습하세요 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 방법을 통해 전사와 RNA 캡핑의 기능적 결합을 연구하는 기술입니다. 자성 비드를 활용한 이 실험 시스템은 분자생물학 연구에 활용됩니다.

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포유류 캡핑 효소 cDNA를 제공해 주신 S. Shuman에게 감사드립니다. 이 작품은 그레이터 캔자스 시티 지역 사회 재단에서 헬렌 넬슨 의학 연구 기금에서 의학 연구를위한 Stowers 연구소에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.  이 원고의 기본 원본 데이터는 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 Stowers 원본 데이터 저장소에서 액세스할 수 있습니다.

1. 인공 신장 복합체 및 폴 II 걷기의 조립
<ol><li>자기 비드상에 3' 비오틴 분자를 함유하는 비템플릿 DNA 올리고의 1nmol을 고정화. 참고: 다음 단계는 향후 실험을 준비하기 위해 미리 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 올리고 서열은 표1에 제공됩니다. RNA 올리고는 5'-삼인산염 수정과 합성됩니다.<ol>
<li>200 μL의 자기 비드(10 mg/mL)를 저단백 결합 1.5 mL 튜브에 넣고 2분 동안 자기 랙에 놓습니다.</li>
		<li>튜브가 마그네틱 랙에 있는 동안 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 제거합니다. 구슬을 세척하려면 랙에서 튜브를 제거하고 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl을 추가하고 튜브를 랙에 반환하고 2 분 후에 세척 용액을 제거하십시오.</li>
		<li>동일한 버퍼의 200 μL을 사용하여 2회 더 세서합니다.</li>
		<li>10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 버퍼의 400 μL에서 자기 비드를 다시 일시 중단하십시오. 이어서H2O의 380 μL 및 10 μM의 20 μL과 혼합하여 비템플릿 생체티니화 DNA 올리고. 튜브를 영양분 위에 놓고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>5 mM Tris-HCl pH 7.5의 200 μL로 3 회 고정화 된 논 템플릿 DNA 올리고를 세척하십시오. 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 그리고 200 μL의 200 μL로 200 μL의 HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 글리세롤, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민을 3회.</li>
		<li>BSA로 비드차단을 완료하기 위해 튜브를 4°C에서 밤새 둡니다.</li>
		<li>다음날, 튜브를 마그네틱 랙에 놓고, 액체를 제거하고 폐기하고, 200 μL의 HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 글리세롤, 100 mM KCl, 1mM EDTA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민을 제거하고 새로운 튜브로 옮김을 재중단시켰다. 이 DNA 템플릿의 경우, 최종 농도는 약 5 μM이다. 참고: 인큐베이션 시간 및 올리고 농도는 각 생체이식 DNA 올리고에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이 템플릿은 200개의 반응을 충분히 제공하고, 4°C에서 저장될 때 적어도 6개월 동안 지속되어야 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>어닐레 RNA 및 DNA 템플릿 가닥 올리고뉴클레오티드 올리고는 2:1 몰 비(각각 20 및 10 pmol)로 DNA:RNA 이중을 얻었다.
	<ol>
<li>표2에 설명된 바와 같이 10 μL 어닐링 믹스를 설정합니다. 참고: 어닐링 믹스 10 μL은 10개의 반응에 충분합니다. 더 많은 assays가 수행될 경우 어닐링 믹스는 필요에 따라 확장될 수 있습니다.</li>
		<li>다음 프로그램을 사용하여 열 사이클러에서 어닐링 반응을 수행합니다: 45°C에서 5분, 12사이클각각 2분, 43°C에서 시작하여 사이클당 온도 2°C를 감소시다. 4 °C에서 유휴 상태. 참고: 이것은 유연한 시간입니다. 어닐링은 ~ 30 분 이내에 완료되지만 더 긴 기간 동안 4 °C에서 방치 할 수 있습니다. 실험실에서, 어닐링 혼합물은 반응 효율의 어떤 감소를 관찰하지 않고 최대 4 시간 앉아 남아있다.</li>
		<li>RNA를 템플릿 가닥 DNA로 어닐링하는 동안 프로토콜의 이후 단계에 대한 버퍼를 준비합니다. 각 버퍼에 대한 단일 반응을 준비하는 데 필요한 성분은 표 2에서 8에나열되어 있습니다. 세척의 경우 [Y(X+1) + 1]의 비율로 레시피를 확장하고 다른 모든 버퍼의 경우 (X+1)를 배율로 조정합니다. X = 준비될 반응의 수; Y = 필요한 세척 단계 수(최소 3). 참고: 실험 당일 모든 버퍼를 새로 준비합니다. PVA가 버퍼에 추가된 후에는 튜브를 얼음 위에 두지 마십시오. 사용하기 직전에 폴리 II 또는 뉴클레오티드를 완충액에 추가하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA:RNA 하이브리드에 정제된 RNA 폴리머라제 II를 로드합니다.
	<ol>
<li>DNA:RNA 이중13 μL의 폴 II 완충액을 혼합한다(표 3에서). </li>
		<li>1.3.1 단계에서 혼합물에 정제 된 RNA Pol II (1 μL)의 ~ 0.02 단위를 추가하고 거품을 도입하지 않고 부드럽게 위아래로 파이펫팅하고 파이펫 팁으로 저어서 섞습니다. 30 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 참고: 여기에서 주어진 볼륨은 단일 반응에 대한 것입니다. 실험에서 반응 의 수에 대해 필요에 따라 확장할 수 있습니다. 기재된바와 같이 쥐간으로부터 정제된 RNA Pol II(10)는 본 예에서 사용된다; 그러나, 배양된 포유류 세포 또는 효모를 포함하는 다른 공급원으로부터정제된 RNA Pol II는 또한 3, 4,5,11,12,13을사용할 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>생체이식 비템플릿 DNA를 첨가하여 신장 복합체를 완료한다.
