Name: 태아와 신생아 뮤 린 긴 뼈를 배양 하 고 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 태아 및 신생아 쥐의 긴 뼈를 배양하여 뼈와 연골 발달을 분석하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작과 실시간 이미징을 통해 생체 내에서는 불가능한 정밀한 연구를 가능하게 합니다.

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우리는이 프로토콜이 확립 될 때 그녀의 지원 알렉산드라 Joyner 감사 하 고 싶습니다, Edwina 맥 글 린과 레 틴 산을 공유 하기 위한이 청 창. 호주 재생 의학 연구소는 빅토리아와 호주 정부의 주 정부의 보조금에 의해 지원 됩니다.

모든 실험은 실험실 동물의 윤리적 취급에 대 한 지방 정부 및 제도적 지침에 따라 수행 되어야 합니다.
1. 뼈 배양의 날 이전 준비
<ol><li>배아 날 14.5에서 태아와 새끼를 얻기 위해 시간 마우스 짝짓기를 설정 (전자 14.5) 그리고 이후. 참고: 긴 뼈의 문화는 다른 마우스 균 주에 성공적으로 적용 될 수 있다; 본 프로토콜에서, 스위스 웹스터 야생 형 마우스의 무법자가 사용 된다.</li>
	<li>해 부 배지 준비 (휴스턴 외15): α-최소 필수 배지 (α-MEM) 또는 Dulbecco의 변성이 글 (DMEM) 1/13 인산 완충 식 염 수도 (PBS) 및 2 Mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 및 필터 살 균 0.22 µm, 33 mm 직경 주사기 필터를 통해. -20°c에 저장 하십시오.</li>
	<li>태아의 추출 전날, 0.2% BSA를 포함 하는 DMEM로 구성 된 무 혈 청 뼈 배양 배지, 0.5 mM의 L-글루타민, 40 U/mL 페니실린/streptomycin, 0.05 mg/ml 아 스 코르 브 산 및 1mm 베타 포스 페이트를 제조 한다. 0.22 µm, 33 mm 직경 주사기 필터를 통해 필터를 소독 하 고 최대 1 개월 동안 4°c에서 보관 하십시오.</li>
	<li>배양 당일 및 마우스 컬링 이전에, 24 웰 플레이트와 60 mm 요리를 해 부 배지로 준비 하 고 얼음을 차갑게 유지 하십시오. 37 ° c의 수조에 뼈 배양 액을 미리 따뜻하게 합니다. 스프레이 80 (핀셋 및 작은가 위)에 에탄올을 사용 하 여 태아를 처리 합니다. 쌍안경 범위를 2 등급 바이오 안전 캐비닛으로 전송 합니다.</li>
</ol>2. 태아와 신생아 경골과 대 퇴 골의 문화
<ol><li>원하는 임신 단계에서 자 궁 경부 탈 구를 통해 임신한 마우스를 컬링 (전자 14.5에서 전자 18.5에 이르기까지). 신생아 새끼를 사용 하는 경우, 하나 어머니에서 그들을 제거 하 고 욕 침에 의해 컬링.</li>
	<li>그녀의 뒤에 마우스를 놓고 그 표면에 80% (v/v) 에탄올을 분사 하 여 복 부 영역을 소독.</li>
	<li>작은가 위로 피부와 복 부 근육을 잘라 자 궁 뿔에 액세스 할 수 있습니다.</li>
	<li>핀셋과 작은가 위를 사용 하 여 복 강에서 자 궁을 추출 하 고 메 나 트리 움을 제거 하 고 뿔의 기저를 절단 합니다. 얼음 감기 해 부 매체와 60 mm 페 트리 접시에 자 궁을 배치 하 고 전체 절차 동안 얼음에 배양 접시를 유지.</li>
	<li>바이오 안전 내각에 자 궁으로 페 트리 접시를 전송 하 고 지금부터 거기에 작업.</li>
	<li>Sacs 사이를 절단 하 여가 위로 개별 태아를 분리 하십시오.</li>
	<li>해 부 매체와 함께 깨끗 한 60 mm 접시에 해 부에 있는 개별 sac를 전송 하 고 핀셋으로 그들을 열어 플 래 트에서 태아를 분리 하 고 멤브레인에서 청소 하십시오. 참고: 얼음에 나머지를 유지 하면서 한 번에 하나의 태아와 함께 작동 합니다.</li>
	<li>태아를 욕 하 고 깨끗 한 새로운 60 mm 접시에 시체를 전송 1 mL 잘라 멸 균 피 펫.</li>
	<li>핀셋으로 태아 또는 새끼의 피부를 제거 하 고 뒤쪽에서 시작 하 여 발가락까지 벗 겨 냅니다.</li>
	<li>척추에 가까운 핀셋으로 절단 하 여 신체에서 후 각을 분리 하 고 얼음 감기 해 부 매체로 깨끗 한 요리로 전송 합니다.</li>
	<li>핀셋으로 대 퇴 골에서 경골을 분리 하 여 말단 대 퇴 골과 근접 경골의 표면 연골 사이를 조심 스럽게 소개 합니다.</li>
