Name: Toxiciteitsstudie van zink oxide-nanodeeltjes in de celkweek en in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer nanotoxiciteit beoordelen in MRC5-longfibroblasten en Drosophila melanogaster met flowcytometrie en DHE-probe. Deze methode kwantificeert reactieve zuurstofsoorten en celdoodtypen voor veiligheidsanalyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De studie werd ondersteund door het subsidie nummer R706-000-043-490. De studie vertegenwoordigt niet de mening van de subsidie sponsor.

1. fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) analyse op levende/vaste cellen
<ol><li>Sonicate ZnO NPs in suspensie voor 15 min.</li>
	<li>Bereid ZnO NPs in verschillende concentraties (bijv. 0, 10, 25, 50.100 en 200 μg/mL) met 1 mg/mL ZnO NP stockoplossing voor de behandeling van gekweekte cellen.</li>
	<li>Seed MRC5 menselijke Long fibroblasten (1 x 105 cellen/goed) op een 6-well cultuur plaat een dag van tevoren, en vervolgens behandelen de cellen met 2 ml ZnO NPs (in triplicates) voor 8 h, 16 h, en 24 h.</li>
	<li>Verzamel op elk moment de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Was de celpellets tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Respendeer de cellen met 1x bindings buffer, die bestaat uit 0,1 M HEPES/natriumhydroxide (NaOH), 1,4 M natriumchloride (NaCl) en 25 mM calciumchloride (CaCl2), met een concentratie van 1 x 105 cellen per 100 μL.</li>
	<li>Voeg 5 μl fluorescein isothiocyanaat (FITC) annexin V Stain en 5 μl propidium jodide (PI) DNA-vlek toe en inincuberen de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT; 25 °c) in het donker.</li>
	<li>Boven de monsters met een extra 400 μL van 1x bindende buffer voordat u de cellen sorteert doorstroming cytometrie. Voor elk monster worden minimaal 10.000 cellen geanalyseerd.</li>
	<li>Tablaat het staafdiagram met behulp van de verkregen mediaan intensiteit.</li>
</ol>2. blootstelling van ZnO NPs aan Drosophila
<ol><li>Voeg 1 mL nanodeeltjes in verschillende concentraties toe aan injectieflacons, gevolgd door 9 mL vlieg voedsel om een eindconcentratie van 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL of 0,5 mg/mL ZnO NPs te maken.</li>
	<li>Meng de nanodeeltjes met voedsel grondig in de injectieflacons met behulp van de pipet.</li>
	<li>Laat vlieg voedsel dat ZnO NPs bevat afkoelen voor ten minste 2-3 h voor gebruik.</li>
	<li>Introduceren volwassen mannelijke en vrouwelijke vliegen in de flesjes voor 5 dagen, en hen in staat stellen om te paren en eieren te leggen (die verschijnen als witte vlekken) op het oppervlak van het voedsel.</li>
	<li>Verwijder de ouderlijke vliegen, en laat de eieren te ondergaan verdere ontwikkeling, die bestaat uit 4 verschillende ontwikkelingsstadia (embryonale, larvale, exuviae en volwassen stadium).</li>
</ol>3. dissectie van de Fly
<ol><li>Verzamel late 3RD instar larven van de wand van de flesjes voor analyses. Vers gelegde eieren ontwikkelen normaliter tot laat 3RD instar larven na 72-120 uur bij RT.</li>
	<li>Reinig de dissectie schotel en vul de put met dissectie medium/PBS.</li>
	<li>Ontleden de larven (laat 3RD INSTAR) onder de stereomicroscoop met behulp van een paar tang.</li>
	<li>Gebruik de punt van de tang om een klein gaatje te maken en open de cuticula laag van de larven. Trek de darm voorzichtig uit en plaats deze in een micro centrifugebuis van 1,5 mL die het Drosophila medium van Schneider bevat, voorafgaand aan de fixatie stap met 1 ml 4% Paraformaldehyde (PF).</li>
	<li>3.5 Bevestig de darm in PF gedurende 10 minuten bij RT, voor latere experimenten, zoals immunokleuring.</li>
</ol>4. ROS-detectie met behulp van Dihydroethidium (DHE) kleuring
<ol><li>Behandel larven met verschillende concentraties van ZnO NPs zoals beschreven in stap 2,1.</li>
	<li>Na het dissectie van de darm van 3RD instar larven zoals beschreven in rubriek 3, incuberen de darmen in het Drosophila medium van Schneider voordat weefsel kleuring wordt uitgevoerd. Los 1 μL DHE-kleurstof (uit de voorraad concentratie van 30 mM) op in 1 mL van het medium van Schneider, wat een uiteindelijke werkconcentratie van 10-30 μM DHE-kleurstof maakt.</li>
	<li>Inbroed de darm gedurende 5 minuten bij RT in het donker, en spoel vervolgens drie keer met het medium van Schneider voor elke 5 min.</li>
	<li>Bevestig de darm met 4% PF (optionele stap) en monteer de darm op glazen glijbanen, met anti-fade montage medium met 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Leg beelden vast onder een confocale Microscoop.</li>
</ol>5. fluorescentie meten met ImageJ-software
<ol><li>Importeer de vastgelegde fluorescentie beelden die zijn verkregen met behulp van fluorescentiemicroscopie of confocale laser scanning microscopie in de ImageJ-software.</li>
	<li>Klik op het menu analyseren en selecteer metingen instellen.</li>
	<li>Selecteer de uitvoer maat, zoals de geïntegreerde intensiteit van het gebied en de gemiddelde grijswaarde.</li>
	<li>Klik op meten.</li>
	<li>Selecteer een regio zonder fluorescentie om de achtergrond in te stellen.</li>
	<li>Exporteer de gegevens naar het Excel-werkblad en bepaal de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) met behulp van de berekening zoals hieronder wordt weergegeven. CTCF = geïntegreerde dichtheid-(gebied van geselecteerde cel X gemiddelde fluorescentie van achtergrond metingen)</li>
	<li>Een staafdiagram construeren en statistische analyses uitvoeren.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li>
<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
<li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li>
<li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila - a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li>
<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li>
<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
<li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+a+potential+teratogen%3A+a+lesson+learnt+from+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li>
<li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a+human+food+additive%2C+titanium+dioxide+nanoparticles+E171%2C+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
<li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials%3A+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li>
<li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity%3A+Physicochemical+properties+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li>
<li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fruit+fly+in+the+nanoworld%3A+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li>
<li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li>
<li>Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. , Chapter 1 (2011).</li>
<li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA%2C+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li>
<li>Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartig%2C+SM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om te beoordelen of ZnO NP apoptosis in MRC5 fibroblasten kan induceren, gebruiken we flow cytometrie om de cellen te onderscheiden van necrotische of apoptotische celdood. In normale levende cellen, fosfatidylserine (PS) is gelokaliseerd op de celmembraan. Als apoptosis optreedt, is PS transgelegen naar de extracellulaire bijsluiter van het plasma membraan, waardoor de binding van Annexin V gelabeld met fluoresceïne (FITC Annexin V)29. Aan de andere kant, de rood-fluorescerende propidium jodide (...

