Name: 초기 개발 중 바다 말미잘의 지질 형질이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 초기 발생 중 해파리 Nematostella vectensis의 비살상 유전자형 분석 방법을. 이 기술은 배아를 희생하지 않고 돌연변이를 식별하여 발생 후 표현형 연구를 가능하게 합니다.

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원고를 개선한 원고의 이전 버전에 대한 의견에 대해 익명의 검토자에게 감사드립니다. 이 작품은 아칸소 대학의 기금에 의해 지원되었다.

1. 산란 유도, 체외 수정 및 탈 젤리
<ol><li>16 °C에서 어둠 속에서 천 (ppt)당 12 부분의 염분으로 바닷물에 Nematostella 정맥스텐시스를 유지, 매일 아르테미아를 공급.</li>
	<li>산란 유도 전날, 동물을 온도 및 조명 제어 인큐베이터에 놓습니다. 인큐베이터를 프로그래밍하여 동물이 25°C에서 8시간의 빛에 노출되도록 합니다. 선택 사항: 굴의 작은 조각(&1 mm 3)을 개별 동물에게 먹이고 산란을 향상시키기 위해 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	<li>동물을 16°C에서 1시간 동안 인큐베이터에 둡니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 동물을 제거하고 산란을 허용하기 위해 실온 (RT)에서 빛벤치 위에 둡니다. 산란은 일반적으로 다음 1.5-2 시간 안에 발생합니다.</li>
	<li>수컷과 암컷이 별도의 용기에 있는 경우, 여성 용기의 달걀 패키지를 정자가 들어있는 남성 용기에 넣고, 팁이 절단된 이송 피펫을 사용하여 개구부를 확대하여 계란이 기계적 스트레스로 손상되지 않도록 합니다. 전송. 계란을 적어도 15 분 동안 남성 용기에 두어 기름지게하십시오.</li>
	<li>3% 시스테인 (pH 7.4)을 함유 한 바닷물에 달걀 패키지를 페트리 접시 또는 15 mL 튜브에 담는다. 12분 동안 셰이커에서 부드럽게 교반합니다.</li>
	<li>플라스틱 피펫을 사용하여 덩어리를 부수고 완전히 젤리가 제거 될 때까지 2-3 분 동안 계속 교반하십시오.</li>
	<li>미디어를 신선한 바닷물로 적어도 5배 이상 교체하여 시스테인을 제거합니다.</li>
	<li>16 °C 또는 RT에서 유리 페트리 접시에 기름지게 한 계란을 유지합니다.</li>
</ol>2. 가스트룰라 배아에서 압제 조직의 외과 적 제거
<ol><li>10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.3% Tween20, 0.3% NP40 및 1 mg/mL 단백질화 K. 배아당 추출 완충액의 20 mL로 구성된 DNA 추출 완충액을 준비한다. 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 PCR 튜브에 버퍼를 aliquot.</li>
	<li>바닷물에 1% 아가로즈를 녹여 페트리 접시에 붓고 바닥을 덮습니다. 벤치탑에서 식혀 젤 침대를 만드세요. 페트리 접시에 젤 침대를 덮기 위해 신선한 바닷물을 붓습니다.</li>
	<li>24 시간 후 수정 후 (hpf) 배아 (초기- 중간 가스 트루라 단계)를 아가로즈 젤 베드를 함유하는 페트리 접시에 옮니다.</li>
	<li>텅스텐 바늘을 바늘 홀더에 삽입하고 바늘 팁을 알코올 (70 % 이상)에 담그고 화염에 넣어 알코올을 태워 살균하십시오.</li>
	<li>해부 현미경 (20x에서 40 x 배율)에서, 조작 할 배아의 크기에 대한 표면 아가로즈의 조각을 제거하여 아가로즈 침대에 우울증을 만들기 위해 텅스텐 바늘을 사용하고, 그 측면과 우울증에 배아를 배치 미세 수술을 위해 배아의 움직임을 제한하기 위해 아래를 향하게합니다.</li>