	<li>근 위 대 퇴 골과 종 골 뼈에서 엉덩이 뼈와 경골에서 불 라를 제거 합니다.</li>
	<li>대 퇴 골과 경골에서 부드러운 조직을 조심 스럽게 제거 하 고 당겨 빼냅니다. 참고: 그것은 가능한 한 많은 부드러운 조직을 제거 하는 것이 중요 합니다, 두 개의 연골 극을 연결 하는 조직을 제거에 특별 한 주의를 복용 하지만, 연골을 손상 피하고, 심 낭, 그리고 뼈.</li>
	<li>24 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 4 개의 뼈 (왼쪽 및 오른쪽 티 바이어스 및 페 머)를 플라스틱 1Ml 멸 균 피 펫으로 배치 하십시오. 양자 택일로, 왼쪽과 오른쪽 사지에 다른 처리의 효력을 비교 하기 위하여, 다른 우물에 반대편 사지를 놓습니다. 참고: 뼈가 피 펫에 쉽게 붙을 수 있으므로 웰에 전달 될 때 여분의 주의를 기울여야 합니다.</li>
	<li>필요에 따라 많은 태아와 같은 방법으로 진행 합니다. 참고: 해 부 뼈를 명확 하 게 보는 것이 중요 하기 때문에 너무 흐리게 되 자 마자 해 부 매체로 접시를 변경 하십시오.</li>
	<li>
모든 원하는 뼈가 우물에 전달 되 면, 플라스틱 1 mL 멸 균 피 펫으로 해 부 배지를 제거 하 고 뼈를 흡입 하지 않도록 여분의 주의를 기울여야 합니다.
	<ol>
<li>실험의 목적에 따라, 실험의 timepoint 0으로 해 부 매체를 제거 하기 전에 뼈의 사진을 찍을 수 있습니다. 디지털 카메라에 부착 된 현미경으로 사진을 찍고 사용 된 노출과 크기에 주석을 답니다. 쉽고 신뢰할 수 있는 측정을 위해 좋은 대조를 가진 사진을 찍어 광물 화 된 부분과 구별 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 웰에 1 mL의 배양 배지를 추가 합니다. 어떤 치료가 뼈 (독 시 사이 클린, 타 목 시 펜, 성장 인자 등)에 대 한 것 이라면 지금 추가 해야 합니다.</li>
	<li>배양 조건에서 생 육 억제의 효과를 관찰 하기 위해, 레 틴 산 (RA, 500 nM)으로 왼쪽 티 바이어스를 처리 하 고 동등한 부피의 비 히 클 (디 메 틸 설 폭 사이드)을 배양 하면서 최종 농도 0.1% 제어로.</li>
	<li>표준 세포 배양 조건 하에서 세포 배양 인큐베이터에서 2 일 이상 성장 하는 뼈를 남겨 둡니다 (5% CO2 인큐베이터에서 37 ° c 에서).</li>
	<li>증식을 평가 하기 위해 5 틴-deoxyuridine) 또는 5 브로 모 deoxyuridine (BrdU)을 고정 전 10 µ의 최종 농도에서 1-2 시간으로 추가 합니다. 참고: 에 듀의 재고 농도는 20mm입니다. 주의: EdU와 BrdU는 티 미 딘 유사 하며 독성이 있고 돌연 변이 수 있습니다.</li>
	<li>4% 파라 포름알데히드 (PFA)를 해 동 하 고, 개별 2 mL 튜브에 PFA에 침 지 하 여 뼈를 고정 합니다. 주의: PFA는 독성이 있으며 인간의 발암 물질로 지정 됩니다. 파라 포름알데히드 분말 및 증기를 호흡 하지 마십시오. EdU와 BrdU는 티 미 딘 유사 하며 독성이 있고 돌연 변이 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 PFA에 10 분간 고정 한 후 최종 timepoint에서 사진 획득을 위해 뼈를 PBS로 전달 합니다. 그런 다음 4 ° c에서 하룻밤 고정을 위해 뼈를 PFA에 다시 놓습니다.</li>
	<li>고정 뼈는 원하는 다운스트림 응용 프로그램을 처리 할 수 있습니다 후.</li>
</ol>3. 골 및 광물 화 된 영역의 전체 길이의 측정 및 분석
<ol><li>이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지의 배율을 고려 하 여 골격의 길이를 측정 합니다. 뼈의 총 길이와 광물 화 된 부위를 모두 측정 합니다. 한 쪽 끝에 있는 첫 번째 어두운 셀부터 다른 쪽 끝의 마지막 값까지 측정을 시작 합니다. 참고: 광물 화 된 영역은 더 어두운 색을 특징으로하 며 연골과 쉽게 구별 됩니다.</li>
	<li>일일 평균 길이 증가로 정의 되는 성장률을 계산 하려면 골격의 최종 길이와 초기 값 간의 차이를 문화권의 일 수로 나눕니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