	<ol>
<li>5 pmol (1 μL)의 고정화 된 논 템플릿 DNA 올리고를 14 μL의 비 템플릿 DNA 버퍼 (표4에서)에 추가하고, 단계 1.3.2에서 튜브에 추가하고, 37 °C에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>샘플을 마그네틱 랙에 2분 간 세척하고 30 μL의 세척 버퍼(표 7에서)를 사용하여 통합되지 않은 Pol II 및 올리고를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>방사성 표지된 RNA 23mers를 포함하는 신장 복합체를 생성합니다.
	<ol>
<li>30°C에서 모든 추가 배양을 수행합니다. 펄스 버퍼의 23 μL에 [α-32 P] UTP (3,000 Ci/mmol)의 1 μL 1μL 및 10 μCi (1 μL)를 추가하고 세척 된 자기 구슬을 다시 일시 중단하십시오. 주의 사항: 방사성 물질은 유해합니다. 적절한 보호 장비를 착용하고 방사성 물질의 안전한 사용 및 폐기를 위해 모든 실험실 지침을 따르십시오. 참고: 서부 블롯 실험과 같이 방사성 라벨이 부착된 RNA가 필요하지 않은 경우 방사성 표지형 UTP를 15 μM UTP로 교체하십시오.</li>
		<li>방사성 표지된 23mers의 합성을 허용하기 위하여 10 분 동안 반응을 배양하십시오.</li>
		<li>1.5 μL의 ATP와 100 μM UTP 믹스를 함유한 용액을 3.5 μL의 체이스 버퍼에 추가하고, 미리 조립된 연신 복합체가 함유된 튜브에 추가하고, 5분 동안 배양하여 모든 초기 전사체를 23mers로 추적합니다.</li>
		<li>샘플을 마그네틱 랙에 2분 동안 놓고 상한제를 제거하고 30 μL의 세척 버퍼로 한 번 세척하여 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거하고 30 μL의 세척 버퍼로 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>단백질타아제 K 및 글리코겐(표 9)과94 μL의 스톱 믹스를 첨가하여 반응을 종결시키거나 섹션 1.6으로 진행하여 더 긴 전사체 또는 섹션 2를 사용하여 연신 복합체를 생성하여 캡핑 아술을 수행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>(선택 사항) 23, 25, 29 뉴클레오티드 전사체를 만들기 위해 Pol II를 걷십시오.
	<ol>
<li>1.2.1 단계부터 1.5.4 단계까지설명된 절차를 따라 방사성 라벨이 부착된 23mers를 포함하는 신장 복합체를 준비한다. 4배 확장하여 4회 반응에 충분한 복합체인 세척된 신장 복합체 120μL을 생성합니다.</li>
		<li>라벨 3 새로운 튜브 "23mer", "25mer"와 "29mer". 세척된 신장 복합체 30 μL을 "23mer" 튜브로 옮기고 94 μL의 스톱 믹스를 단백질성 K 및 글리코겐과 첨가합니다.</li>
		<li>나머지 90 μL의 세척된 연신 복합체를 포함하는 튜브를 자기 랙에 2분 동안 놓고, 상류를 제거하고, 1.5 mM ATP 및 1.5 mM CTP 각각 1.2 μL로 보충된 BTB의 90 μL에서 구슬을 다시 놓습니다. 30 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>1.5.4단계에서 설명한 바와 같이 90 μL의 세척 완충액으로 한 번 세척하고 90 μL의 세척 버퍼로 재중단한 후, 30 μL의 연신 복합체를 "25mer" 튜브로 옮기고 94 μL의 스톱 믹스를 단백질Ase K 및 글리코겐과 첨가합니다.</li>
		<li>남은 60 μL의 연신 복합체를 포함하는 튜브를 자기 랙에 2분 동안 놓고, 상류를 제거하고, 1.5 mM ATP 및 1.5 mM CTP 각각 0.8 μL로 보충된 BTB의 60 μL에서 구슬을 다시 놓습니다.</li>
		<li>30°C에서 10분 동안 배양하고, 섹션 1.5.5에서와 같이 60 μL의 세척 버퍼로 한 번 세척하고, 60 μL의 세척 버퍼로 다시 중단합니다.</li>
		<li>2x 샘플에서 "29mer" 튜브로 30 μL을 옮기고 94 μL의 스톱 믹스를 단백질Ase K 및 글리코겐과 첨가하거나 섹션 2로 진행하여 캡핑 검술을 수행합니다.</li>
		<li>RNA 정제 및 분석을 진행합니다(섹션 3).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 인공 신장 복합체를 사용하여 분석 코transcriptional 캡핑
<ol><li>1.2.1 단계부터 1.5.5 13배까지 의 절차를 확장하여 23mers를 포함하는 세척된 신장 복합체를 생성한다. 이것은 12 개의 반응 + 1 개의 추가 반응에 충분합니다.</li>
	<li>
폴 II CTD 인산화
	<ol>
<li>세척된 신장 복합체를 함유한 튜브를 자기 랙에 2분 동안 놓고, 상급렌즈를 제거하고, 1.5 mM ATP의 13 μL로 보충된 BTB의 377 μL에 구슬을 다시 놓습니다.</li>
		<li>각각 +H와 -H로 표시된 두 개의 새 튜브를 준비합니다. +H라고 표시된 튜브에 ~ 300 ng/μL TFIIH의 3 μL을 추가하고,H 표지된 튜브에 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% 글리세롤, 100 mM KCl, 1 mMEDA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민의 9 μL을 추가한다. 참고: 우리는 일반적으로 쥐 간에서 정제 된 TFIIH를 사용하지만, 시판 되는 재조합 Cdk7 / Cyclin H / MAT1 (CAK, TFIIH의 키나아제 모듈)의 ~ 0.6 μg / 반응을 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.</li>