	<li>텅스텐 바늘을 사용하여 구강 블라소랄 개구부 맞은편에 위치한 복부 조직의 조각을 외과적으로 절제하십시오. 경구-아포랄 축을 따라 배아 조직의 1/3 내지 1/4이 일반적으로 충분합니다.</li>
	<li>P20 피펫을 사용하여 분리된 아포랄 조직(<2 mL)을 DNA 추출 완충제 20 mL를 함유하는 PCR 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>수술 후 배아를 24- 또는 96 웰 플레이트에 담수 500 mL 이상을 함유하는 우물로 옮김을 옮김.</li>
	<li>필요에 따라 배아 수에 대해 2.4-2.8단계를 반복합니다.</li>
	<li>수술 후 배아를 함유하는 웰 플레이트를 16°C 또는 RT에서 인큐베이터에 놓고, 지질형 분석이 완료될 때까지.</li>
</ol>3. 유전체 DNA 추출 및 게놈 PCR
<ol><li>미니 원심분리기를 사용하여 DNA 추출 완충액 및 단리된 배아 조직을 포함하는 PCR 튜브를 간단히 스핀다운합니다(예: 10초 동안 2,680 x g). </li>
	<li>단일 배아에서 게놈 DNA를 추출하려면 세포 덩어리의 분해를 보장하고 세포 용해를 향상시키기 위해 30 분마다 30 초 동안 55 °C에서 PCR 튜브를 30 초 동안 배양하십시오.</li>
	<li>PCR 튜브를 95°C에서 5분 동안 배양하여 단백질화 K를 비활성화합니다.</li>
	<li>gDNA 추출물을 4°C 또는 얼음 위에 보관하고 즉시 PCR로 진행하십시오. 참고: gDNA 추출물을 -20°C 냉동고에 배치하여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>추출된 gDNA를 템플릿으로 사용하여 관심 있는 게놈 궤적을 증폭시키는 PCR 반응을 설정합니다.<ol>
<li>관심 궤적에서 다른 알레임이 크기가 다른 경우 agarose 젤 전기 동아에 의해 크기 차이를 검출 할 수 있도록, 전체 궤적을 증폭하는 프라이머의 단일 세트를 설계.</li>
		<li>대안적으로, 특정 대열의 존재 에서만 PCR 제품을 생성하는 대열제 특이적 프라이머를 사용; 예를 들어 삽입/삭제 돌연변이를 포함하는 영역에 결합하는 프라이머를 설계합니다.</li>
		<li>다음과 같이 일반적인 20 mL PCR 반응 믹스를 사용: gDNA 추출의 5 mL, 8 mL의 뉴클레아제 없는 물, 4 mL의 PCR 버퍼, 0.2 mL의 10mMdNTPs의, DMSO의 0.6 mL, 10 mMM 의 1 mL, 1mL의 1 mL의 10 mMM 리버스 프라이머 및 0.2 mL의 DNA 폴리머라제(물질 표참조). 참고: PCR 반응에 여러 프라이머를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 두 개의 역프라이머가 두 개의 대열의 존재/부재를 명확하게 할 수 있도록 두 개의 리버스 프라이머가 뚜렷한 크기의 PCR 제품을 생성하도록 설계된 한 하나의 범용 전방 프라이머와 두 개의 대열레 전용 역프라이머를 결합할 수 있습니다. 겔 전기 동에 의해 결정됩니다 (대표 결과 섹션 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>아가로즈 젤 전기 동동을 실행하여 PCR 제품의 크기와 유무를 결정합니다. PCR 제품의 예상 크기에 따라 아가로즈 겔 전기 동거의 상태(예: 아가로즈 겔 백분율, V/cm 및 지속 시간)의 상태를 조정합니다.</li>
	<li>PCR 제품의 크기 및 존재/부재에 관한 PCR의 결과를 사용하여 각 수술 후 배아에 유전자형을 할당합니다. 예를 들어, 다른 대문자가 서로 다른 크기의 PCR 제품을 생성할 것으로 예상되는 경우 크기 정보를 사용하여 각 배아에 대한 유전자형을 할당합니다. 알렘 특이적 프라이머를 사용하는 경우, PCR 제품의 존재/부재에 대한 데이터를 사용하여 각 배아에 유전자형을 할당해야 합니다.</li>
	<li>유전자형에 따라 배아를 분류합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