뼈 ex 생체 배양 방법은 뼈 성장 (28)의 생물학을 평가 하기 위해 몇 시간 동안 사용 되어 왔으며, 뮤 린 긴 뼈에는 거의 적용 되지 않았다. 이미징 기술의 발달로, 생체 내 뼈 배양은 생체 내 조건과 밀접 하 게 유사한 설정에서 실시간으로 뼈 성장을 연구 할 수 있는 매력적인 방법을 제공 합니다. 이 시나리오에서는 긴 뼈의 성장이 생체 내 성장에 필적 하는 조건을 정의 하는 것이 중요 합니다.
본 연구에서 우리는 긴 뼈 문화를 위한 간단 하 고 저렴 한 프로토콜을 설명 하 고 제한 및 가능한 응용 프로그램을 해결 합니다. 이 방법의 가장 중요 한 단계는 뼈의 분리, 그대로 유지 하 고 가능한 뼈의 끝 사이 덜 부드러운 조직으로. 뼈의 단 부 사이에 연 조직을 떠나는 것은 도 1e에서 예시 되는 것과 같이 뼈의 정상적인 성장을 방지 하 고 굽 힘을 유도 한다. 뼈의 끝에 있는 연...

장기 성장은 성장 장애의 출현을 막기 위해 밀접 하 게 조율 되어야 하며, 신체의 다른 부분 들 사이에서 여러 세포 유형, 분자 통로 및 누화를 조절 하는 것을 수반 한다. 이미징 기법은 정상적인 상태에서 성장 하는 배아에서 시간이 지남에 따라 발생 하는 변화를 해결 하는 데 필수적 이며, 시스템에서 교란이 유도 된 후에도 중요 합니다. 널리 사용 되는 설치류 모델과 같은 자궁내 발달을 가진 배아는, 전 생체 배양 기술을 사용 하 여 부분적으로 극복할 수 있는 살아있는 화상 진 찰 및 약 처리를 위한 추가 도전을 제시 합니다. 생체 내 프로세스를 성공적으로 탈환 하 고 의미 있는 결과를 얻으려면 각 기관이 나 조직에 적합 한 배양 조건을 찾는 것이 중요 합니다.
포유류 해골의 대부분의 뼈는 endochondral 골 화를 통해 자라 며, 여기서 배아 (연골 세포로 구성 됨)는 세로 성장을 유도 하 고 점차적으로 뼈로 대체 됩니다. 이 과정은 3 개의 영역이 구별 될 수 있는 긴 뼈의 끝에 있는 성장 판에서 발생 합니다: 휴식, 증식 및 비 대1,2. 먼저, 휴지기에서의 원형 전구 연골 세포는 증식 영역에서 사이클링 원주 형 연골 세포로 전환 한다. 분화의 다음 단계 도중,이 연골 세포는 비 대 하 하 고 유형 X 교원 질을 은닉 하기 시작 됩니다. 비 대 성 연골 세포는 골 화의 후속 단계를 조율 합니다: 그들은 결합 조직 성장 인자, 뼈 형성 단백질 및 인도 고슴도치와 같은 주요 신호 분자를 분 비 하 고 매트릭스의 미네랄 화를 직접, 모집 혈관을 뼈의 중앙 부분에, 그리고 아 폽 토시 스를 시 킴으로써, 골 아 세포가 매트릭스에 침입 하 여 일차 골 화 중심3,4를 형성 하도록 한다. 광물 화 된 매트릭스는 골 아 세포가 이동 하 여이 저하 된 연골을 뼈 매트릭스5로 대체 하는 혈관의 침투를 촉진 합니다. 대부분의 골 아 세포는 연골 세포 로부터 연골 매트릭스를 침범 하 고, 섬유질 층은6. 대안적으로, 비 대 성 연골 세포의 비율은 조 골 세포를 생존 하 고 트랜스 분화 할 수 있다7,8,9. 뼈의 최종 길이는 일시적인 연골의 축적 된 성장에 기인 하며, 그의 성장 속도는 비 대 성 연골 세포의 수 및 크기, 및 그들의 매트릭스 생산10에 의존 한다. 추가적으로, 최근 비 대 단계의 지속 시간이 뼈 (11)의 최종 길이와 상관 된다는 것이 최근에 나타났다. 따라서, 적절 한 뼈 크기를 보장 하기 위해 이러한 세포의 증식 및 분화의 엄격한 조절이 필요 하다.
