Name: 체외 방사선 생물학 실험을 수행하기위한 선형 가속기 의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 배우세요 선형 가속기를 활용한 체외 방사선 생물학 실험 방법으로 암 세포의 방사선 생물학적 효과를 평가합니다. 이 프로토콜은 다양한 암 세포 유형 및 임상적으로 관련된 선량과 선량률 연구에 적용 가능합니다.

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우리는 선형 가속기의 사용을 위한 방사선 종양학의 클리블랜드 진료소 부에 감사합니다. 우리는 신경교종 줄기 와 같은 세포의 그의 관대 한 선물에 대한 박사 제레미 리치 감사합니다. 이 연구는 클리블랜드 클리닉에 의해 지원되었다.

1. 현탁액 세포 배양을 위한 세포 준비
<ol><li>배양 신경교종 줄기형 세포는 37°C에서 5% CO2, 95% 상대 습도를 가진 세포배양 인큐베이터에서 약 5 x 106 세포/10 cm 플레이트에서 줄기 세포 배양 배지에서 줄기줄기 유사 세포를 배양한다. 참고: 세포 배양 조건은 모든 절차에 걸쳐 동일합니다. 프로토콜에 사용되는 미디어는 완전한 미디어입니다.</li>
	<li>예정된 조사 이틀 전에, 배양 후드에 멸균 5 mL 피펫을 가진 배양 플레이트로부터 신경교종 줄기 유사 세포를 15 mL 원심분리기 튜브로 수집한다.</li>
	<li>200 x g에서 3분 동안 싱크대 원심분리기에서 수집된 세포를 원심분리기.</li>
	<li>상온액을 버리고 섭씨-EDTA에서 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 실온에서 1 mL의 트립신-EDTA로 세포 펠릿(약 1 x 107 셀)을 소화한다. 세포가 철저히 소화되도록 소화하는 동안 2 분마다 원심 분리기 튜브의 바닥을 부드럽게 흔들어줍니다.</li>
	<li>트립신을 담금질하기 위해 3 mL의 줄기 세포 배양 배지 (재료 표참조)를 추가합니다. 200 x g에서 수집된 세포를 카운터 상판 원심분리기에서 3분 동안 원심분리기. 상급을 버리고 세포 펠릿을 저장합니다.</li>
	<li>5 mL의 세포 배양 배지로 세포를 재중단하고 혈세포계로 세포를 계산합니다.</li>
	<li>플레이트 5 x 106 세포를 세포 배양 배지의 10 mL을 함유하는 2개의 10 cm 플레이트에 담는다.</li>
	<li>예정된 조사 직전에, 1.3단계에서 설명한 바와 같이, 세포를 수집하고 원심분리 후 상상액을 버린다. 세포 배양 배지의 5 mL로 세포 펠릿을 다시 중단시켰다. 세포 배양 배지의 2 mL를 포함하는 35 mm 플레이트에 1 mL의 세포 현탁액을 전달한다. 참고 : 용지의 총 부피는 35mm 플레이트에서 3mL로 액체를 플레이트의 높이가 1cm로 만듭니다.</li>
	<li>플라스틱 또는 폼 박스와 같은 보조 용기에 도금 된 세포를 옮겨 오염 위험을 줄이고 용기에 있는 세포를 유틸리티 카트의 조사 시설로 가져옵니다.</li>
	<li>4단계에서 기재된 바와 같이 세포를 조사한다.</li>
</ol>2. 부착 된 세포 배양용 세포 준비
<ol><li>조사 1일 전, 세포 배양 후드에서, HEK-293 세포와 같은 부착된 세포주 배양판으로부터 DMEM 배지를 제거한다. 진공에 연결된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 미디어를 흡입할 수 있습니다.</li>
	<li>5 mL의 멸균 PBS로 세포를 배양 접시에 씻어 잔류 배지를 씻어낸다.</li>
	<li>파이펫 1 mL 의 트립신-EDTA 배양 접시에 넣고 배양 판을 부드럽게 기울여 전체 접시가 트립신-EDTA로 덮여 있는지 확인합니다.</li>
	<li>실온에서 5분 동안 세포를 트립시니화. 3 mL의 DMEM 배지로 트립신-EDTA 반응을 담금질하고 배양 후드에 5 mL 파이펫을 가진 세포를 15 mL 원심분리튜브로 수집한다.</li>
	<li>200 x g에서 수집된 세포를 카운터 상판 원심분리기에서 3분 동안 원심분리기. 상급을 버리고 세포 펠릿을 저장합니다.</li>
	<li>DMEM 매체의 5 mL로 세포를 다시 중단하고 혈세포계로 세포를 계산합니다.</li>