		<li>세척된 신장 복합체의 87 μL을 단계 2.2.1로부터 +H 및 270 μL의 세척된 연신 복합체의 튜브에 -H. 30°C에서 10분 인큐베이트하여 첨가한다.</li>
		<li>샘플을 마그네틱 랙에 2분 동안 놓습니다. 과도한 뉴클레오티드와 언바운드 단백질을 제거하려면 각각 90 μL 또는 270 μL의 세척 버퍼로 +H 및 -H 반응으로 신장 복합체를 세척하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 캡핑
	<ol>
<li>캡핑 믹스의 87 μL에서 +H로 표시된 튜브의 신장 복합체를 재중단(BTB 50μM GTP(표 10)으로 보충하였다. 캡핑 믹스의 261 μL에서 -H로 표기된 튜브내의 연신공 복합체를 재중단시켰다.</li>
		<li>5 ng CE +H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE로 표시된 4 개의 새로운 튜브를 준비합니다. 캡핑 효소(CE)를 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 글리세롤 20%, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL 소 혈청 알부민으로 희석하여 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL, 15 ng CE/μL, 또는 45 ng CE/μL 및 45 ng CE/μL을 함유하는 용액을 준비하기 위해 적절한 튜브의 45 ng CE/μL 및 디스펜스 3L을 각각 의약 외7.</li>
		<li>각각 94 μL의 스톱 버퍼(2.1.1)를 추가하여 12개의 새로운 튜브를 준비합니다.</li>
		<li>TFIIH로 처리된 신장 복합체의 87 μL을 추가하거나 캡핑 효소를 함유하는 표지된 튜브에 첨가하여 각 캡핑 반응을 시작합니다. 열 블록에서 30 °C에서 배양합니다.</li>
		<li>1, 2, 또는 4분 후, 각 반응 혼합물의 30 μL을 94 μL의 스톱 버퍼를 함유하는 튜브로 이송하여 반응을 멈춥니다. 섹션 3에 기재된 바와 같이 반응 제품을 정화하고 분석한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. RNA 정화 및 분석
<ol><li>정제 RNA
	<ol>
<li>실온에서 20 분 동안 스톱 버퍼로 반응 제품을 인큐베이션합니다. 참고: 일시 중지 지점. 이 완충제의 샘플은 RNA의 손실 또는 분해 없이 최대 4시간 동안 유지되었다.</li>
		<li>페놀 124 μL:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)으로 한 번 추출하고 클로로폼:이소아밀 알코올(24:1)으로 추출합니다. 주의 사항: 페놀은 매우 독성이 있으며 피부에 빠르게 흡수됩니다. 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 참고: 추출 중에 RNA의 회수를 최대화하려면 수성 및 유기 상 사이의 안정적인 장벽을 형성하는 고밀도 젤을 포함하는 시판 되는 튜브를 사용하십시오. 토론 및 재료 표를참조하십시오.</li>
		<li>수성상(상부층)을 3M 아세테이트 pH 5.2의 12.4 μL을 함유하는 새로운 튜브로 옮니다.</li>
	</ol></li>
	<li>에탄올 강수량
	<ol>
<li>100% 에탄올 350 μL을 넣고 반전하여 철저히 섞으세요.</li>
		<li>드라이 아이스에 적어도 10 분 동안 배양하십시오. 참고: 일시 중지 지점. 편의를 위해 여기에서 멈추고 다음 날 절차를 완료 할 수 있습니다. 그러나, 3.3 단계로 직접 진행하고 같은 날에 겔을 실행할 수 있다. RNA는 추가 처리 전에 며칠 동안 -80°C에서 보관될 수 있지만 더 긴 시간 동안 방치하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>젤 전기 동에 대한 RNA 샘플 준비
	<ol>
<li>샘플을 해동하고, 2-3회 반전하여 혼합하고, 탁상 원심분리기에서 21,000 x g, 4°C에서 15분 동안 원심분리기를 섞습니다. 한편, 변성 겔 믹스를 설정 (섹션 3.4.1).</li>
		<li>펠릿을 방해하지 않고 시료에서 에탄올을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>70% 에탄올 500 μL을 넣고 튜브를 몇 번 뒤집어 펠릿을 씻은 다음 실온 또는 4 °C에서 5 분 동안 21,000 x g에서 다시 원심 분리합니다.</li>
		<li>가능한 한 많은 에탄올을 제거하고 테이블 상단 원심 분리기에서 튜브의 빠른 스핀 (5-10 초)을하십시오. 그런 다음 젤 로딩 팁으로 마지막 남은 에탄올 부피를 제거하십시오.</li>
		<li>실온에서 3분 간 공기 건조 펠릿.</li>
		<li>각 펠릿의 상부에 H2O의 4 μL을 첨가하여 RNA를 용해시켰다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>2x RNA 염료 4 μL을 혼합물에 넣고(재료 표참조)를 넣고 각 튜브를 몇 초 동안 소용돌이치며 RNA를 완전히 다시 중단시냅니다. 참고: 우레아 대신 포르아미드를 함유한 RNA 염료는 후자가 저온에서 침전되기 때문에 권장됩니다.</li>
		<li>튜브를 빠르게 회전한 다음 70°C에서 열 블록에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>
젤에 적재할 준비가 될 때까지 드라이 아이스에 튜브를 보관하십시오. 참고: RNA를 드라이 아이스에 보관하면 젤이 중합되는 동안 다른 실험에서 유연하게 작업할 수 있습니다. 해동 후 샘플을 다시 가열할 필요가 없습니다. 그러나, RNA는 젤이 달릴 준비가 되면 가열 후에 직접 적재될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>우레아-페이지 젤 준비