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여기서 동물을 희생시키지 않고 단일 말미잘 배아를 유전자형화하는 PCR 기반 프로토콜을 기술한다. 산란 과 탈 젤리 다음, 수정된 계란은 gastrulae로 발전하는 것을 허용됩니다. 각 gastrula 배아의 복부 영역은 외과적으로 제거되고, 분리된 아포랄 조직은 후속 게놈 DNA 추출을 위해 사용되며, 나머지 수술 후 배아는 치유되고 개발을 계속한다. gDNA 추출물은 각 배아의 유전자형을 결정하기 위해 PCR 분석에 사용됩니다. 이 방법은 10,11,및 배아의 대다수 (>90%)를 조절하고 개발하는 말미잘 배아의 경구 반쪽의 능력을 이용합니다 일반적으로 수술을 생존하고 적절한 문화 조건하에서 정상적으로 개발. 이 게노티핑 분석에 필요한 조직 양은 전체 가스트룰라 배아의 절반 미만이며, gDNA 추출 실패로 인한 부정적인 결과는 드물다(&5%). 소량의 조직만 이 것을 감안할 때, 이 게노티핑 분석에 대한 프리 가스트루라...

Cnidarians는 해파리, 산호 및 바다 말미잘을 포함하는 동물의 다양한 그룹을 나타냅니다. 그(것)들은 세포외 매트릭스 (mesoglea)에 의해 분리되는 외엽과 내배엽으로 구성된 diploblasts입니다. Cnidaria는 초파리와 무스와 같은 전통적인 동물 모델이 1에 속하는 Bilateria를추측하는 자매 그룹입니다. 또한, Cnidaria-Bilateria 발산은 캄브리아기 이전 기간에 발생 한 것으로 생각된다2. 이와 같이, cnidarians와 양자학자의 비교 연구는 그들의 가장 최근의 일반적인 조상의 생물학에 대한 통찰력을 얻기 를 위해 필수적입니다. 최근, 비교 유전체학은 cnidarians와 양자학자가 노치와 bHLH와 같은 많은 발달 툴킷 유전자를 공유한다는 것을 밝혔습니다, 그들의 일반적인 조상이 이미 이 유전자3가 있었다는 것을 암시하. 그러나, Cnidaria와 Bilateria의 마지막 일반적인 조상에 있는 이 발달 공구 키트 유전자의 역할은 비교적 적게 잘 이해됩니다. 이 문제를 해결하기 위하여는, 이 깊이 보존한 유전자가 cnidarians에 있는 어떻게 작동하는지 공부하는 것이 중요합니다.
신흥 세포주의 유전 모델 중 하나는 안토조안 네마토스텔라 정맥학입니다. 그것의 게놈은3,및 모폴리노 매개 유전자 녹다운, meganuclease 중재한 기형성, 및 CRISPR-Cas9 중재한 유전자 녹진 및 녹아웃을 포함하여 다양한 유전 공구가 지금 이 동물에서 유효하게 유효합니다. 또한, 네마토스텔라 개발은 비교적 잘 이해된다. 배아 발생 시, 위분은 질4에 의해 발생하며, 배아는 자유 수영 플라눌라 유충으로 발전합니다. 플래눌라는 이후 입과 경부 촉수와 sessile 폴리페로 변환합니다. 용종은 성장하고 성숙에 도달합니다.
CRISPR-Cas9 매개 표적 돌연변이 발생은 이제 일상적으로 Nematostella 정맥염5,6,7,8,9에서 유전자 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Nematostella에서녹아웃 돌연변이를 생성하기 위해, 궤적 특이적 단일 가이드 RNA와 endonuclease Cas9 단백질을 포함하는 칵테일은 먼저 일반적으로 보여주는 F0 창시자 동물을 생산하기 위해 비옥한 또는 기름지게 한 계란에 주입됩니다. 모자이크. F0 동물은 이후에 성숙도에 제기되고 F1 집단을 생성하기 위해 서로 교차되고, 그중 부분 집합은 녹아웃 돌연변이체일 수 있다 6. 또는, 성적으로 성숙한 F0 동물은 F1 이형 동물을 생성하기 위해 야생 형 동물과 교차 할 수 있으며, 관심의 궤적에 녹아웃 대립 유전자를 운반하는 F1 이형은 F2 자손을 생산하기 위해 서로 교차 할 수 있습니다, 1 분기 그 중 녹아웃 돌연변이 가 될 것으로 예상된다5. 두 접근은 유전으로 이질적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하는 방법을 요구합니다. 폴립 촉수는 6,7. 그러나 관심 있는 유전자의 발달 기능이 조사되고 돌연변이 배아가 폴립 단계에 도달하지 않는 경우(즉, 돌연변이와 관련된 애벌레 치사성으로 인해), 녹아웃 돌연변이는 초기에 확인되어야 합니다. 여기에 설명된 PCR 기반 프로토콜은 동물을 희생시키지 않고 가스트루라 단계에서 개별 동물을 유전자형으로 하는 것으로, 이는 배아의 유전적 이질적인 집단으로부터 녹아웃 돌연변이체의 식별을 가능하게 한다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier 냉장 인큐베이터</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>산란 유도에 사용</td></tr><tr><td>인스턴트 오션 바다 소금</td><td>인스턴트 오션</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>염수 새우 낭종</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인 염산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>표준 궤도 셰이커, 모델 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>품질 생물학</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 대체</td>물 <td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K 용액(20mg/mL), RNA 등급</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 바늘 홀더</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 해부 바늘</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide universal forward primer</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td>에 특이적인 리버스 프라이머</tr><tr><td>glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td> 전용 리버스 프라이머</tr></tbody></table>