조직 및 성장 판의 개발에 년 동안 취득 한 실질적인 지식에도 불구 하 고, 이러한 결론의 대부분은 고정 조직학 섹션의 관찰에 기초한. 조직 절편은이 과정에 대 한 중요 한 정보를 제공 하지만, 기술적 아티팩트를가지고 수 있습니다, 그래서 항상 안정적으로 다른 단계 사이의 형태학 적 또는 크기 변화를 추정 하는 데 사용할 수 없습니다. 또한 뼈 성장이 동적인 과정 이기 때문에 정적 2 차원 (2D) 이미지는 성장 판의 세포 움직임에 대 한 제한적인 통찰력을 제공 하는 반면, 살아있는 조직에 대 한 타임 랩 스 이미징의 행동에 대 한 귀중 한 정보를 제공 할 수 있습니다 성장 판의 연골 세포.
이러한 모든 제한은 생체 내 뼈 배양을 사용 하 여 잠재적으로 해결 될 수 있습니다. 뼈 배양 프로토콜은 얼마 전에 개발 되었지만, 그들은 뮤 린 긴 뼈에 무제한으로 적용 되었습니다. 대부분의 연구는 병아리 모델12,13에 의해 제공 되는 기술적인 이점 때문에 병아리 뼈를 사용 합니다. 유기 형 배양 물 (공기/액체 계면)은 10 일 동안 배양에서 유지 되었던 병아리 배아 미 립 기에 적용 되었다14. 마우스에서 사용할 수 있는 정교한 유전 도구는이 모델을 ex vivo 뼈 문화에서 사용 되는 매우 매력적으로 만듭니다. 뼈 성장에 마우스를 사용 하는 연구는 대부분 중 족 뼈 (15)와 함께 일했다, 아마 그들의 작은 크기와 배아 당 얻은 더 큰 숫자 때문에16. 전통적으로 긴 뼈로 여겨 졌으 나, 중 족은 생체 내 다른 긴 뼈 보다 더 일찍 노화 (성장 판 (17)의 증식 및 인 볼륨 감소를 특징으로 하며, 따라서 이들의 지속적인 성장은 전 생체 실제로 생체 내 프로세스를 다시 캡처합니다. 이 기사의 목적상 근 위 및 중간 팔 다리 영역의 골격에 긴 골격 이라는 용어를 사용 합니다. 몇몇 이전 연구는 tibia와 같은 긴 뮤 린 뼈를 사용 하 여, 전 생체 내 배양에서 연골의 실질적인 성장을 관찰 하지만, 작은 골 화18. 우리는 또한 최근 연골 세포 역학 (19)을 연구 하기 위해, 경골 문화를 사용 했다. 다른 연구 들은 배양21에 대 한 대 퇴 골의 말단 부에만 젊은 쥐 (20 ) 로부터 넓 적으로 대 퇴 머리를 사용 하였다. 일부 더 최근의 작품은 성공적으로 살아있는 마우스 조직22,23에 있는 연골 세포의 3 차원 (3d) 영화를 획득 하기 위해 전체 뼈의 전 생체 배양을 타임 랩 스 이미징과 결합 한다. 저자는 뼈 ex vivo 문화의 잠재적인 적용의 좋은 예에 있는 증식 영역 (23 )에 연골 세포의 재배열에서 이전에 주목 이벤트를 관찰 하기 위해 관리. 대체, 즉 정적 이미지 분석에는 간접적이 고 복잡 한 기법이 필요 합니다. 이것은 연골 성장에 대 한 transversally 중심의 클론의 중요성을 평가 하는 최근의 연구에 의해 예시 되었으며, 여기서 수학적 모델링과 결합 된 다 색 리포터 마우스 균 주를 사용한 유전 추적이24를 사용 하였다. 따라서, 전 생체 배양은 보다 빠르고 간단한 방법으로 동적 프로세스에 대 한 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
여기에서, 우리는 다른 분자 처리 및/또는 시간 경과 살아있는 화상 진 찰과 결합 될 수 있는 긴 뼈 문화를 뮤 린 위한 방법을 제시 합니다. 이 프로토콜은 이전 보고서15,25에서 사용 된 방법을 조정 하지만 몇 가지 추가 문제를 해결 하 고 중 족 뼈가 아닌 경골과 같은 긴 뼈에 초점을 맞춥니다. 마지막으로, 그것은 다른 물질의 존재에 개별적으로 왼쪽과 오른쪽 뼈를 배양 하 여 통계적으로 강력한 쌍 비교를 사용의 잠재력을 탐구.

<table><tbody><tr><td>5-Ethynyl-2'-deoxyuridine</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심 분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC 처리 센터 웰 장기 배양 접시, 20/팩, 500/케이스, 멸균</td><td>팔콘</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betaglycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>양안 내시경</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 분획 v</td><td>Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500 카메라용 기본 장치</td><td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 키트</td><td>, 컴퍼 로빈스</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td>, <td>Gibco 11960044</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>DMSO</td>, <td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr>, <tr><td>Eppendorf 2 mL 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Merk</td><td>, 159010</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont#5 Inox08</td><td>Fine Science Tools</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 well</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 1 mL 멸균 개별 포장</td><td>Thermo</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2 um</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 주사기 20 mL</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>Tretinoin (retinoic acid)</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>Trinocular scope</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

태아와 신생아 뮤 린 긴 뼈를 배양 하 고 측정

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

긴 뼈는 복잡 하 고 동적인 구조, 연골 중간을 통해 endochondral 골 화에서 발생 하는. 건강 한 인간의 뼈에 대 한 제한 된 액세스는 특히 마우스와 쥐와 같은 포유류 모델을 사용 하 여 뼈 성장과 항상성의 다양 한 측면을 살펴 보는 데 유용 합니다. 추가적으로, 쥐에 있는 정교한 유전 공구의 발달은 긴 뼈 성장의 더 복잡 한 연구를 허용 하 고 뼈 성장을 공부 하기 위하여 이용 된 기술의 확장을 요구 합니다. 여기서, 우리는 생체 내 뮤 린 뼈 배양에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고,이는 체 내 과정의 대부분을 탈환 하면서 밀접 하 게 통제 된 방식으로 뼈와 연골의 연구를 가능 하 게 한다. 설명 된 방법은 경골, 대 퇴 골 및 중 족 뼈를 포함 한 뼈의 범위의 배양을 허용 하지만, 우리는 여기에 경골 문화에 주로 초점을 맞추고 있다. 더욱이, 타임 랩 스 라이브 이미징 또는 약물 치료와 같은 다른 기술과 조합 하 여 사용 될 수 있다.

뼈 배양은 다른 단계에서 시작 하 여 수행할 수 있습니다. 도 1a에서, 동등한 단계에서 배양 된 경골과 갓 추출한 것 들 사이의 비교가 도시 되어 있다. 제 1 관찰은 최대 2 일간의 배양이 달성 되는 크기는 연골 및 광물 화 된 뼈 모두에 대 한 생체 내 뼈 성장에 필적 하는 것 이다 (도 1a, B, D). 더 긴 배양 기간은 배양 된 뼈와 갓 추출한 (도 1c) 사이의 더 큰 차이를 야기 한다. 또한, 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 뼈의 양쪽 끝을 연결 하는 연 조직을 제거 하는 것이 중요 합니다. 그렇지 않으면 뼈가 구부러집니다. 도 1e 는 연 조직이 없는 경골에 대 한 연 조직의 불완전...

여기서, 우리는 생체 내 과정을 다시 캡처하는 동안 제어 된 조건에서 뼈 및 연골 발달 및 항상성 분석에 적합 한 태아 및 신생 단계에서 긴 뮤 린 뼈의 생체 내 배양을 위한 방법을 제시 한다.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

이 방법은 중족골 배양 프로토콜을 더 큰 뼈에 적용하여 직접 뼈 조작을 복잡한 유전 모델과 결합하여 뼈 발달과 관련된 프로세스를 해결할 수 있도록 합니다. 이 기술은 살아있는 화상 진찰 또는 직접적인 물리적 및 약리학 조작과 같은 생체 내에서 가능하지 않은 뼈 성장의 조작 그리고 분석을 허용합니다. 이러한 전 생체 배양 방법은 치료가 유기체에 미치는 전신 효과로부터 분리되는 뼈내의 유전적 발병의 국소 적 효과에 대한 구체적인 연구를 가능하게 한다.임신 임신 일 의 복부 영역을 살균하여 시작 14.5 받는 사람의 복부 영역을 살균하여 80%에탄올로 마우스와 작은 가위를 사용하여 피부와 복부 근육을 열어 자궁 뿔에 접근한다. 복강에서 자궁을 추출하려면 심술통을 제거하고 뿔의 기초를 자른다. 그런 다음, 얼음에 얼음 차가운 해부 매체를 포함하는 60mm 페트리 접시에 자궁을 전송합니다.생물 안전 캐비닛에서 개별 태아를 분리하기 위해 가위를 가진 자루 사이에 잘라내고, 해부 스테레오 현미경의 밑에 신선한 해부 매체와 새로운 60 밀리미터 접시로 개별 자루를 전송합니다. 핀셋을 사용하여 태아를 태반에서 분리하고 태아를 막에서 청소하십시오. 잘린 플라스틱 파이펫을 사용하여 몸을 새로운 60mm 접시로 옮기고 배아를 더 해부하기 전에 참수하십시오.그런 다음 핀셋을 사용하여 피부를 제거하고 뒤쪽에서 시작하여 발가락으로 벗겨냅니다. 핀셋을 사용하여 척추에 가깝게 자르고 뒷다리를 몸과 분리하십시오. 뒷다리를 얼음-차가운 해부 매체를 함유한 깨끗한 접시로 옮기고, 해골 대퇴골의 표면 연골과 근위 경골 사이에 핀셋을 삽입하여 대초원으로부터 경골을 분리한다.근위 대퇴골과 칼카뉴뼈와 비골에서 엉덩이 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 대퇴골과 티바이어스에서 연조직을 잡아당기고 멸균 된 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 4 개의 다리 뼈를 신선한 해부 매체를 포함하는 24 웰 플레이트의 첫 번째 우물로 옮깁니다. 뼈의 맥박을 연결하는 연조직이 제거된다는 것을 보여주는 것이 중요합니다.그렇지 않으면 뼈가 구부러지고 적절한 성장을 이루지 못할 것입니다. 뼈가 적절한 실험적 태아 수에서 해부되었을 때, 양상 현미경하에서 각 우물의 뼈를 좋은 대조로 상시 0시에 이미지화하고 각 우물의 해부 배지를 잘 사용하여 뼈를 흡인하지 않도록 각 웰에 배양 배지를 교체합니다. 배양 조건에서 의 성장 억제효과를 관찰하기 위해, 좌측 티비아를 500나노몰라 레티노산으로

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 마우스를 희생하지 않고 대퇴골수(BM)를 연속적으로 샘플링하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 시간 경과에 따른 마우스의 BM 구성에 대한 종단 연구를 용이하게 하고 생체 외 및 이식 연구를 위해 BM 내 세포에 대한 직렬 액세스를 제공합니다.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

여기에서는 실험용 쥐의 뒷다리, 긴 뼈(대퇴골 및 경골)를 해부하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 골수 공간에서 골수를 제거하기 위해 원심분리를 사용하는 이러한 뼈에서 골수를 신속하게 분리하는 기술에 대해 설명합니다.

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

우리는 배아 15일(E15) 쥐 중족골을 해부하고 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 고도의 생리학적 체외골화 모델은 단층 또는 3D 배양의 세포보다 체내 상황에 더 가까운 조건을 제공하며 뼈 성장 및 발달을 조사하는 데 필수적인 도구입니다.

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

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Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

본 프로토콜은 캔틸레버 굽힘 설정에서 뮤린 대퇴목에 대한 재현 가능한 테스트 플랫폼의 개발을 설명합니다. 사용자 지정 3D 인쇄 가이드는 최적의 정렬로 대퇴골을 일관되고 엄격하게 고정하는 데 사용되었습니다.

뮤린 대퇴목의 캔틸레버 굽힘

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성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

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쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

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태아와 신생아 뮤 린 긴 뼈를 배양 하 고 측정

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