	<ol>
<li>40 mL 젤 믹스의 경우, 50 mL 원추형 튜브에 결합: 요소 16.7 g, 15 mL의 40% 비스:아크릴아미드 용액 (19:1 비율), 4 mL 의 10 x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M 나트륨 붕산염, 20 mM EDTA), 그리고 8 mL의 H2O. 이 볼륨은 1.0mm 스페이서가있는 하나의 표준 크기 젤 (높이 18cm x 너비 16cm)에 충분합니다. 주의 사항: 아크릴아미드는 매우 독성이 있습니다. 용액에 있을 때 흡입 위험이 없지만 취급 하는 동안 항상 실험실 코트, 장갑 및 안전 안경을 착용 하십시오. 참고: 이 혼합물은 변성 15% 폴리아크릴아미드 겔을 주조하기 위한 것으로, 이는 RNA를 15-50 nt 사이에서 쉽게 해결한다.</li>
		<li>우레아가 완전히 녹을 때까지 견과류에 젤 믹스가 함유된 닫힌 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>유리 판, 1mm 스페이서 및 15 웰 빗으로 젤 캐스팅 스테이션을 설정합니다.</li>
		<li>빠르게 작용하여, 40 μL의 TEMED와 10% 황황산 암모늄 용액의 400 μL을 젤 용액에 넣고 잘 섞습니다. 25 mL 파이펫을 사용하여 플레이트 사이에 젤 용액을 붓고 빗을 삽입하고 겔이 적어도 2 시간 동안 중합되도록하십시오. 참고: 젤을 사용하기 전에 2 시간 이상 부으면 습한 종이 타월로 덮고 (빗을 제자리에 두면) 건조하지 않도록 플라스틱 랩으로 감쌉니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데내포질 겔 RNA 전기동동
	<ol>
<li>중합 후, 겔을 러닝 탱크로 옮기고 15-30 분 동안 1x TBE에서 20 mA에서 미리 실행하십시오.</li>
		<li>한편, 샘플을 해동 (냉동 하는 경우), 소용돌이, 그리고 2,000 x g, 4 °C에서 4 분 동안 그들을 회전.</li>
		<li>준비가 되면 전원 공급 장치를 끄고 주사기를 사용하여 1x TBE로 각 우물을 조심스럽게 헹구십시오.</li>
		<li>젤 로딩 팁을 사용하여 샘플을 젤에 로드합니다.</li>
		<li>약 2시간 동안 또는 하부 염료(자일렌 시안올 FF)가 겔의 바닥에 도달할 때까지 일정한 20-30 mA에서 겔을 실행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>젤을 제거하고 흡수성 종이에 놓고 플라스틱 랩으로 감쌉니까?</li>
	<li>방사성 표지된 젤을 인광체에 노출시소.</li>
	<li>형광체 이미지를 사용하여 형광체를 스캔하고 이미지를 분석합니다.</li>
</ol>

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<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+transcription%3A+backtracked+RNA+polymerase+II+at+3.4+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution.</a> Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li>
<li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li>
<li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li>
<li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li>
<li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li>
<li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li>
<li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

RNA 처리 및 전사체 신장 자체의 조절과 같은 Pol II 신장 복합체에 결합된 사건을 해부하고자 하는 연구는 고도로 정제된 효소 시스템을 사용하여 크게 촉진될 수 있다. 이러한 효소 시스템을 설정하는 것은 어려울 수 있습니다. Pol II에 의한 프로모터 의존성 전사는 적어도 5개의 일반적인 전사 인자를 요구한다. 이러한 요인을 준비하고 비축하는 데는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 따라서, 이 과정에서의 속도 제한 단계는 종종 단순히 시험관에서 기저 전사를 재구성하는 데 필요한 전사 인자의 간부를 준비하는 것이다.
이 기사에서는, 우리는 정제 된 Pol II 및 합성 DNA 및RNA 올리고 뉴클레오티드만을 사용하여 인공 전사 신장 복합체 2,3을 생성하기 위한 이전에 개발된 방법의 적응을 설명합니다. 생성된 신장 복합체는 전사적으로 활성되며 Pol II 전사 및 RNA 캡핑...

진핵 메신저 RNA (mRNA) 합성은 RNA 폴리머라제 II에 의해 처리되지 않은 전구체 RNA의 합성및 성숙한 mRNA를 산출하기 위하여 전구체 RNA의 처리를 관련시키는 정교한 생화확적인 프로세스입니다. 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화의 RNA 처리 단계는 대체로 공동 전사적으로 수행된다. Pol II 신장 복합체는 많은 RNA 처리 효소의 활동을 모집하고 조율하는 발판역할을 합니다. 따라서, 성숙한 진핵 mRNAs가 생성되는 방법의 우리의 궁극적인 이해는 신장 복합체에 근본적인 모집을 근본적인 생화학 기계장치의 해부를 허용하는 실험 적인 시스템의 발달에 크게 의지할 것입니다 공동 전사 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화를 담당하는 효소의 조절.