초기 개발 중 바다 말미잘의 지질 형질이

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

여기서 설명된 PCR-기반 프로토콜은 동물의 생명을 희생시키지 않고 안토조안 성충성 네마토스텔라 의 기압기 배아를 유전자형화한다. 체외 수정 및 탈 젤리에 이어, zygotes는 초기 - 중간 gastrula 단계에 도달하기 위해 실온에서 24 시간 동안 개발할 수 있습니다. 가스트룰라 배아는 다음 해수를 포함하는 페트리 접시에 아가로즈 젤 침대에 배치됩니다. 해부 현미경의 밑에, 텅스텐 바늘은 외과로 각 태아에서 aboral 조직 단편을 분리하기 위하여 이용됩니다. 수술 후 배아는 치유하고 개발을 계속할 수 있습니다. 게놈 DNA는 단리된 조직 단편으로부터 추출되고 궤적 특이적 PCR에 대한 템플릿으로서 사용된다. 유전자형은 PCR 제품의 크기 또는 대문자 특정 PCR 제품의 유무에 따라 결정될 수 있습니다. 수술 후 배아는 유전자형에 따라 분류됩니다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다. 이 방법은 배아의 유전이 종족적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하고 발달 도중 표현형의 분석을 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Nematostella 게놈은 neuropeptide GLWamide를 위한 전구체 단백질을 암호화하는 단 하나 궤적이 있습니다. 이 궤적에서 세 개의 녹아웃 돌연변이 대엽(glw-a,glw-b및 glw-c)은이전에5. GLWamide 궤적에서 야생 형 알레르 (+)와 녹아웃 알레이 glw-c를운반하는 4 명의 이형 남성 (유전자 형 : +/ glw-c)은야생 형 알레르와 다른 녹아웃을 운반하는 이형 지푸스 암컷과 교차했습니다. 동일한 궤적에서 -a 를 골자(유전자형: +/glw-a)로하여 자손을 생성한다. 자손에는 4가지 가능한 유전자형이 있습니다: glw-a</...

이 프로토콜의 목표는 배아를 희생하지 않고 위도 동안 말미잘 성충을 유전자 형화하는것입니다.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