Nanotechnologie verwijst naar de toepassing van nano-sized materialen die worden gebruikt in alle wetenschappelijke gebieden, met inbegrip van de geneeskunde, materialen wetenschap, en biochemie. Bijvoorbeeld, ZnO NPs die bekend staan om hun ultraviolet verstrooiing, chemische sensing, en anti-microbiële eigenschappen, evenals hoge elektrische geleidbaarheid, worden gebruikt in de productie van verschillende consumentenproducten zoals voedsel verpakking, cosmetica, textiel, rubbers, accu's, katalysator voor de behandeling van auto-staart gassen, en biomedische-gerelateerde toepassingen1,2,3.
De ontluikende toepassingen van ZnO-producten op basis van NP, die leiden tot een toegenomen menselijke blootstelling aan ZnO NPs, hebben echter bezorgdheid geuit over hun potentiële nadelige gevolgen voor de menselijke gezondheid. Een aantal in vitro cellulaire studies hebben aangetoond dat ZnO NPs kan induceren oxidatieve stress, autophagy-gerelateerde cytotoxiciteit, ontsteking, en genotoxiciteit4,5,6,7,8 . Met name, de toxiciteit van ZnO NPs wordt verondersteld te worden veroorzaakt door de ontbinding van Zn tot vrije Zn2 + ionen, evenals de oppervlakte reactiviteit van ZnO, resulterend in de cellulaire Ionische en metabole onevenwichtigheden die zijn gekoppeld aan verminderde Ionische homeostase en een remming van Ion transport4,7,9,10. Belangrijk, studies hebben aangetoond dat de generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een van de primaire mechanismen onderliggende ZnO NPs-geassocieerde toxiciteit. Onvoldoende anti-oxidatieve activiteit na ROS-belediging is aangetoond dat zij verantwoordelijk zijn voor het opwekken van de cytotoxiciteit en DNA-schade9. De toxische effecten van ZnO NPs zijn ook gerapporteerd in diermodellen, waaronder knaagdieren1, zebravis11,12, evenals de ongewerveld Drosophila13.
Drosophila fungeert als een goed opgezet alternatief diermodel voor toxiciteits screening van chemische entiteiten en nanomaterialen (nm's)14,15. Belangrijk is dat er een hoge mate van genetische en fysiologische gelijkenis bestaat tussen humaan en Drosophila die het gebruik van Drosophila rechtvaardigt als een in vivo model voor het evalueren van biologische reacties op milieuverontreinigingen zoals nm's 16. Bovendien zijn er veel voordelen van het gebruik van Drosophila vanwege zijn geringe omvang, korte levensduur, genetische geschiktheid en eenvoudig en kosteneffectief onderhoud. Bovendien is Drosophila op grote schaal goedgekeurd voor de studie van genetica, moleculaire en ontwikkelingsbiologie, sinds zijn volledige genoom jaren geleden volledig is gesequenced terug in 2000, waardoor het geschikt is voor een verscheidenheid aan hoge doorvoer screening en voor het aanpakken van onopgeloste biologische vragen17,18,19,20,21. In de afgelopen jaren zijn een aantal studies gerelateerd aan immunotoxiciteit met behulp van verschillende soorten NPs in Drosophila gemeld15,22,23,24. Deze fundamentele nieuwe kennis verkregen uit de studies met Drosophila heeft geholpen om meer inzicht te geven in ons begrip van nano toxicologie.
ROS is een bekende boosdoener voor cytotoxiciteit en genotoxiciteit veroorzaakt door NPs, in het bijzonder, op metaal gebaseerde NPs25. ROS zijn zuurstof bevattende chemische soorten met hogere reactieve eigenschappen dan moleculaire zuurstof. Vrije radicalen zoals superoxide radicaal (O2-) en zelfs, niet-radicale moleculen zoals waterstofperoxide (H2O2) kunnen fungeren als Ros. Onder normale fysiologische aandoening, ze zijn vereist voor het handhaven van cellulaire homeostase26, echter, buitensporige Ros als gevolg van overproductie of disregulatie van de antioxidant afweersysteem kan oxidatieve stress veroorzaken, wat leidt tot schade aan eiwitten, lipiden en deoxyribonucleïnezuur (DNA)27. Bijvoorbeeld, als ROS niveaus toenemen en glutathion (GSH) niveau tegelijkertijd afneemt, verstoring van adenosinetrifosfaat (ATP) synthese plaatsvindt en lactaat dehydrogenase (LDH) niveau verhogingen in het medium, culmineren in celdood27.
Hier bieden we protocollen voor het uitvoeren van cellulaire en genetische analyses met behulp van gekweekte zoogdieren cellen en Drosophila om te bepalen van de mogelijke nadelige effecten van ZnO NPs. Een overzicht van de methode die wordt gebruikt voor de toxiciteitsstudie van ZnO NPs wordt weergegeven in Figuur 1.