	<li>플레이트 2 x 105 세포를 35 mm 플레이트에서 3 mL의 세포 배양 배지를 사용하여 1 cm의 배지높이로 하였다.</li>
	<li>37°C에서 인큐베이터에서 24시간 의 세포 배양 후, 이차 용기(즉, 절연된 발포박스)에 도금된 세포를 유틸리티 카트상에 조사 시설로 옮김을 전달한다.</li>
	<li>4단계에서 기재된 바와 같이 세포를 조사한다.</li>
</ol>3. 조사 후 면역 염색을위한 세포 준비
<ol><li>밤새 4 °C에서 얼음에 상업적 인 세포 외 단백질 매트릭스를 해동. 밤새 4°C에서 200 μL 파이펫 팁 및 1.5 mL 원심분리튜브를 냉각시..</li>
	<li>미리 냉각된 파이펫 팁과 튜브당 200 μL의 1.5 mL 원심분리튜브가 있는 세포외 단백질 매트릭스.</li>
	<li>세포 배양 배지의 20 mL의 사전 냉각된 20 mL에서 세포외 단백질 매트릭스의 200 μL을 희석하여 1% 세포외 단백질 매트릭스 배지를 만듭니다.</li>
	<li>멸균된 커버슬립(22mm x 22mm)을 35mm 플레이트에 넣습니다. 커버슬립에 1% 세포외 단백질 매트릭스 매질 400 μL을 놓습니다.</li>
	<li>세포외 단백질 매트릭스가 커버슬립 상에 중합될 수 있도록 35 mm 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 37°C로 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>현탁액 세포 배양을 사용하는 경우, 단계 1.1 에서 1.5단계에 기재된 바와 같이 단일 세포 현탁액을 만든다.</li>
	<li>플레이트 5 x 104 세포를 35 mm 플레이트에 놓은 세포 외 단백질 매트릭스 코팅 커버슬립. 도금된 세포를 밤새 세포 배양 인큐베이터로 돌려보내 세포가 단백질 매트릭스에 의해 지지되도록 한다. 배양 접시에서 배지의 높이가 1cm에 도달하도록 플레이트 내의 미디어의 총 부피는 3 mL이어야 한다.</li>
	<li>10배 배율 대물 렌즈로 밝은 필드 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포는 부동 대신 커버 슬립에 펼쳐져야합니다. 도금된 세포로 배양접시를 유틸리티 카트상에 있는 조사 시설로 폼 박스와 같은 보조 용기로 옮기고 4단계에서 설명한 바와 같이 세포를 조사한다.</li>
	<li>부착된 세포 배양체(예를 들어, HEK-293 세포)를 사용하는 경우, 단계 2.1 에서 2.6단계로 기재된 바와 같이 세포를 다이제스트한다. 5 x 104 세포를 조사 전날 35mm 플레이트에 멸균 커버 슬립에 놓아 3.9 단계에서와 같이 현미경으로 관찰하여 커버슬립 표면에 세포가 완전히 부착되었는지 확인하십시오. 3 mL의 DMEM 용지를 사용하여 플레이트의 높이가 1cm인 액체를 만듭니다.</li>
	<li>커버슬립에 세포를 성장한 후 하룻밤 또는 최대 1일까지, 배양 접시를 이차 용기에 도금된 세포로 이송하여 조사 시설로 옮김을 한다. 유틸리티 카트를 사용하여 유출 위험을 줄일 수 있습니다. 4단계에서 기재된 바와 같이 세포를 조사한다.</li>
</ol>4. 선형 가속기 (LINAC)를 가진 조사
<ol><li>LINAC의 콘솔 소프트웨어를 사용하여 가속기 갠트리와 콜리메이터를 0°로 설정하고 X 및 Y 턱을 대칭 20 x 20cm2 필드 크기로 열고 다중 리프 콜리메이터(MLC)가 있는 경우 철회합니다. 참고: LINACs는 매우 높은 용량 속도를 허용하는 FFF(fFF) 모드가 없는 평탄화 필터를 가질 수 있습니다. 이름에서 알 수 있듯이,이 방사선은 균일하지 않습니다 (평면), 높은 투여 량 속도는 빔의 중심에서 만 달성된다. 이 경우 7 x 7cm2 필드가 사용됩니다.</li>
	<li>처리 소파에 물 등가 물 5cm 이상을 놓습니다. 세포 접시를 400 MU/min(표준 용량 속도)으로 조사하여 물과 동등한 재료에 놓고 LINAC 십자선에 집중합니다.</li>
	<li>6 MV X 선 빔에 최대 용량의 깊이로 조사 할 세포를 배치, 약 1.5 cm. 접시의 상단에 물 등가 물 의 추가 1cm를 배치. 세포가 매달려있는 배지의 1cm와 결합하면 세포를 평균 깊이 1.5 cm로 배치합니다.</li>