이 프로토콜은 연구자가 초기 배아 발생 도중 돌연변이 바다 말미잘을 확인하는 것을 가능하게 하고 그 후 배아 발달 표현형을 분석할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동물의 생명을 희생하지 않고 초기에 개별 바다 말미잘을 유전자형으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 실험실대학원생인 미겔 실바입니다.산란 유도 전날, 말미네 선충성 베텐소를 온도 및 빛 제어 인큐베이터에 놓고 인큐베이터를 프로그래밍하여 동물이 섭씨 25도에서 8시간의 빛에 노출되도록 합니다. 다음 날, 인큐베이터에서 동물을 제거하고 다음 1 ~2 시간 이내에 발생하는 산란을 허용하기 위해 빛이 켜진 실온에서 벤치 상단에 둡니다. 팁이 절단된 이송 파이펫을 사용하여 여성 용기의 계란 패키지를 정자가 함유된 남성 용기에 넣고 수정을 허용하기 위해 최소 15분 동안 남성 용기에 두십시오.수정 후, 계란 패키지를 dejelly, 유리 페트리 접시에 3 %의 시스테인을 포함하는 바닷물에 배치하고 부드럽게 12 분 동안 셰이커에 동요. 그런 다음 플라스틱 파이펫으로 덩어리를 부수고 완전히 벗어날 때까지 2 ~ 3 분 동안 계속 동요합니다. 수정된 계란을 같은 접시에 섭씨 16도 또는 실온에서 보관하십시오.다음 날, 원고에 설명된 바와 같이 DNA 추출 버퍼를 준비하고, 소용돌이에 의해 잘 섞고, 각 튜브에 20 마이크로리터를 추가하여 PCR 튜브에 알리쿼트한다. 바닷물에 1%아가로즈를 녹이고, 페트리 접시에 붓고 바닥을 덮고, 벤치 상의를 식혀 젤 침대를 만듭니다. 젤 베드를 신선한 바닷물로 덮습니다.파이펫을 사용하여 24시간 후 수정 배아를 아가로즈 젤 침대함유 페트리 접시에 옮기다. 텅스텐 바늘을 필요 홀더에 넣고 알코올에 팁을 찍어 화염에 넣고 알코올을 태우십시오. 해부 현미경하에서, 텅스텐 바늘을 사용하여 조작할 배아의 크기에 대한 표면 아가로즈 조각을 제거하여 아가로즈에 우울증을 만듭니다.그런 다음 텅스텐 바늘을 사용하여 미세 수술용 배아의 이동을 제한하기 위해 측면측면이 아래로 향하는 우울증에 배아를 배치합니다. 성공적인 수술을 수행하기 위해서는 배아의 움직임을 제한하는 것이 중요합니다. 텅스텐 바늘로 구강 복부 축을 따라 복구 조직의 조각을 외과적으로 제거하십시오.P20 파이펫을 사용하여, DNA 추출 버퍼의 20 마이크로리터를 포함하는 PCR 관에 격리된 복경 조직을 전송합니다. 수술 후 배아를 신선한 바닷물의 최소 500 마이크로리터를 포함하는 24웰 플레이트의 우물로 옮기. 그리고 수술 후 배아를 함유 한 플레이트를 지음이 완료 될 때까지 섭씨 16도에서 인큐베이터에 놓습니다.단일 배아에서 게놈 DNA를 추출하기 위해 먼저 미니 원심분리기를 사용하여 DNA 추출 버퍼 및 격리된 배아 조직을 포함하는 PCR 튜브를 잠시 회전시합니다. 그런 다음 30분마다 30초 동안 튜브를 3시간 동안 55도의 배양하여 세포 덩어리가 분해되고 세포 용액을 향상시킵니다. 단백질Ae K를 섭씨 95도에서 4분간 비활성화한 후, 추출된 게놈 DNA를 사용하여 관심 있는 궤적을 증폭시키는 템플릿으로 PCR 반응을 설정한다.원고에 설명된 대로 원하는 프라이머를 디자인합니다. 20 마이크로리터 PCR 반응을 설정합니다. PCR을 완료한 후, 아가로즈 젤 전기포고를 실행하여 PCR 제품의 크기와 존재 또는 부재를 결정하여 PCR 제품의 예상 크기에 따라 아가로즈 젤 전기포의 상태를 조절해야 합니다.크기 및 존재 또는 부재 또는 PCR 제품에 관한 PCR 결과를 사용하여 각 수술 후 배아에 유전자형을 할당한 다음 유전자형에 따라 배아를 정렬하십시오. 선충성 게놈에는 신경 펩티드, GLWamide에 대한 전구체 단백질을 인코딩하는 단일 메뚜기를 가지고 있습니다. 궤적에서 3개의 녹아웃 돌연변이 진상골은 이전에 보고되었습니다.PCR 결과는 C 녹아웃 유전자를 운반하는 A 녹아웃 알렐과 이종화구스 남성을 운반하는 한 이종화구스 여성 사이의 F1 십자가의 자손 중 무작위로 샘플링된 배아에서 유래하여 다른 유전자형을 보여준다. 배아 1개와 2개는 A 녹아웃 본선의 예상 크기에 해당하는 단일 PCR 대역을 보여준다. 배아 3개와 6개는 녹아웃 알레일 A와 C.Embryos 4, 7, 8에 대한 예상 크기를 가진 두 개의 PCR 밴드를 보여 주며, C 녹아웃 알렐의 예상 크기에 해당하는 단일 PCR 밴드를 보여준다.배아 5는 프라이머 바인딩의 부족을 제안, 어떤 밴드를 보여줍니다. 유전체 DNA 추출 실패의 가능성을 배제하기 위해, 다른 PCR은 야생 형 서열에 결합 할 수있는 역 프라이머를 사용하여 실행되었다. 예상 크기의 PCR 생성물이 검출된 경우 게놈 DNA 추출이 성공했습니다.어떤 제품도 추출에 실패를 제안하지 않은 반면. 이 프로토콜은 바다 말미잘 배아를 위해 설계되었지만, 게놈 정보와 배아가 접근 할 수있는 산호와 해파리와 같은 다른 cnidarians에이 방법을 적용 할 수 있습니다. 이 절차에 따라 확인된 돌연변이는 발달 표현형을 평가하는 데 사용됩니다.예를 들어, 면역염색과 같은 조직학적 기술은 형태학의 결함을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 시투 혼성화, 실시간 정량적 RT-PCR 및 RNA-seq는 유전자 발현의 결함을 평가하는 데 사용될 수 있다. 또한, 살아있는 화상 진찰은 애벌레 또는 초기 폴립에서와 같은 포스트 배아 발달 도중 행동에 있는 결함을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.