<table><tbody><tr><td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cncCK6/TM3, Sb</td><td></td><td></td><td>een geschenk van Dr. Kerppola T</td></tr><tr><td>Cornmeal, glucose, yeast brewer</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP with Summit Software</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 human lung fibroblast</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&rsquo;s Drosophila medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinc Oxide Nanoparticles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>Refer Sheet 2</td></tr></tbody></table>

toxiciteitsstudie van zink oxide-nanodeeltjes in de celkweek en in drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NPs) hebben een breed scala aan toepassingen, maar het aantal rapporten over ZnO NP-geassocieerde toxiciteit is de afgelopen jaren snel gegroeid. Echter, studies die de onderliggende mechanismen voor ZnO NP-geïnduceerde toxiciteit verhelderden zijn scanty. We bepaalden de toxiciteits profielen van ZnO NPs met behulp van zowel in vitro als in vivo experimentele modellen. Een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel werd waargenomen in ZnO NP-blootgestelde MRC5 Long fibroblasten, waaruit blijkt dat ZnO NPs cytotoxische effecten uitoefent. Evenzo, interessant, gut blootgesteld aan ZnO-NPs tentoongesteld een dramatische toename van reactieve zuurstof soorten niveaus (ROS) in de fruitvlieg Drosophila. Meer diepgaande studies zijn nodig om een risicobeoordeling voor het toegenomen gebruik van ZnO NPs door consumenten vast te stellen.

NP-blootgestelde cellen werden verwerkt met de celkleuringsreagens Kit, gevolgd door celsortering met behulp van Flowcytometrie. ZnO NP-behandelde cellen (onder, rechter paneel) vertonen een hoger percentage vroege (R3)/late apoptotische cellen (R6) dan controle cellen (R5, onder, linker paneel). Necrotische celdood wordt aangeduid met R4 (boven, rechter paneel) (Figuur 2). De resultaten van de FITC/Annexin V-test op ZnO NP-behandelde MRC-5-fibroblasten zijn ...