	<li>앞면 포인터를 LINAC의 머리에 부착합니다. 맨 앞 포인터가 축적 재질의 표면에 닿을 때까지 확장하고 거리를 기록합니다. 소스에서 축적 표면까지의 거리가 100cm가 될 때까지 테이블 높이를 조정합니다. 참고: 광 거리 표시기를 통해 거리를 확인할 수 있습니다. 대안적으로, 광학 거리 표시기는 100 cm로 표면을 축적하기 위해 소스를 설정하는 전면 포인터 대신에 사용될 수있다.</li>
	<li>적절한 수의 모니터 유닛(MU)을 계산하여 원하는 양의 방사선을 세포에 전달하고 가속기를 400 MU/min으로 전달하도록 프로그래밍합니다. 참고: 최대 용량의 깊이에서 1cGy/MU를 제공하기 위해 보정된 LINAC의 소스 대 표면 거리(SSD) 설정의 경우, 필요한 수의 모니터 유닛은 MU = 투여량(cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)를 사용하여 계산되며, 여기서 OF는 출력 계수를 나타냅니다. 이 계산은 대체 교정 설정을 사용하여 LINACs에 대해 변경해야 합니다.</li>
	<li>치료 금고를 두고 다른 모든 개인이 종료되었는지 확인합니다. 방에 다른 세포가 없거나 방사선이 적어질 것이라는 점을 제거하십시오. 볼트 문을 닫습니다.</li>
	<li>콘솔에서 필드 크기, MU 및 MU/min을 확인한 다음 빔을 사용하도록 설정합니다.</li>
	<li>4.3-4.8 단계를 반복하여 세포가 더 높거나 낮은 용량 속도로 조사될 수 있도록 한다.<ol>
<li>가속기로 더 높은 투여량 비율(예를 들어, 2100 MU/min 이상)을 달성하기 위해, 역제곱 법에 따라 세포에 대한 유효 투여율을 증가시키기 위해 SSD를 감소시다: 용량유효 =투여량 * (100 cm/SSD_New) 2.</li>
		<li>낮은 투여량 비율(예를 들어, 20 MU/min)의 경우, 소스에서 표면 거리(SSD_New)를 증가시키고 투여율을 감소시다. 예를 들어, 세포 배양 접시는 치료실의 바닥에 놓일 수 있다.</li>
		<li>이 설정이 필요한 경우 가속기의 모니터 장치 설정을 다시 계산하여 MU = 도량 (cGy) / (1 cGy / MU) / OF (20x20)/ (100cm / SSD_New)2를사용합니다. MU 계산에 대한 자세한 내용은 McDermott 및 Orton18참조를참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복용량 비율 (Gy/Min) = 복용량 (Gy)*(MU/min)/MU에 의해 Gy/분에서 복용량 비율을 결정합니다. 예를 들어, 400 MU/min에서 전달된 4Gy는 380 MU가 필요하므로 4*400/380 = 4.2 Gy/min. 표1을 참조하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59514/59514fig1.jpg"> 그림 1 : 선형 가속기에 세포 배양 접시를 설치합니다. (A) 임상 선형 가속기가 도시된다. (B) 5cm의 물 등가 재료는 트리트먼트 소파에 놓습니다. (C) 세포 배양 접시가 재료의 표면에 놓입니다. (D) 요리는 정사각형 라이트 필드에 표시된 처리 장에서 가속기 십자선을 사용하여 중앙에 있습니다. (E) 1cm 물 등가 재료는 세포 배양 접시 위에 놓습니다. 소스대 표면 거리(SSD)는 광학 거리 표시기(F,G)또는 전면 포인터(H, I)를 사용하여 확인된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59514/59514fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 조사 후 생물학적 암세
<ol><li>조사 후, 상기와 동일한 방식으로 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보인다(단계 1.9, 2.8 및 3.10).</li>
	<li>필요에 따라 연구 프로젝트에 맞게 다양한 생물학적 검정을 맞춤화하십시오. 참고: 여기서, 우리는 조사 후 생물학적 분석의 예로 대표적인 세포 주기 분석(16)을 나타낸다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

방사선 요법은 암 관리의 필수적인 부분입니다. 지속적인 노력은 방사선 치료의 효능과 효율성을 개선하기 위해 노력한다. 선형 가속기 기술의 발전은 전례없는 정확성과 안전성으로 환자를 치료할 수 있는 기회를 제공했습니다. 대부분의 환자는 선형 가속기에서 고에너지 엑스레이로 취급되기 때문에, 선형 가속기에 수행된 복용량 비율의 큰 범위의 생물학 효력을 검토하는 연구 결과는 환자에게 쉽게 적용될 수 있습니다. 방사선 생물학 연구에 선형 가속기를 적용하는 여러 보고서가 있었지만 결과가 혼합되어 추가 연구가 필요합니다13,14,15,16,19.
선형 가속기는 소정의 용량이 전달된 후 X선이 생성되지 않...

방사선 요법은 암 1, 2,3,4의많은 유형에 대한 효과적인 치료입니다. 초고용량 조사는 방사선 요법에서 비교적 새로운 것이며 선형 가속기 5의 최근기술 발전에 의해 가능하게된다. 표준 복용량 비율 조사에 비해 추가 높은 복용량 비율의 임상 이점은 단축된 처리 시간 및 향상한 참을성 있는 경험을 포함합니다. 선형 가속기는 또한 세포 배양 기반 방사선 생물학 연구를 위한 임상 설정을 제공합니다. 방사선 선량 및 용량 비율의 생물학적 및 치료적 의미는 수십 년 동안 방사선종양전문의와 생물학자의 관심의 초점이었다 6,7,8. 그러나, 여분의 높은 복용량 비율 조사 및 플래시 조사의 방사선 생물학 - 방사선의 매우 높은 복용량 속도 - 아직 철저하게 조사되지 않았습니다.
감마선 조사는 세포 배양 기반 방사선생물학 9,10,11에널리 사용된다. 방사선은 부패 방사성 동위원소 소스에서 방출 감마선에 의해 달성된다, 일반적으로 세슘-137. 방사성 소스의 사용은 매우 규제되고 종종 제한됩니다. 소스 기반 조사를 통해 광범위한 용량 비율을 테스트하는 것이 어렵고, 임상 달성 가능한 용량 비율12의생물학적 효과 분석에 그 유용성이 제한됩니다.
복용량 과 복용량 속도 효과 모두 설명 하는 여러 연구 되었습니다12,13, 14,15,16,17. 이러한 연구에서는, 선형 가속기에서 생성된 방사성 동위원소 또는 X선으로부터 생성된 감마-조사가 모두 사용되었다. 폐암, 자궁경부암, 아교모세포종 및 흑색종을 나타내는 다양한 세포주를 사용했습니다. 세포 생존, 세포 주기 체포, 세포 사멸 및 DNA 손상에 대한 방사선 효과는 판독12,13,14,15,16,17로 평가되었다. . 여기서, 우리는 선형 가속기를 사용하여 X선 기반 방사선을 전달함으로써 임상적으로 관련 방사선 선량 및 선량의 생물학적 효과를 정의하는 방법을 기술한다. 이 연구 결과는 생물학자, 방사선 종양전문의 및 의학 물리학자 사이 가까운 협력으로 수행되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glioma 줄기 유사 세포 387</td><td></td><td></td><td>Jeremy Rich 박사의 선물</td></tr><tr><td>293 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>뉴런 줄기 세포 배양 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>NeurobasalTM 배지</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF 단백질</td><td>R& D 체계</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간적인 FGF 기본적인</td><td>R& D 체계</td><td>4114-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>B-27&trade; 보충제</td>: <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>,</td> 11360070 <td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>,</td> 25030164 <td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>세포외 프로텐 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>MatrigelTM</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 케미컬</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm세포 배양 접시</td><td>Denville</td><td>T1110</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 세포 배양 접시</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>CC7682-3340</td><td></td></tr><tr><td>22x22mm 유리 커버 슬립</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72210-10</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M36</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-233</td><td></td></tr><tr><td>피펫 보조기</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-06</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>선형 가속기</td><td>Varian</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>물 등가 물질</td><td>Sun Nuclear corporation</td><td>557</td><td>고체 물TM</td></tr><tr><td>시약 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체</td><td>10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100 units/mL 페니실린 G, 100 &마이크로; 500 ml DMEM 배지</td><td></td><td></td></tr><tr><td>줄기 세포 배양 배지</td><td>10 ml B27 보충 자료, 20 &micro; g hFGF, 20 &마이크로; g hEGF, 2 mM L-글루타민, 100 units/mL 페니실린 G, 100 &마이크로; 500ml Neurobasal 배지의 g/mL 스트렙토마이신</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체외 방사선 생물학 실험을 수행하기위한 선형 가속기 의 사용