당연히, 이러한 실험 시스템의 개발은 어려웠다. 주요 장애는 단순히 시험관내에서 Pol II에 의한 기저 전사를 재구성하는 것이 5가지 일반 전사 개시 인자(TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, 및 TFIIH)의 최소 세트를 필요로 하는 Pol II 전사 자체의 현저한 복잡성이었습니다. 1. 또한, 시험관 내에서 규제 된 Pol II 전사의 모든 종류를 재구성하려면 전사 인자 및 공동 조절기의 더 큰 세트가 필요합니다. 따라서, 주요 목표는 Pol II 전사 및 RNA 처리의 기능적 커플링의 조사에 적합한 활성 Pol II 신장 복합체의 재구성을 허용하는 간단한 실험 시스템을 개발하는 것이었습니다.
활성 Pol II 신장 복합체를 재구성하는 이러한 간단한 방법 중 하나는 연공 폴 II의 구조적 및 생화학적 연구에 유용하며, 최근에는공동 전사 RNA 처리 2, 3을 조사하는 데 유용하게 사용되었습니다. ,4,5. 이 문서에서는, 우리는 정제된 Pol II 및 합성 전사 기포로부터 제조된 Pol II 신장 복합체가 어떻게 초기 Pol II 전사의 공동 전사 캡핑의 근본적인 메커니즘을 조사하기 위해 효과적으로 사용될 수 있는지를 보여준다.
캡핑은 초기 Pol II 전사체의 5'-트리포스페이트 말단에 5'-구아노신 "캡"을 공동 첨가하는 것을 말합니다. 캡은 mRNA 성숙, 전송, 번역 및 기타 프로세스6,7의후속 단계에 중요합니다. 캡은 캡핑 효소로 지칭되는 효소에 의해 Pol II 전사체에 공동 전사적으로 첨가된다. 포유류 세포에서, 캡핑 효소의 RNA 5'-트리포스파타제 및 구아릴 전이 효소 활성을 담당하는 활성 부위는 단일 폴리펩티드8내에 함유되어 있다. 캡핑 효소는 그 힙테이프타이드 반복의 Ser5상에 포진된 Pol II 체체 및 Rpb1 카르복시 말단 도메인(CTD)에 아직 정의된 표면과의 상호작용을통해 Pol II 신장 복합체로 모집된다 5. 신장 복합체에서, 캡핑 효소는 초기 전사체가 적어도 18개의 뉴클레오티드의 길이에 도달하고 중합효소 RNA 출구 채널로부터 나오면 5'-구아노신 캡의 첨가를 촉매한다. 캡핑 반응의 첫 번째 단계에서, 트리포스파아제는 RNA 5'-트리포스페이트5'-이인산염을 산출하기 위해 가수분해한다. 제 2 단계에서, GTP는 GMP 캡핑 효소 중간체를 형성하는 guanylyl 트랜스페라제에 의해 GMP로 가수분해된다. 마지막으로, guanylyl 트랜스퍼라제는 캡을 생성하기 위해 초기 전사체의 5'-디포스페이트 말단으로 GMP를 전송한다.
캡핑 반응의 주목할 만한 특징은 공동 전사 캡핑(즉, 기능성 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 캡핑)이 자유RNA 5,9의캡핑보다 훨씬 더 효율적이라는 것이다. 따라서, 현장에서 중요한 질문은 폴 II 신장 복합체와의 캡핑 효소의 상호 작용을 통해 캡핑의 극적인 활성화가 어떻게 이루어지는가하는 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 정제된 RNA 폴리머라제 II 및 인공 전사 기포만을 사용하여 활성 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이러한 방법은 정의된 길이 및 서열의 전사체를 가진 RNA 중합효소 II 신장 복합체의 생성을 허용한다. 최근 연구에서, 우리는 RNA 캡핑 5의 기계장치의 양상을 조사하기 위한 모형으로 이 정의된 RNA중합효소 II 신장 복합체를 이용했습니다. 특히, 우리는 (i) 이들 신장 복합체와 관련된 RNA의 캡핑이 자유 RNA의 캡핑보다 100배 이상 효율적이었으며(ii) Pol II CTD의 TFIIH 의존성 인산화에 의해 자극되었다는 것을 보여주었다. 여기서 설명된 접근법은 원칙적으로 Pol II 신장 복합체에 연결된 다른 공동 전사 RNA 처리 반응을 연구하기 위한 기판을 생성하도록 적응될 수 있었다.