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de toxicologische profielen van zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NPs) in het bijzonder, het type celdood in humane MRC5 Long fibroblasten en ROS vorming in de fruitvlieg Drosophila.

Toxiciteitsstudie van zink oxide-nanodeeltjes in de celkweek en in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Onze methoden schetsen een eenvoudige en herhaalde manier voor het bestuderen van nanotoxiciteit, zoals het onderzoeken van de soorten celdood en het onderzoeken van de productie van reactieve zuurstofsoorten. Fluorescentie geactiveerd cel sorteren is een strikt formaat dat ons in staat stelt om de subpopulatie van cellen en de groeiende verschillende soorten celdood te bestuderen. De DHE sonde studiemethode stelt ons in staat om reactieve zuurstofsoorten te detecteren en te kwantificeren, gevolgd door flow cytometrie, microscopische beeldvorming met hoge inhoud en door een op elkaar gebaseerde fluorescentieanalyse.Om te beginnen, plaats een Eppendorf buis met zinkoxide nanodeeltjes in zinkoxide nanodeeltjes voorraad oplossing in een sonicator gedurende 15 minuten. Bereid zinkoxide nanodeeltjes in verschillende concentraties met behulp van een-milligram-per-milliliter zinkoxide nanodeeltjes voorraad. Dan, in een bioveiligheidskast, zaad MRC5 menselijke longfibroblasten op drie zes-put kweekplaten bij de concentratie van één keer 10 tot de vijfde cellen per put.Broed de cellen uit op 37 graden Celsius. Behandel de cellen na één dag met twee milliliter zinkoxidenanodeeltjes gedurende

toxicity-study-zinc-oxide-nanoparticles-cell-culture-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit artikel worden zebravisembryo's gebruikt voor het screenen van chemische toxiciteit. Chemische toxiciteit is gecorreleerd met fenotype-uitlezingen. Het monsterprotocol toont een methodologische benadering van het uitvoeren van de chemische toxiciteitsscreening.

Embryo-gebaseerd chemisch toxiciteitsscherm: effecten op de ontwikkeling van zebravisembryo's beoordelen

Een protocol wordt ontwikkeld om de effecten van een epigenetisch medicijn DZNep op de ontwikkeling, vruchtbaarheid en overlevingskansen van muggen te onderzoeken. Hier beschrijven we procedures voor de aqueuze blootstelling van DZNep aan onvolwassen muggen en een op bloed gebaseerde blootstelling van DZNep aan volwassen muggen, naast het meten van SAH hydrolase remming.

Toxicologische Testen voor Testing Effecten van een epigenetische Drug ontwikkelingssamenwerking, Vruchtbaarheid en Survivorship van malariamuggen

In deze paper bieden wij een gedetailleerd protocol voor het blootstellen van de soort van het geslacht Drosophila aan verontreinigende stoffen, met het doel van het bestuderen van de impact van blootstelling over een scala van fenotypische resultaten op verschillende ontwikkelingsstadia en voor meer dan één generatie.

Experimentele Protocol voor het gebruik van Drosophila als een ongewervelde modelsysteem voor toxiciteitstests in het laboratorium

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Endocriene verstorende chemicaliën (Edc's) vormen een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke omgevingen. Fruit vliegje melanogaster is een ideaal model om EDC-effecten in vivo te bestuderen. Hier presenteren we methoden om endocriene verstoring in fruitvliegje te onderzoeken, het aanpakken van EDC effecten op Fecundity, vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en de levensduur van de vliegen.

Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje melanogaster

Dit protocol presenteert veelgebruikte cytotoxiciteitstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red en MTT-assays) aangepast voor de beoordeling van cytotoxiciteit in zebravisembryo's (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen.

Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Dit protocol beschrijft een efficiënte en goedkope methode die vloeibare media gebruikt om de effecten van chemische toxische stoffen op de levensvatbaarheid van volwassen Drosophila melanogaster te beoordelen.

Beoordeling van chemische toxiciteit bij volwassen Drosophila Melanogaster

De volgende studie evalueert het toxicologische profiel van een geselecteerd metaal-organisch raamwerk met behulp van elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS), een real-time, high-throughput screeningstechniek.

Elektrische cel-substraatdetectie voor real-time evaluatie van toxicologische profielen van metaal-organische kaders

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer nanotoxiciteit beoordelen in MRC5-longfibroblasten en Drosophila melanogaster met flowcytometrie en DHE-probe. Deze methode kwantificeert reactieve zuurstofsoorten en celdoodtypen voor veiligheidsanalyses.

Toxiciteitsstudie van zink oxide-nanodeeltjes in de celkweek en in Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen