Name: 제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 수정체 핵 현지화 및 조직 무결성 평가 방법을 Danio rerio를 이용하여 수정체 발달과 백내장 예방 연구에 활용할 수 있는 정량적 분석 기술입니다.

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우리는 우리의 자금 출처를 인정 하 고 싶습니다: NIH R01 EY05661에 게 J. H, 네 스 Gehring aqp0a/b 이중 돌연변이와 zebrafish를 생성 하는 것을 돕기 위한, 박사 다니엘 Dranow transgenics의 세대에 이르는 논의를 위해, 브루스 박사 블 룸 베르크와 박사는 하 부 현미경 사용을 위한 연구소와 미 건 스미스 박사는 통계 분석에 도움을 주었습니다.

이 연구에서 사용 되는 동물 프로토콜은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대 한 ARVO 문을 준수 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 캘리포니아 대학의 어바인.

1. 제 브라 생선 축산 및 안락사
<ol><li>표준 실험실 조건에서 제 브라 피시 (AB 스트레인)를 올리고 유지 합니다12. 배아 배지 (EM)12에서 배아를 올립니다. 0.003% PTU를 20-24에서 EM에 추가 합니다 (프림-5 단계 이전) 배아에서 색소 형성을 방지 하기 위해 배아12 단계에서 이미징에 사용됩니다. 14 dpf까지 라이브로 티파이의 식단에 6-30 일 후에 (dpf)에서 애벌레를 인상 하 고, 14 d f f12후에 artemia를 살고 있습니다. 주의: PTU는 매우 독성이 있습니다.</li>
	<li>
터치에 응답 하지 때까지 트리 네이 어를 사용 하 여 생선 마 취.
	<ol>
<li>400 mg의 3-아미노 벤조산 산 데이 티 레스터의 2.1 mL를 사용 하 여 트리 네 스톡을 준비 하 고 ddH2의 100 Ml에 ph 7.0에 적응 하 여-20°c에서 보관 하십시오. 주의: 트리 레인은 독성이 있습니다.</li>
		<li>유 충/성인 또는 EM의 태아 마 취에 대 한 (0.0165%에서 트리 네이의 최종 농도)에 있는 탱크 물 100 mL의 트리 네 스 스톡 4.2 mL를 희석 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 배아 및 애벌레의 고정
참고: 면역 조직 화학 프로토콜은 이전에 출판 된 물질7로부터 적응 시켰다.
<ol><li>Dechorated 배아 또는 유 충을 로커에서 4 ° c에서 하룻밤 동안 인산 완충 식 염 수 (PBS)에서 4%의 파라 포름알데히드 (PFA)에서 2 주 후에 수정 합니다. 주의: PFA는 가연성 이며 발암 성입니다.</li>
	<li>PBS에서 10 분 동안 배아를 3 회 세척 하 고 4°c에서 10% 트리톤 및 1% DMSO (PBS-T)로 투과 합니다. 주의: DMSO는 독성, 섭취 또는 피부 흡수에 의해 유해, 피부를 통해 유해 물질을 운반 하 고, 가연성 이다. 트리톤은 독성, 부식성 및 수생 환경에 유해 하다.</li>
</ol>3. Larval과 성인 제 브라 피쉬 렌즈의 해 부
<ol><li>6 dpf 애벌레에서 물고기를 삼으 며 터치에 응답 할 때까지 하지만 여전히 강한 심장 박동을 보여주는 생선 마 취. 준비13에 대 한 쉴 링 (2002)에 따라 생선 표준 길이 측정 합니다.</li>
	<li>
미세 해 부가 위를 사용 하 여 즉시 눈을 소비 하 고 PBS에 하 절 접시에 넣습니다 (그림 2 는 성인 눈을 위해 표시 됨).
	<ol>
<li>렌즈 디스 섹션에 대 한 실리콘으로 채워진 사용자 정의 35 mm 접시를 확인 합니다. 실리콘이 설정 되 면, 해 부 동안 성인 눈/렌즈를 고 정화 하기 위해 깊은 직경 2-3 mm 및 0.5 mm 주위에 디벗을 소비 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성인 제 브라 피시 렌즈의 해 부
	<ol>
<li>성인 눈을 PBS로 채워진 다이 버 후부의 접시에 올려 놓으십시오. 광학 디스크를 통해 &lt; 45 ° 각도로 집게를 삽입 하 여 눈을 움직이지 않게 합니다. 렌즈를 닉 이나 압축 하지 않도록 주의 하십시오. 해 부가 위를 가진 모양 체 구역에 광학 디스크에서 망막과 공 막를 통해 2 개 또는 3 개의 반경 절 개를 만드십시오.</li>
		<li>꽃 꽃잎 처럼 망막과 공 막를 벗 겨 눈, 각 막 측면을 뒤집습니다. 망막과 집게로 조직을 멀리 당기는 동안가 위 평평한 쪽으로 공 막 및 각 막의 조작을 통해 간접적으로 렌즈를 고정 시킵니다. 조심 스럽게 렌즈에서 여분의 조직을 손질. 참고: 지속적으로 건강 한 렌즈를 얻기 위해 신중 하 게 분해 하는 것이 중요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
애벌레 제 브라 피시 렌즈의 해 부
	<ol>
<li>PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후부를 올려 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용 하 여 망막과 공 막를 통해 방사형 절단을 하 고 다른 텅스텐 바늘 또는 집게로 눈을 움직이지 않게 합니다. 참고: 렌즈가 손상 되지 않도록 주의 하십시오.<ol>
<li>와이어 팁을 10(/w) NaOH로 중단 하 고 저전압 교류14를 적용 하 여 2cm 길이의 0.1 mm 텅스텐 와이어의 끝을 선명 하 게 합니다. 분 젠 버너를 사용 하 여 유리 끝을 녹여 파스퇴르 피 펫에 바늘을 고정 하십시오. 참고: 대체 미세 해 부 도구를 사용할 수도 있습니다. 주의: NaOH는 부식성입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>바늘의 무딘 측면으로 해리 된 눈에서 렌즈를 부드럽게 스 쿱 하 고 부착 된 조직을 조심 스럽게 당겨 빼냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 하 부 렌즈 고정
<ol><li>실 온 (RT)에서 24 시간 동안 1.5의 PFA에서 하 부 렌즈를 즉시 수정 합니다. 10 분 동안 PBS에서 세 번 렌즈를 세척 하십시오.</li>
	<li>전체 마운트 분석 또는 저온 냉동 보호를 위한 투과 렌즈 (섹션 8 참조)<ol>
<li>4 ° c에서 밤새 PBS-T에 투과 렌즈.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 렌즈 면역 조직 화학
<ol><li>Phalloidin-알 렉 사 플 루 또는 546 (1:200) 및 세포 핵을 dapi와 함께 배양 하 여 고정 배아/larval 또는 성인 렌즈의 막에 PBS-T를 4°c에서 하룻밤 동안. 주의: DAPI는 피부와 눈 자극입니다.</li>
	<li>PBS-T로 3 회 각각 10 분간 씻으십시오. 클리어 티슈는 각각 RT에서 1 시간 이상, 또는 4°c에서 밤새 30%, 50% 및 70% 글리세롤 인 PBS에서 인큐베이션 하 여.</li>
	<li>70%의 글리세롤 인 마이크로 웰 (v/v)에서 유리 바닥 35 mm의 글 리세 린으로 생선을 평평 하 게 하 고 똑바로 뚜껑을 덮고 가능한 한 접시에 놓습니다. 더 젊은 물고기의 경우, 약간의 전방-측면 기울기는 렌즈 봉합이 커버 슬립과 평행 하도록 방향을 지정 하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
</ol>6. 생체 내 형질 전환 라인을 이용한 Zebrafish 전방 렌즈 봉합 사 분석
<ol><li>Tol2 키트15를 사용 하 여 Tg 를 생성 합니다. Tol2 transposable 요소 시스템 (15 )은 매 플 (crystallin) 프로모터의 300 bp로 구동 되는 구성의 안정한 통합을 가능 하 게 하며,이는 caax 서 열에의 한 멤브레인에 테더 링 된 인간 β b1-(16 )의 발현을 가져온다 특히 렌즈 섬유 세포 막에. 참고: 이 구조 (ID: 122451를 구입할 수 있습니다.<ol>
<li>주입의 아침에, 주입 혼합물을 준비 하 고 얼음에 유지. RNase 및 DNase가 없는 H2o를 포함 하는 10 µ의 최종 부피에 도달 하기위해, 추가: 1.5 µ의 호β B1외침: mAppleCAAX DNA 구조 50 ng/µ l-[0.375 pg/최종 주입] 1.5 µ l Tol2 transposase mRNA에서 300 ng/µ l (Tol2 키트)15 [15-30 pg/ 최종 사출), 1%의 페 놀 적색 지시약이 1µ/최종 사출이 하에 있습니다.</li>
		<li>1 세포 단계 배아에 주입 혼합물의 50-100 pL을 주입 하십시오12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 dpf에서 mApple 포지티브 렌즈를 사용 하 여 배아의 빈도를 측정 하 여 F0 주입 된 배아의 변환 효율을 측정 합니다. 참고: 이 방법을 사용 하 여 &gt; 80%의 변환 효율을 기대할 수 있습니다. F0 모자이크는 개별 세포의 막 형태학의 상세한 분석을 허용 합니다. 모자이크의 다양 한 수준은 하나 또는 작은 세포 그룹의 형태학을 이미지 할 수 있습니다, 더 많은 글로벌 렌즈 표현은 생체 내에서렌즈 봉합 같은 멀티 단 구조를 분석 할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 섬유 세포 막에 라벨 안정적인 라인을 생성 하는 모자이크 물고기 F0 outcross. 생식 계열에 통합 된 이식 유전자를 가진 F0 설립자는 형질 전환 선으로 유지 될 수 있는 안정 되어 있는 통합을 가진 자손을 생성할 것입니다.</li>
</ol>7. 생체 내 형질 전환 선을 이용한 제 브라 피시 전방 렌즈 봉합 사 분석
<ol><li>3 개의 dpf 또는 성인용 모자이크 또는 안정한 형질 전환 어류를 마 취 하 고 유리 바닥 마이크로 웰 접시의 커버 슬립에 대 한 평평한 눈과 함께 트리 네이 어로 1% 낮은 용융 아가 로스 (LMA)를 마운트합니다.<ol>
<li>100 mL (메 틸 렌 블루 불포함)에서 LMA 1g을 녹여 1% LMA를 만듭니다. 4°c에서 15 mL 주식으로 장기간 보관 하십시오. 각 튜브가 사용 될 때까지 전자 렌지에서 재고를 녹 인 후 42 ° c로 보관 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMA가 설정 되어 있는 경우에는 성인을 위한 트리 네이로, 또는 탱크 물과 함께 최대 6 dpf로 물고기를 덮으 십시오.<ol>
<li>메 틸 렌 블루 또는 탱크 물 없이 EM 5 mL를 혼합 하 여 트리 네 스톡의 250 µ L과 PTU의 7 µ L을 이미징 하면 PTU가 생선을 처리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 렌즈 저온 절편 및 면역 조직 화학
<ol><li>냉동 보호 고정 배아 또는 성인용 렌즈는 PBS에 10% 자당을 넣고, 각각 RT에서 1 시간 동안 20% 자당 (또는 4°c에서 하룻밤) 및 4°c에서 30% 자당에서 하룻밤 동안.</li>
	<li>10 월에 티슈를 기본 몰드에 내장 하 고 12-14 µm에서 10 월 제 빙 기를 사용 하 여 척에 고정 한 다음 슈퍼 프 로스트/플러스 현미경 슬라이드에 수집 합니다. 슬라이드 워 머에서 10 분 동안 슬라이드에 따뜻한 섹션은 ~ 35 ° c로 데워 졌습니다.</li>
	<li>각 10 분 동안 PBS로 세 번 섹션을 씻으십시오. DAPI (1:1000) 또는 WGA-알 렉 사 밀가루 594 (1:200)를 사용 하 여 Phalloidin-알 렉 사 밀가루 546 (1:200)를 사용 하 여 섹션에 레이블을 지정 하면 3 개의 PBS 세척이 이어집니다. 안티 페이드 장착 매체로 마운트, 그리고 매니큐어와 인감 커버 슬립.</li>
</ol>9. 이미징
<ol><li>공초점 현미경으로 이미지를 획득 합니다. 전방에서 후방 렌즈 극 까지의 특정 지역에서 60xn/1.2의 물 침수 목적 또는 유사한 방법으로 z 스택 또는 광학 슬라이스를 획득 합니다. 다음 수집 설정을 사용 합니다. 1.2 561 nm 레이저를 사용 하 여 통풍 디스크, phalloidin-알 렉 사 밀가루 546 또는 mApple에 대 한 텍사스 레드 필터, 또는 DAPI에 대 한 UV 필터와 405 레이저.</li>
	<li>렌즈에 깊이 있는 신호 손실을 상쇄 하기 위해 z-강도 레이저 파워를 교정 합니다. 이것은 고정 되 고 살아있는 3 개의 dpf 배아의 후방 극에 강한 신호를 허용 하 고, 성인 물고기 렌즈에 있는 적도 광학적 인 조각에 있는 강한 신호를 가능 하 게 합니다.</li>
	<li>이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 컴파일하고 봅니다.</li>
</ol>10. 전방 후부 축의 렌즈 핵 국 소화 측정
<ol><li>초점 평면에 평행 하 게 기둥과 봉합이 있는 커버 글래스 바닥이 있는 35 mm 접시에 PBS로 축방향으로 신선 하 게 절제 된 렌즈를 정위 시킵니다. 렌즈 핵을 식별 하기 위해 렌즈 피 질과 렌즈 핵의 계면에서 일반적으로 발생 하는 굴절률의 차이를 찾으십시오. 참고: 건강 한 야생 형 성인 렌즈는 매우 투명 하 여 렌즈 봉합과 핵을 보거나 렌즈 방향을 결정 하기가 어렵습니다. 이 경우, 렌즈 캡슐에 집게와 약간의 닉은 작은 손상을 초래 하 여 봉합 사 및 렌즈 핵이이 측정을 위해 렌즈의 방향을 정하기 위해 약 10 분 내에 명백 하 게 만듭니다. 그러나 현재 손상 된 렌즈는 다운스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 없게 됩니다.</li>
	<li>렌즈가 부착 된 해 부 현미경을 사용 하 여 DIC 광학의 유무에 관계 없이 밝은 필드 조명에서 렌즈 핵을 사용 하 여 렌즈의 이미지를 촬영 합니다. 보정을 위해 동일한 배율로 마이크로미터를 이미지 합니다.<ol>
<li>라이브 뷰 버튼을 클릭 하 고 노출 설정을 조정 하 여 렌즈 핵과 렌즈 주변부를 시각화 하 고 스냅 샷 버튼을 클릭 하 여 이미지를 촬영 합니다. Tif 파일로 저장 합니다.</li>
		<li>이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 획득 한 렌즈 이미지를 보정 합니다. 직선 도구를 선택 하 고 마이크로 미터 이미지에 알려진 길이의 선을 그린 다음 분석 | 배율을 설정 합니다. 알려진 거리 단위를 입력 하 고 ' 전역 ' 교정을 선택한 후 확인을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전방 극 (a-r)에 대 한 렌즈 핵의 중심 거리를 측정 한다.<ol>
<li>이미지 처리 소프트웨어의 직선 도구를 사용 하 여 렌즈 핵의 이미징 중심에 축 방향으로 선을 그립니다. 이 라인의 중심을 렌즈 핵의 중심으로 가져가 세요.</li>
		<li>이 점에서 렌즈의 전방 극까지 다른 선을 그리고 ' 분석 ' 메뉴에서 ' 측정 '을 선택 하 여 거리 (a-r)를 측정 하 고 렌즈의 반지름 은 렌즈의 중심에서 중심 까지의 거리 입니다. 핵.</li>
		<li>전방에서 후방 극 까지의 다른 선을 그리고 렌즈 지름 (2a)으로이 거리를 측정 합니다. ' 결과 ' 창에서 이러한 길이를 복사 하 고 스프레드시트나 통계 프로그램으로 전송 합니다. 참고: 렌즈 핵의 중심에서 렌즈의 중심까지 측정 하는 것 보다 핵의 중심에서 전방 극까지 정확 하 게 측정 하는 것이 더 쉽습니다. 이 측정은 렌즈 핵의 중심에서 렌즈의 중심 까지의 거리를 보고 하는 단계 10.3.5의 수식에 의해 변환 된다. 배아 핵이 명백 하다 하더라도, 항상 측정을 위해 성체 핵을 사용 하십시오.</li>
		<li>직경을 2로 나누어 렌즈 반경 a를 계산 합니다.</li>
		<li>렌즈 반경에 대하여 렌즈 핵 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59528/59528eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> 의 정규화 된 국 소화 인 것과 같이, r/a를 계산 한다. 주: 전방 극에 가깝게 배치 된 핵의 경우 r/a 는 0.0 &gt; 되 고 중앙 집중화 된 핵은 0.0의 r/a 를 갖게 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제 브라 피시 개발 시에 렌즈 핵 현지화의 변화를 결정 하기 위해 표준 길이의 함수로 서 정규화 된 축방향 핵 측정의 로그를 그래프로 작성 합니다.</li>
</ol>

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우리는 공개 하지 않습니다.

제 브라 피시 렌즈 형태학의 분석은 돌연변이 체의 표현 형을 이해 하는 초기 단계, 또는 안구 렌즈의 생물학을 연구 하기 위한 약리학 적 개입의 효과입니다. 렌즈 봉합, 대뇌 피 질 섬유 세포 형태학 및 렌즈 핵의 측면을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 접근법은 시험관 내 및 생체 내에서의 조합 ( 표 1과 비교 하 여) 이다. 시험관 내 방법은 외부 피 질 세포 형태학의 더 큰 세부 사항을 허용 뿐만 아니라, 성인 렌즈의 후부 봉합에 대 한 액세스.
생체 내 분석은 형질 전환 마커를 사용 하 여 가능 하다. 여기서 소개 하는 이식 유전자는 기존의 Q01 제 브라 피시 라인과 비교 하 여 렌즈 멤브레인 특유 이며,이는 렌즈 멤브레인을 라벨링 하는 동안 무 축 삭 세포를 포함 한 눈의 다른 세포 타입에 라벨을 부착 하는 동시에 해석을 복잡 하 게 합니다.<sup c...

제 브라 피쉬는 포유류 렌즈에 대 한 해부학 적 유사성, 유전 및 약리 조작의 상대적인 용이성, 배아 눈 발달 속도, 작은 크기 및 투명성으로 인해 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 훌륭한 모델입니다 초기 단계에서 생체 내 이미징에 대 한 허용. 여기에 설명 된 방법은 조직 무결성에 초점을 맞춘 배아 및 성인 단계에서 zebrafish 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 체 외 및 생체내에서의 대뇌 피 질 막 형태학 및 렌즈 핵 위치의 위치 전방-후부 축 ex 생체 내. 이러한 방법은 렌즈 개발 및 생리학의 기능적 연구를 위한 출발점으로 서, zebrafish의 렌즈 표현 형에 대 한 역 유전 화면 역할을 합니다.
이미징 제 브라 피시 렌즈 형태학
아쿠아 포린 0(AQP0)은 가장 풍부한 렌즈 멤브레인 단백질 이며 포유류의 여러 필수 기능으로 인해 렌즈 개발과 선명도 모두에 중요 합니다. 제 브라 피쉬는 두 개의 Aqp0s (Aqp0a 및 Aqp0b)를가지고 있으며 배아 및 성인 렌즈 모두에서 기능 상실을 분석 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 연구 결과에 따르면aqp0a-/-돌연변이 체는 전방 봉합 사의 불안정성으로 인해 전방 극성 불투명도를 개발 하 고 aqp0a/b 이중 돌연변이는 핵 불투명도1을 개발 합니다. AQP0는 물 수송2, 접착 력3,4, 세포 골격 고정5 및 굴절률 구배6의 생성에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으 나 이러한 연구는 크게 시험관. 제 브라 피쉬는 살아있는 렌즈의 형태와 기능에 영향을 미치는 기능 상실 또는 Aqp0a 또는 Aqp0b의 교란 기능에 대해 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공 합니다. 개발 중에 렌즈 셀 형태학 및 조직 무결성을 평가 하기 위해, 우리는 배아 및 성인 렌즈에 사용 하기 위한 시험관 내 면역 세포 화학적 방법7 을 수정 하 고, 생체 내에서이 과정을 모니터링 하기 위해 트랜스 젠 시를 생성 .
면역 조직 화학적 분석은 혈장 막의 구조 및 수 중 무결성을 전체 고정 배아 및 성인 렌즈에서 수행 하였다. 제 브라 피시 렌즈는 매우 작은 (렌즈 직경은 태아에서 ~ 100 µm 및 성인에서 1 mm까지) 그들의 포유류 대조 군과 비교 하 여 점 봉합 사 (8)가 자주 저온 단면에서 포착 됩니다. 따라서 전체 렌즈는 조직 무결성을 분석 하는 데 필수적입니다. 전방 봉합 사 형성 및 정밀한 렌즈 셀 구조의 이미징에 대 한 생체 내 분석을 위해, 우리는 특히 렌즈 멤브레인을 라벨링 mapple을 표현 transgenics를 생성 했습니다.
렌즈 멤브레인 트랜스 젠 시의 라이브 이미징의 장점: 1) 고정 아티팩트를 피하고, 2) 타임 랩 스 영화의 동적 형태학 적 변화를 연구 하 고, 3) 이전 이벤트를 나중에 상호 연관 시킬 수 있는 종단 연구 활성화 고기. 홍 채의 색소 침착은 일반적으로 렌즈 주변부의 선명한 이미징을 방지 합니다. 1-페 닐 2 티 오 요소 (PTU)의 첨가 전에 프리모 르 디 아-5(프림) 단계9 는 멜 라 닌 생성 및 눈 색소 침착을 약 4 일 후에 (dpf)까지 방지 한다. 그러나 4 dpf 이후, 렌즈 주변부는 생체 내, 특히 구형 단계에서 가려집니다. 또한 렌즈 자체의 밀도는 후방 극의 이미징을 모호 하 게 합니다. 따라서 렌즈 주변부의 형태학을 연구 하거나 후부 봉합을 하 여 4 dpf 후에 렌즈를 절제 하 고 고정 시켜야 합니다.
제 브라이 선 형질 전환 체는 생체 내10 의배아 렌즈 막 구조를 분석 하는데 사용 되어 왔다. 상기 Q01 형질 전환 체는 렌즈 섬유 세포 (11)에서 DF4 pax6 증강 요소 ubiquitously의 EF1α 프로모터 및 hexamer에 의해 구동 되는 , Gap43의 멤브레인 표적화 서 열에 융합 된 시안 형광 단백질을 표현 한다. Q01 에는 망막의 무 축 삭 세포를 포함 한 추가적인 렌즈 표현이 있어 주요 관심사 인 경우 배경 신호를 추가 합니다. 우리는 여분의 렌즈 모양 신호를 피하는 것을 목표로 하 여 렌즈에 특별히 멤브레인 테더를 표현 하는 새로운 트랜스 제 닉 라인을 개발 했습니다.
렌즈 핵 현지화
우리는 렌즈 핵이 애벌레 zebrafish의 초기 전방 위치에서 성인 렌즈의 전방 후부 축의 중앙 위치로 이동 한다는 것을 발견 했습니다. 이러한 고 굴절 렌즈 핵의 위치 변화는 제 브라 피시 렌즈 광학1의 정상적인 발달에 요구 되는 것으로 생각 된다. 우리의 방법은 렌즈 반경과 관련 하 여 렌즈 핵 중앙 집중화를 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 Aqp0a가 렌즈 핵 중앙 집중화1에 필요 하다는 것을 보여 주었고,이 간단한 방법은 제 브라 피쉬 모델에서의 렌즈 및이의 광학 특성의 발달 및 생리학에 대 한 다른 연구에도 적용 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>주의 &ndash; 매우 독성이 강한</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 157-4</td><td>주의 &ndash; 건강 위험, 가연성</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>목표 및 챔버 온도가 -21로 설정됨 & 도그; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>주의 &ndash; 눈과 피부에 자극적인</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>주의 &ndash; 가연성, 피부 침투&nbsp;</td></tr><tr><td>일회용 기본 금형</td><td>VWR Scientific</td><td>15154-631</td><td></td></tr><tr><td>일회용 파스퇴르 유리 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 집게</td><td>Dumont & Fils</td><td></td><td>Keep 펜치 날카롭게 만들기</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 소금 (트리카인)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>주의 - 독성</td></tr><tr><td>유리 바닥 마이크로웰 접시 (35mm 페트리 접시, 14mm 마이크로웰, #1.5 커버글라스)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>hu&beta; B1cry:mAppleCAAX DNA 구성</td><td>Addgene</td><td>ID:122451</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband, NIH</td><td>v1.51n</td><td></td></tr><tr><td>Low Melt Agarose (LMA)</td><td>Apex</td><td>902-36-6</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td>V 4.5</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus&nbsp; 모델 2.1.1.183 컨트롤러 Olympus</td><td>Corp</td><td>DP70</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 현미경&nbsp;</td><td>Olympus Corp</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Flour 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22283</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 지시약 (1% w/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>5725-16</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>포토샵</td><td></td><td>Adobe CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>포토샵 소프트웨어</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>계획 Apo 60x/1.2 WD 목표</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전원 소스</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>MTr 22</td><td>또는 동등한 전원&nbsp;</td></tr><tr><td>슬라이드 워머 모델 번호 26020FS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-594</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 비드</td><td>Fisher Scientific</td><td>S612-3</td><td>주의 - 눈과 피부, 표적 장기 - 호흡기, 금속 부식성</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 Dow Corning</td><td>World Prevision Instruments</td><td></td><td></td>SYLG184</tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>주의 &ndash; 독성, 수생 환경에 유해, 부식성</td></tr><tr><td>Vannas 미세 해부 가위</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1346</td><td>날카롭고 날카로운 직선 팁</td></tr><tr><td>Vectashield 퇴색 방지 mouting 매체</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>밀 배아 Agglutinin (WGA) - Alexa Flour-594</td><td>Life Technologies</td><td>W11262</td><td></td></tr></tbody></table>

제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Zebrafish는 유전 조작 및 생체 내 이미징에 유일 하 게 적합 하며 역 유전 연구와 생체 내 이미징에 대 한 transgenics 생성을 위한 점점 더 인기 있는 모델입니다. 이러한 독특한 기능은 제 브라 피시 안구 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 이상적인 플랫폼을 만든다. 우리의 최근 발견 된 아쿠아 포린-0, Aqp0a, 전방 렌즈의 안정성을 위해 요구 되는 봉합 사, 뿐만 아니라 렌즈 핵의 시프트에 대 한 렌즈 중심을 나이에 우리는 zebrafish 렌즈의 특성을 분석 하는 데 특히 적합 한 도구를 개발 하기 위해 우리를 이끌었다. 여기에서 우리는 조직 학적 분석, 면역 조직 화학 및 이미징을 위해 준비 하기 위해 애벌레 및 성인용 렌즈 모두에 적용 할 수 있는 렌즈 해 부에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 우리는 렌즈 봉합 사 무결성 및 대뇌 피 질의 세포 형태학의 분석에 집중 하 고 유전적으로 새로운 형질 전환 zebrafish 라인에 의해 가능 하 게 만든 렌즈 형태학의 생체 내 이미징에서 얻은 데이터로 해 부 렌즈에서 생성 된 데이터를 비교 인코딩된 형광 표식입니다. 광 축에 수직인 해 부 렌즈의 분석을 통해 전방 후부 축을 따라 렌즈 핵의 상대적인 위치를 정량화 할 수 있습니다. 렌즈 핵을 초기 전방 위치에서 중심으로 이동 하는 것은 성인 제 브라 피시의 일반 렌즈 광학에 필요 합니다. 따라서, 렌즈 핵 위치를 정량적으로 측정 하는 것은 광학적 특성과 직접적으로 관련이 있습니다.

성인 제 브라 피쉬 아이 해부학은 포유류와 밀접 하 게 유사 합니다 (그림 1a). 제 브라 피쉬와 포유동물 눈의 차이에도 불구 하 고, 모양 체 체 (17) 대신에 모양 체 지 대를 갖는 것은 광학적 성질 (18)의 차이, 배아 발달 동안 형태 형성에 있어서의 차이 (19), 제 브라 피시 아이는 눈 발달 및 이해 안과 질환20,22를 연구 하는 훌륭한 모델입니다. 간단한 상피 라인은 렌즈의 전방 극, 적도에서 확산, 신장, 및 섬유 세포로의 분화의 수명이 긴 과정을 겪는 다. 성숙한 섬유 세포 (<strong class="...

이러한 프로토콜은 피 질 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 고정 및 라이브 렌즈에서 제 브라 피시 렌즈 봉합 사의 구조적 완전성을 측정 하 고, 전방 후부 축을 따라 제 브라 피시 렌즈 핵의 위치를 측정할 수 있다.

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

우리의 프로토콜은 렌즈 발달과 생리학의 기능적 연구와 제브라피시의 렌즈 표현형의 역유전 적 스크리닝을 위한 출발점을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 체외 및 제브라피시 렌즈 막 형태에 대한 생체 내 분석을 교개하고 제브라피시 렌즈 광학의 개발을 정량화하는 새롭고 간단한 방법을 제공합니다. Zebrafish 렌즈 형태와 광학을 분석하면 렌즈 개발, 정상적인 생리학 및 병리학을 제어하는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.이러한 통찰력은 백내장을 지연하거나 방지하는 기능으로 이어질 수 있습니다. 비대칭 국소화 된 렌즈 핵의 제브라피 이외의 종에 있는 보고가 없었습니다. 렌즈 봉합사를 식별하는 것은 렌즈를 올바르게 방향을 지정하여 핵 국소화를 측정하는 데 중요합니다.트리카인으로 충분한 식기 처리가 확인된 후, 미세 절부 가위를 사용하여 성인 또는 유충 얼룩말에서 두 눈을 즉시 소비하고 PBS로 채워진 실리콘 해부 몰드가있는 35 mm 의 맞춤형 페트리 접시에 두 눈을 배치하십시오. 성인 얼룩말물고기에서 렌즈를 수확하려면 눈 뒤쪽 면을 위로 올려 놓고 광학 디스크를 통해 45도 미만의 각도로 집게를 삽입합니다. 해부 가위를 사용하여 망막과 클클레라를 통해 망막과 경각증을 통해 정광된 눈의 섬모 영역까지 두 개 또는 세 개의 방사형 절개를 하고 꽃잎처럼 망막과 경감을 벗깁니다.눈을 반전시키고 각막면을 위로 하고 가위의 평평한 면을 사용하여 포셉을 사용하여 렌즈를 밀착한 후 렌즈에서 여분의 조직을 조심스럽게 다듬어 서 스클레라와 각막의 조작을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시합니다. 애벌레 얼룩말 렌즈 수확을 위해, PBS의 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후방 측면을 배치하고 다른 바늘이나 집게로 눈을 고정하는 동안 망막과 sclera를 통해 방사형 컷을 만들기 위해 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여, 부드럽게 다른 바늘이나 집게로 눈을 고정한 다음 부드럽게 분리 된 눈의 무딘 측면과 함께 분리 된 눈의 렌즈를 스쿱합니다. 전방 후방 축 렌즈 핵 국소화를 측정하기 위해 PBS에서 갓 익힌 렌즈를 35mm 접시에 넣고 표지 유리 바닥과 초점 평면과 평행하게 향합니다.렌즈 핵을 식별하려면 일반적으로 렌즈 피질 및 렌즈 핵의 인터페이스에서 발생하는 굴절률의 차이를 찾습니다. 렌즈 봉합사가 명백하지 않은 경우 렌즈 캡슐에 집게로 약간 핥으면 봉합사와 렌즈 핵이 드러나므로 측정을 위해 렌즈를 방향을 지정하는 데 도움이됩니다. 카메라를 장착한 해부 현미경의 무대에 접시를 놓고 렌즈 핵을 밝은 시야 조명 아래 또는 차동 간섭 대비 광학으로 이미지화합니다.교정을 위해 동일한 배율 아래 마이크로미터를 이미지화하고 Live View를 클릭합니다. 