이 프로토콜의 섹션 1에서, 인공 신장 복합체는 템플릿 가닥 DNA의 약 9 개의 뉴클레오티드에 3'끝에서 상보적인 RNA 올리고뉴클레오티드에 합성 템플릿 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성됩니다. Pol II는 DNA:RNA 이중에 적재됩니다. 신장 복합체는 그 후 3'-끝에서 비오틴으로 표지되는 부분적으로 상보적이고 비템플릿가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 완성된다(도1 및 도 2A). RNA 올리고뉴클레오티드는 이러한 신장 복합체에서 Pol II에 의해 확장되어 방사성 표지된 뉴클레오티드의 적절한 조합을 추가하면 정의된 길이 및 서열의 방사성 표지된 전사체를 만듭니다. 또한, 무통합 뉴클레오티드를 제거하고 뉴클레오티드의 상이한 조합을 추가로 첨가하기 위해 세차의 조합을 사용하여, 하나는 DNA 템플릿을 따라 상이한 위치에 Pol II를 "걸을"수 있고 정의된 길이의 RNA를 합성할 수 있다. RNA는 그 때 정제되고 요소-PAGE 젤을 이변하는 전기 영동을 행한다. 프로토콜의 섹션 2에서, 인공 신장 복합체는 공동 전사 RNA 캡핑을 분석하는 데 사용됩니다. 제시된 실시예는 공동 전사 RNA 캡핑에 대한 Pol II CTD의 TFIIH 의존성 인산화의 효과를 측정한다. 본 실험에서, 우리는 효소 농도(반응당 5, 15 및 45 ng)와 시간(1, 2 및 4분)의 함수로서 공동 전사 캡핑의 정도를 측정하였다.

<table><tbody><tr><td>[&alpha;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG007H001MC</td><td>방사선 표지용 RNA</td></tr><tr><td>2x RNA 로딩 염료</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>적극 권장합니다. 겔 로딩 중 RNA 준비</td></tr><tr><td>40% Bis : 아크릴 아미드 용액</td><td>Biorad</td><td>1610144</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (20 mg / mL)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Cdk7 / Cyclin H / MAT1 (CAK complex) 단백질, 활성, 10 &micro; g</td><td>Millipore Sigma</td><td>14-476</td> Pol II CTD DNA 올리고뉴클레오티드 IDT <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 를 인산화하는 데 사용됩니다. <td>순도 사양은 표 8을 참조하십시오</td></tr>. <tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>65001</td><td>우리는 또한 Dynabeads M-280 streptavidin을 문제 없이 사용했지만, MyOne Streptavidin 비드를 선호합니다. 왜냐하면 그들은 더 천천히 침전되기 때문입니다</td></tr><tr><td>. GlycoBlue Coprecipitant (15&thinsp; mg/mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>적극 권장합니다. 염료, 핵산 펠릿 블루, 반응을 훨씬 쉽게 처리,</td></tr><tr><td>Hoefer SE600 표준 이중 냉각 수직 전기 영동 시스템, 1mm 스페이서 및 15 웰 빗</td><td>Hoefer</td><td>SE600-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>MaXtract 고밀도 튜브 (1.5 mL)</td> <td>Qiagen</td><td>129046</td><td>적극 권장합니다. 수성 상과 유기 상 사이에 안정적인 장벽을 형성하는 고밀도 겔을 함유합니다. 추출 중 RNA 수율 향상</td></tr><tr><td>Proteinase K 용액 (20&thinsp; mg/mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNA 올리고뉴클레오티드</td><td>Trilink</td><td></td><td>자세한 내용은 표 8 참조</td></tr><tr><td>효모 무기 피로포스파타아제(100 units/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>NEBM2403S</td><td>캡핑 반응 중에만 필요</td></tr></tbody></table>

인공 rna 폴리머라제 ii 연신복합체 해부 공동 전사 rna 처리 이벤트

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

진핵 mRNA 합성은 성숙한 mRNA를 형성하기 위하여 전구체 RNA의 다중 소단위 효소 RNA 폴리머라제 II 및 공동 전사 상한 및 접합에 의해 전구체 RNA내로 DNA 템플릿의 전사를 요구하는 복잡한 생화확적인 프로세스이다. mRNA 합성 동안, RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 성숙한 mRNA를 생성하는 캡핑, 접합 및 3'-처리 효소뿐만 아니라 촉매 활성을 조절하는 전사 인자의 큰 집합에 의해 조절을 위한 표적이 된다. mRNA 합성의 본질적인 복잡성 때문에, 그것의 각종 공동 전사 단계의 격리 그리고 조사를 가능하게 하는 간단한 실험 시스템은 중대한 유용성이 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 공동 전사 RNA 상한을 조사하기에 적합한 1개의 간단한 실험 시스템을 기술합니다. 이 시스템은 정제 된 폴리머 라제 및 인공 전사 기포에서 조립 된 정의 된 RNA 폴리머 라제 II 신장 복합체에 의존합니다. 생체 생리DNA를 통해 고정화될 때, 이 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 연신복합체가 캡핑 효소를 모집하고 조절하는 공동 전사 RNA 캡핑 및 메커니즘을 해부하기 위한 용이한 방법론을 제공합니다. 공동 전사 RNA 캡핑. 우리는 이 시스템이 RNA 중합효소 II 신장 복합체에 결합된 mRNA 성숙의 그밖 단계에서 역할을 가진 단백질 또는 단백질 복합체의 모집 및/또는 집합을 공부하기 위해 적응될 수 있었다는 것을 예상합니다.

도 2 및 도 3은 상이한 공급원으로부터 연장 또는 Pol II에 의해 상이한 길이의 전사체를 포함하는 인공 신장 복합체를 생성하는 데 사용되는 대표적인 결과 반응을 보여준다. 도 4는 이러한 신장 복합체가 공동 전사 CTD 인산화-의존적 RNA 캡핑을 분석하는 데 사용될 수 있는 방법을 도시한다.
도 2A는 인공 신장 복합체에서 DNA 및 RNA 분자의 도면이다. 그림 2B는 프로토콜 1에 기재된 바와 같이 정확하게 수행된 반응에서 생성된 상이한 길이의 전사체를 나타내며, 이 때 시작 인공 신장 복합체는 20 nt의 합성 RNA 올리고를 사용하...

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

여기에서, 우리는 Pol II 전사 및 RNA 캡핑의 기능적 결합을 조사하기에 적합한 활성 Pol II 신장 복합체의 재구성을 허용하는 간단한 실험 시스템을 설립했습니다. 이 방법을 사용하면 기능적인 연도 단지를 몇 가지 구성 요소로 쉽게 조립할 수 있습니다. 신장 복합체는 자기 구슬에 고정되어 있어 반응 조건을 쉽게 변경할 수 있습니다.마그네틱 비드에 비오틴을 함유한 DNA 올리고를 고정하려면 먼저 200 마이크로리터의 마그네틱 비드를 저단백질 결합 1.5 밀리리터 튜브에 추가한 다음 2분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다. 튜브가 마그네틱 랙에 있는 동안 파이펫을 사용하여 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 제거합니다. 구슬을 세척하려면 랙에서 튜브를 제거하고 트리스 염산염, EDTA 및 염화 나트륨을 포함하는 세척 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오.튜브를 랙에 반환합니다. 2분 후, 세척 용액을 제거하고 동일한 버퍼의 200 마이크로리터를 사용하여 세척을 두 번 더 반복합니다. 2X 버퍼의 400 마이크로리터에서 자기 구슬을 다시 중단합니다.그런 다음 380 마이크로리터의 물과 10 마이크로몰라 비템플릿 생체화 DNA 올리고를 혼합하여 첨가합니다. 튜브를 영양사에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 200 마이크로리터의 완충제를 사용하여 3회 고정된 비템플릿 DNA 올리고로 구슬을 세척한 다음 200마이크로리터의 저장 및 희석 버퍼로 세 번 세척합니다.BSA로 구슬을 차단 완료 하룻밤 4섭씨에 튜브를 저장합니다. 다음 날, 용액을 폐기하고, 저장 및 희석 버퍼의 200 마이크로 리터에서 구슬을 재연하고, 5 마이크로 몰러의 대략적인 DNA 농도에 도달한 다음 구슬로 용액을 새로운 튜브로 전송한다. DNA-RNA 이중을 얻으려면, 서면 프로토콜에 설명된 바와 같이, 2 대 1 RNA DNA 어금니비로 PCR 튜브에서 10 마이크로리터 어닐링 믹스를 준비한다.튜브를 열 사이클러에 배치합니다. 프로그램을 섭씨 45도로 5분간 설정하고, 섭씨 43도에서 시작하여 주기당 섭씨 2도까지 12사이클을 기록합니다. 마지막으로, 섭씨 4도에서 유휴 상태로 유지하십시오.정제된 RNA 폴리머라제 II를 DNA-RNA 하이브리드에 적재하려면 DNA-RNA 이중제 1마이크로리터와 새로 준비된 폴리머라제 II 버퍼 13마이크로리터를 튜브에 혼합한다. 정제 된 RNA 폴리머 라제 II의 마이크로 리터 1 개를 추가하고 거품을 도입하지 않고 부드럽게 위아래로 파이프하고 파이펫 끝으로 저어 혼합합니다. 30도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다.신장 복합체를 완료하려면, 비 템플릿 DNA 버퍼의 14 마이크로 리터에 고정 비 템플릿 DNA 올리고 구슬의 마이크로 리터를 추가, 이전에 인큐베이션 튜브에 15 마이크로 리터 혼합물을 추가하고, 37 섭씨에서 또 다른 10 분 동안 배양. 샘플을 자기 랙에 2분간 놓습니다. 30 마이크로리터의 세척 버퍼로 샘플을 한 번 세척하여 통합되지 않은 폴리머라제 II 및 올리고를 제거합니다.RNA 23mers로 신장 복합체를 무선으로 표시하려면 ATP의 마이크로리터 1개와 무선 으로 표시된 UTP 의 마이크로리터 1개를 펄스 버퍼 23마이크로리터에 추가하고 세척된 자기 비드에 이 혼합물을 추가하여 재일시 중단합니다. 방사선 표지 23mers의 합성을 허용하기 위해 10 분 동안 반응을 배양. 100 마이크로몰러 ATP 및 100 마이크로몰러 UTP 믹스를 3.5 마이크로리터의 체이스 버퍼에 넣고 구슬에 미리 조립된 연란 복합체를 함유한 튜브에 혼합물을 추가합니다.다시 말하지만, 튜브를 5 분 동안 배양하여 모든 초기 성적 증명서를 23mers로 쫓아갑니다. 이어서, 튜브를 자기 랙에 놓고, 이전에 수행되었던 것처럼 세척하여 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거한다. 세척 버퍼의 30 마이크로 리터에서 샘플을 다시 일시 중지합니다.더 긴 성적 증명서와 신장 복합체를 생성하려면, 이전 절차를 따르고, 네 개의 반응에 대한 세척 연신 복합체의 120 마이크로 리터를 생성하기 위해 4 배 확장. 3개의 새로운 튜브 23mer, 25mer 및 29mer라벨. 세척된 연도 복합체 30개소를 23mer 튜브로 옮기고, 단백질제 K와 글리코겐을 함유한 스톱 믹스 94마이크로리터를 첨가한다.세척된 연신복합체의 나머지 90마이크로리터를 함유한 튜브를 2분 동안 마그네틱 랙에 놓고, 수퍼나탄을 제거하고, ATP와 CTP의 1.2 마이크로리터로 보충된 BTB의 90마이크로리터에서 구슬을 재연한다. 섭씨 30도에서 10분 동안 배양하세요. 90 마이크로리터의 세척 버퍼로 세척한 후, 30마이크로리터의 연도 복합체를 25mer 튜브로 옮기고, 단백질제 K와 글리코겐을 함유한 스톱 믹스 94마이크로리터를 추가한다.다시 말하지만, 2 분 동안 자기 랙에 신장 복합체의 나머지 60 마이크로 리터를 포함하는 튜브를 배치합니다. ATP및 CTP의 0.8 마이크로리터로 보충된 60마이크로리터의 완충제로 BTB 처리를 반복하십시오. 이전과 마찬가지로 배양 및 세척 후 60 마이크로리터의 세척 버퍼로 샘플을 다시 중단하십시오.샘플에서 29mer 튜브로 마이크로리터 30편을 옮기고, 단백질제 K와 글리코겐을 함유한 스톱 믹스 94마이크로리터를 첨가한다. 탈고 폴리 아크릴아미드 젤에 반응 제품을 분석합니다. 먼저, 이전에 설명된 시술을 13배 까지 확장하여 23mers를 함유한 세척 된 연신 복합체를 생성하여 12 반응 및 1 개의 추가 반응에 대해 390 마이크로 리터를 획득합니다.폴리머라제 II CTD의 인산화를 수행하기 위해, 마그네틱 랙에 샘플을 배치 한 후 상퍼 를 제거하고 BTB의 377 마이크로 리터에서 구슬을 재연. 두 개의 새로운 튜브 플러스 H와 마이너스 H.To 플러스 H를 라벨, 마이크로 리터 당 300 나노 그램의 농도에 전사 개시 인자 TFIIH의 세 마이크로 리터를 추가하고, 마이너스 H에, 저장 및 희석 버퍼의 9 마이크로 리터를 추가합니다. 세척된 연도 단지 87개와 H 튜브 261마이크로리터를 마이너스 H 튜브에 추가합니다.튜브를 10분 동안 배양하고 세척 버퍼로 세척합니다. RNA 캡핑을 수행하려면 87 마이크로리터의 캡핑 믹스를 플러스 H 튜브에 추가하고 261 마이크로리터를 마이너스 H 튜브에 추가하여 다시 중단합니다. 4개의 새로운 튜브, 5개의 플러스 H, 5마이너스 H, 15 마이너스 H, 45 마이너스 H, 및 마이크로리터 캡핑 효소당 5, 15 또는 45 나노그램의 3개의 마이크로리터를 분배합니다.그런 다음 정지 버퍼 94 마이크로 리터로 12 개의 새로운 튜브를 준비하십시오. 열 블록에서 섭씨 30도에 5플러스 H.Incubate로 표시된 튜브에 TFIIH로 처리된 87마이크로리터의 신장 복합체를 추가하여 첫 번째 캡핑 반응을 시작합니다. 스톱워치를 사용하여 캡핑 반응을 정확하게 시간 조정해야 합니다.여러 반응으로 작업할 때 각 반응의 시작 시간은 엇갈려야 합니다. 1, 2, 4분 후, 5개의 플러스 반응 혼합물 의 30마이크로리터를 1개, 2, 3개의 튜브에 전달하여 94마이크로리터의 스톱 버퍼를 함유하여 반응을 중지한다. TFIIH 없이 처리된 신장 복합체를 사용하여, 정확히 동일한 방식으로 나머지 마이너스 H 튜브의 샘플에 대한 상한 반응을 진행한다.탈고 폴리 아크릴아미드 젤에 반응 제품을 분석합니다. 다이어그램은 인공 신장 복합체에서 DNA 및 RNA 분자를 위해 여기에 표시됩니다. 20개의 뉴클레오티드의 합성 RNA 올리고를 인공 신장 복합체의 조립 시 RNA 프라이머로 사용하였으며, 23mer, 25mer 및 29mer를 생성하는 프로토콜의 각각순차적 보행 단계에서 뉴클레오티드가 첨가되었다.상이한 소스로부터 RNA 폴리머라제 II를 이용한 반응을 비교했다. 인공 신장 복합체는 쥐 간 또는 핵분열 효모로부터 정제된 내인성, 야생형 폴리머라제 II로 조립되어 23mers 또는 25mers를 생성하기 위해 걸어갔다. 분석은 5-프라임 triphosphate 끝을 가진 23개의 뉴클레오티드 녹취록을 포함하는 인공 신장 복합체와 관련되었던 방사선 표지된 녹취록의 상한을 측정하기 위하여 수행되었습니다.마지막 두 차선은 TFIIH의 존재시 에 있는 효소의 유무에 관계없이 신장 복합체가 배양되거나 없이 배양된 반응의 제품을 보여줍니다. 더 느리고 빠르게 마이그레이션하는 밴드는 각각 캡및 제한되지 않은 성적 증명서를 포함합니다. 처음 12 차선은 인광 또는 unphosphorylated CTD와 신장 복합체와 관련된 성적 증명서의 상한을 보여줍니다.폴리머라제 II 및 기타 효소의 활동은 준비에 따라 다를 수 있으므로 효소 농도를 적정하여 최적의 수준을 정의하여 반응 조건을 최적화할 필요가 있습니다. 방사성 물질을 안전하게 사용하고 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 방사능 실험을 할 때 실험실 및 종교 교육원 지침을 따르십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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