genotyping-of-sea-anemone-during-early-development

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

amphipod Parhyale의 hawaiensis 갑각류 발생학 및 비교 절지 동물의 개발과 진화 연구를위한 유망한 모델 생물이다. 이 프로토콜은 Parhyale의 초기 분열 단계의 배아에서 단일 할구를 수동으로 제거하는 방법을 설명합니다.

Amphipod 갑각류의 여덟 세포 배아에서 단일 셀의 절제<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.

의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자

이 프로토콜의 목표는 전체 마운트 현장 교잡 및 후속 사전 및 사후 교잡 처리를 준비하기 위해 Lymnaea stagnalis 배아 및 유충의 고처리량 캡슐화 해제를 위한 일련의 방법을 사용자에게 제공하는 것입니다.

전체 산<em&gt; 현장에서</em복족류 연체 동물 용&gt; 하이브리드 방법<em&gt; Lymnaea의 stagnalis</em

여기에서는 자포동물(cnidarian anthozoan) 모델인 Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis에서 재생을 유도하고 모니터링하는 방법을 보여줍니다.  형태학적 병기 결정 시스템을 사용하여 재생을 절단하고 분류하는 방법을 보여주며, 이 시스템을 사용하여 폴립 구조 재생에서 자가포식에 대한 요구 사항을 밝힙니다.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도 Nematostella의 vectensis

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에서, 우리는 바다 말미잘에서 조독 추출물을 얻고 용혈성 및 포스포리파제 활성을 검출하는 프로토콜을 기술한다.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

모델 유기체 Exaiptasia diaphana 에 대한 히스톤 마크 H3K4me3에 대한 염색질 면역침전(X-ChIP) 분석이 제시됩니다. 분석의 특이성과 유효성은 정량적 PCR과 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing)으로 확인됩니다. 이 프로토콜은 말미잘 E. diaphana에서 단백질-DNA 상호 작용에 대한 연구를 증가시킬 수 있습니다.

Cnidarian Model System의 Chromatin Immunoprecipitation Exaiptasia diaphana

배우세요 초기 발생 중 해파리 Nematostella vectensis의 비살상 유전자형 분석 방법을. 이 기술은 배아를 희생하지 않고 돌연변이를 식별하여 발생 후 표현형 연구를 가능하게 합니다.

초기 개발 중 바다 말미잘의 지질 형질이

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