스냅샷을 클릭하여 이미지를 가져오고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 획득한 렌즈 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램에서 보정하려면 직선 도구를 선택하고 마이크로미터 이미지에 알려진 길이의 선을 그립니다.스케일 분석 및 설정을 클릭하고 알려진 거리와 단위를 입력한 다음 전역 보정을 선택하고 확인을 클릭합니다. 렌즈 핵의 중심에서 전방 극까지의 거리를 측정하려면 렌즈 봉합사의 위치를 식별하고 직선 도구를 사용하여 축 방향으로 렌즈 핵의 이미지 중앙을 가로 질러 선을 그립니다. 이 선의 중심은 렌즈 핵의 중심입니다. 이 점에서 렌즈의 전방 기둥에 다른 선을 그리고 분석 메뉴에서 측정값을 선택하여 거리를 측정합니다.전방 기둥에서 후방 극에 다른 선을 그리고 렌즈 직경으로 이 거리를 측정한 다음 결과 창에서 스프레드시트에 이러한 길이를 복사하고 렌즈 반경과 관련하여 렌즈 핵의 정규화된 현지화를 계산합니다. 3일 후 수정함으로써 전방 봉합사는 전방 기둥에서 형성되며 세포의 눈에 띄는 수렴은 고정 배아에서 좁은 섬유 세포막의 파종염 염색에 의해 명확하게 시각화된다. 렌즈 막국화 mApple 형질화에서 강력한 광섬유 세포 라벨은 멤브레인 하위 도메인의 라이브 시각화를 허용하지만 봉제 수렴이 부족합니다.후방 봉합사는 3일 후에 시험관내와 생체내에서 모두 시각화할 수 있다. 적도 평면에서, phalloidin 강하게 외부 피질 섬유 세포를 레이블, 평평한 육각형을 공개. Phalloidin은 압축 렌즈 핵과 야생 유형 및 돌연변이 렌즈 구별 할 수없는 모양에서 제외됩니다.렌즈 멤브레인 국소화 된 mApple 모자이크 트랜스제닉에서 광범위한 섬유 세포의 강력한 라벨은 돌연변이 렌즈 내의 세포 부피의 혼란을 보여줍니다. 트랜스진 발현은 투과성에 의해 제한되지 않기 때문에 일부 모자이크는 렌즈 핵 라벨링을 드러냅니다. 야생 형 동물에서, 렌즈 핵은 성인기 도중 중앙 집중화하기 전에 발달의 초기 단계 도중 전방 렌즈 극에 더 가깝게 시작합니다.세포막이 적색형광을 하는 형질전환 숙주에서 녹색 태그가 달린 단백질의 발현은 생체 내 섬유 세포 형태에 대한 평가뿐만 아니라 동시 단백질 국소화를 허용한다. Zebrafish는 특히 생체 내 연구에 적합합니다. 여기에 설명된 도구를 사용하여, 우리는 생체 내 시스템에서 주로 시험관 내에서 연구된 렌즈 메커니즘을 프로브할 수 있습니다.

assessment-zebrafish-lens-nucleus-localization-sutural

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

이 비디오는 성체 및 유충 제브라피시 렌즈를 해부하여 피질 수정체 형태 및 렌즈 봉합사의 구조적 무결성을 분석하기 위해 개발된 프로토콜에 대해 설명합니다.

눈 렌즈 해부: 제브라피시 렌즈 형태를 관찰하는 기술

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

제브라피시는 이제 근이영양증, 선천성 근병증 및 관련 신경근 질환을 모델링하기 위한 확립되고 강력한 도구입니다. 복굴절(Birefringence)과 촉각(touch-hoked) 탈출 행동은 초기 발달 과정에서 제브라피시 배아의 근육 무질서 및 기관차 손상 정도를 결정하는 데 사용되는 두 가지 일반적인 비침습적 분석법입니다.

복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 제브라피쉬 수정체 핵 현지화 및 조직 무결성 평가 방법을 Danio rerio를 이용하여 수정체 발달과 백내장 예방 연구에 활용할 수 있는 정량적 분석 기술입니다.

제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성

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