Use of a Linear Accelerator for Conducting In Vitro Radiobiology Experiments

방사선 요법은 암 관리의 초석 중 하나입니다. 대부분의 암에 대 한, 그것은 가장 효과적인, 비 수술 치료 는 종양을 debulk. 여기서, 우리는 선형 가속기로 암세포를 조사하는 방법을 기술한다. 선형 가속기 기술의 발전은 방사선 요법의 정밀도와 효율성을 향상시켰습니다. 방사선 복용량 및 복용량 비율의 넓은 범위의 생물학적 효과 조사의 강렬한 영역을 계속. 선형 가속기의 사용은 임상적으로 관련된 복용량 및 복용량 비율을 사용하여 이러한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

선형 가속기에 의한 표준 투여량 율 및 엑스트라 고용량 레이트 조사의 세포 주기 효과를 조사하기 위해, 신경교종 줄기 유사 세포의 3개의 샘플을 이 프로토콜을 사용하여 제조하고 조사 후 24시간 수집한 1개의 대조군 샘플17:1개의 대조군 샘플 조사되지 않은(그림2A), 400 MU/min(모니터 유닛, 4.2 Gy/min 표준 투여량, 도 2B)으로 조사된 샘플 1개, 2100 MU/min(21.2 Gy/min 엑스트라 고용량 레이트) 으로 조사된 다른 샘플, 그림 2 C)4 Gy. 세포 주기 프로파일은 세포 주기의 상이한 단계에서 세포의 백분율로 표시됩니다.
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임상 선형 가속기는 암세포에 대한 광범위한 투여량 비율의 생물학적 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 우리는 세포 기지를 둔 계산서를 위한 선형 가속기를 설치하는 방법 토론하고 암 줄기 같이 세포를 위한 세포 기지를 둔 세포 같이 세포는 부착한 문화로 성장한 현탁액 및 세포주에서 종양구로 성장했습니다.

Radiation therapy remains one of the cornerstones of cancer management. For most cancers, it is the most effective, nonsurgical therapy to debulk tumors. ...

방사선 요법은 선형 가속기를 사용하여 가장 자주 전달됩니다. 이 프로토콜은 연구원이 선형 가속기를 사용하여 세포에 방사선의 생물학적 효력을 평가할 수 있게 합니다. 이 기술의 장점은 선형 가속기를 사용하여 연구자들은 임상적으로 관련된 다양한 용량과 용량 비율을 연구 할 수 있다는 것입니다.더욱이, 이 프로토콜은 암세포의 모든 모형을 위해 이용될 수 있습니다. 이 방법은 여기에 표시된 것과 유사한 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어 다른 공급업체에서 제조한 선형 가속기입니다.선형 가속기를 사용하여 도시메트릭 계산을 수행하는 데 경험이 없는 개인은 원하는 용량을 샘플에 전달하는 데 필요한 정확한 모니터 단위 수를 계산하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 그(것)들은 경험 의학 물리학자 또는 점안사에게서 조언을 구함으로써 유익할 것입니다. 선형 가속기를 사용하여 시료에 용량을 정확하게 전달하려면 신중한 배치가 필요합니다.예정된 조사 이틀 전에, 배양 후드에서 일하는 멸균 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 배양 판에서 신경교종 줄기와 같은 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다. 원심 분리기는 싱크대 원심분리기에서 3분 동안 200배 g의 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 트립신-EDTA의 1 밀리리터로 셀 펠릿을 다시 놓습니다.펠릿을 소화하고 트립신-EDTA에서 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 소화 중 2분마다 원심분리기 튜브바닥을 부드럽게 흔들어 세포가 철저히 소화되도록 합니다. 그런 다음 줄기 세포 배양 매체의 3 밀리리터를 추가하여 트립신을 담금질하고 부드럽게 혼합하고 원심분리기를 200회 g에서 싱크로원심분리기에서 3분간 첨가합니다.상체를 폐기한 후, 세포 배양 배지의 5밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단하고 혈류계로 세포를 계산한다. 플레이트 5백만 개의 세포는 세포 배양 배지 의 10 밀리리터를 포함하는 2개의 10센티미터 판으로 나누고 섭씨 37도에서 48시간을 배양합니다. 예정된 조사 직전에 이전과 마찬가지로 세포와 원심분리기를 수집합니다.상체를 버리고 세포 배양 배지의 5 밀리리터로 세포 펠릿을 재중단합니다. 세포 배양 배지의 2밀리리터를 포함하는 35 밀리미터 플레이트로 세포 현탁액1 밀리리터를 전달하여 배지가 1센티미터의 높이에 도달하는지 확인합니다. 도금 된 세포를 이차 용기로 옮겨 오염 위험을 줄이고 유틸리티 카트의 용기에 있는 세포를 조사 시설로 가져와 세포를 조사합니다.조사 하루 전에 세포 배양 후드에서 작업하는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포 배양판에서 부착된 세포주까지 DMEM 배지를 제거합니다. 그런 다음 멸균 PBS의 5 밀리리터로 세포를 씻어 잔류 배지를 헹구는 것입니다. 트립신-EDTA 1밀리리터를 문화 요리에 넣고 배양 판을 부드럽게 기울여 전체 접시가 덮여 있는지 확인합니다.실온에서 5분 동안 배양한 후, DMEM 미디어의 3밀리리터로 트립신-EDTA 반응을 담금질한다. 5 밀리 리터 파이펫을 사용하여 15 밀리리터 원심분리기 튜브, 원심분리기로 세포를 수집한 다음 원고에 설명된 바와 같이 세포를 배양합니다. LINAC의 콘솔 소프트웨어를 사용하여 이전에 준비된 이러한 세포를 조사하려면 가속기 갠트리및 콜리메이터를 0도로 설정하고 x 와 y 턱을 대칭 5xx의 대칭 5로 열고 멀티리프 콜리메이터를 철회합니다.처리 소파에 물 등가물 물질의 적어도 5 센티미터를 추가하고 LINAC 십자선의 중심에 조사 할 세포 접시를 배치합니다. 세포를 최대 용량의 깊이에 최대 용량의 깊이에 배치 약 1.5 센티미터 의 6 메가 볼트 X 선 빔과 접시 위에 물 등가 물질의 추가 1 센티미터를 추가. 앞포인터를 LINAC의 머리에 부착하고 빌드업 재료의 표면에 닿을 때까지 확장합니다.소스에서 축적 표면까지의 거리가 100cm가 될 때까지 테이블 높이를 조정합니다. 치료 금고를 떠나 다른 모든 개인이 떠났는지 확인하십시오. 방에 다른 셀이 없는지 확인한 다음 볼트 도어를 닫습니다.콘솔에서 분당 필드 크기, 모니터 장치 및 모니터 유닛을 확인한 다음 방사선 셀에 빔을 활성화합니다. 신경교종 줄기 와 같은 세포의 3개의 견본은 이 프로토콜을 사용하여 준비하고 조사 후에 24 시간을 집합했습니다. 거기 세포 주기 단면도계산 하 고 세포 주기의 다른 단계에서 세포의 백분율로 표시 되었다.G2 세포 주기 체포는 비조사 대조군 세포와 비교하여 표준 투여량 비율 또는 추가 고용량 비율로 신경교종 줄기 세포의 조사 후에 관찰되었습니다. 올바른 복용량을 전달하기 위해, 그것은 1 센티미터에 도달 있는지 확인하기 위해 문화 접시에서 미디어의 높이를 측정하는 것이 가장 중요합니다. 이 절차에 이어 면역염색, 서부 블롯 및 세포 주기 분석과 같은 다른 생물학적 분석이 수행될 수 있다.이 절차는 연구원에게 임상적으로 관련 된 복용량 및 복용량 속도 설정을 제공 하기 때문에, 그것은 많은 세포 배양 기반 모델에 방사선 효과 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.

use-linear-accelerator-for-conducting-vitro-radiobiology

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

뇌종양 환자는 정기적으로 두개골 방사선 치료를 받아야하고, 쇠약인지 장애에 도움이 치료는 종종 결과를하면서. 이 심각한 해결되지 않은 문제는, 현재도 임상을 일으키하지 않으며 방사선 유발인지 감소의 복구를 위해 줄기 세포 기반 요법을 고안하기 위해 노력을 주도하고 있습니다.

두개골 방사선 치료에 의한인지 기능 장애의 회복을위한 세포 이식 전략을 줄기

성인 태생 포유류의 신경 세포의 기능은 조사의 활성 영역 남아있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생을 억제한다. 컴퓨터 단층 촬영 유도 초점 조사 (CFIR)를 사용하여, 특정 신경 전구 인구 입체 해부 타겟팅 이제 성인 신경의 기능적인 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다.

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

방사선 치료 장치의 수가 증가하고 증가 맞추어 분획 당 고용량을 허용 종양으로 매우 작은 빔을 통해 선량 전달의 장점을 제공한다. 다양한 검출기는 이러한 작은 필드의 선량에 사용될 수있다. 본 연구에서, 이온의 재결합 효과 정위 방사선 치료 시스템을 사용하여, 액체의 이온화 챔버로 조사된다.

액체 이온화 챔버의 재조합 효과의 특성은 Radiosurgical 가속기의 선량 측정에 사용

유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

과거에 작은 동물 조사 대상 잘 delineated 종양 볼륨 수 없이 일반적으로 수행 되었다. 목표는 쥐에서 인간 세포종의 치료를 모방 했다. 작은 동물 조사 플랫폼을 사용 하 여, 우리는 MRI 기반 3D 등각 방사선 조사 전 임상 설정에서 애완 동물 기반 하위 볼륨 증폭을 수행.

애완 동물 및 MRI 유도 세포종 쥐 모델의 방사선 마이크로 irradiator를 사용 하 여

만능 줄기 세포 유래 teratomas 위한 치료 전략에 대 한 연구는 줄기 세포 치료의 임상 번역 중요 합니다. 여기, 우리 첫째, 쥐에서 그리고, 선택적으로 대상 줄기 세포 유래 teratomas를 생성 하 고 생체 조건 작은 동물 irradiator를 사용 하 여 이러한 종양을 치료 하는 프로토콜을 설명 합니다.

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이 문서에서는 저에너지 X선 장비를 사용하여 세포 조사를 위한 새로운 dosimetry 프로토콜을 설명합니다. 측정은 가능한 한 실제 세포 조사 조건을 시뮬레이션하는 조건에서 수행됩니다.

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방사선 dosimetry는 전임상 실험의 정확도를 향상시키고 전달된 방사선 량이 임상 파라미터와 밀접하게 관련되도록 하는 기술을 제공합니다. 이 프로토콜은 적절한 실험 설계를 보장하기 위해 전임상 방사선 실험 중 각 단계에서 취해야 할 조치를 설명합니다.

LQ α 및 β 매개 변수, 방사선 투하 스키마 및 생체 내 용량 증착평가를 위한 조사기 및 시메트리

여기서는 정확성과 효율성을 최적화하기 위해 사내에서 개발한 알고리즘을 사용하여 쥐 교모세포종 모델에서 전임상 양전자 방출 단층 촬영 기반 방사선 요법을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

작은 동물 방사선 연구 플랫폼을 사용하여 교모 세포종 쥐 모델에서 양전자 방출 단층 촬영 기반 용량 페인팅 방사선 요법

형광-활성화된 세포 분류-방사성리간드 처리된 조직(FACS-RTT)은 알츠하이머병에서 세포 규모로 18kDa 트랜스로케이터 단백질 또는 세로토닌 5HT2A-수용체 발현의 역할을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 TgF344-AD 래트 모델에서 FACS-RTT의 생체외 적용을 기술한다.

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

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체외 방사선 생물학 실험을 수행하기위한 선형 가속기 의 사용

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