Name: 과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 성체 혈구에서 탐식작용을 정량화하는 생체 내 분석법으로, 미생물 감염에 대한 탐식세포 인식 및 제거 능력을 평가합니다. 이 방법은 유전자 스크리닝과 면역 연구에 활용됩니다.

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저자는 vivo에서 먹어서 실험 수행 지원을 위한 닥터 베스 곤잘레스와 박사 Aprajita Garg을 감사 합니다. NSF UMD 사전 시드 부여 및 UMD NIH T32 훈련 보조금, 셀 및 분자 생물학 (CMB)과 호스트 병원 체 상호 작용 (HPI),이 작품을 자금.

1. 주입 Fluorescein 입자 준비
<ol><li>상용, 열 살해 박테리아의 10 밀리 그램을 다시 구성 입자 fluorescein 표시 ( 재료의 표참조) 추가 하 여 990 µ L 살 균 1 x PBS 그리고 10 µ L 50 m m 나트륨 아 지 드 10 mg/mL의 농도 재고를. 소용돌이를 섞어입니다.<ol>
<li>단일 사용 8 µ L aliquots 0.2 mL 튜브에로 분할 하 고 빛이 관련 된 감도 최소화 하기 위해 4 ° C에서 어두운 상자에서 저장. 참고: 나트륨 아 지 드 방부 제는 선택 사항이 며 10 mg/mL 주식 1 mL 균 1 x PBS, 만들어진 경우 생략할 수 있습니다 aliquoted, 및-20 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>5% 식품 500 µ L 주사기 필터링 녹색 식품 색소와 9.5 mL 살 균 1 x PBS를 혼합 하 여 1 x PBS에 색소의 10 mL 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>나트륨 아 지 드를 제거 하는 주사 하기 전에 입자를 씻어. PBS와 1.7 mL 튜브에 10 mg/mL의 8 µ L x 믹스 42 µ L 살 균 1. 실 온에서 2.5 분에 대 한 최대 속도로 원심.<ol>
<li>제거는 상쾌한, 실 온에서 2.5 분에 대 한 최대 속도 50 µ L 1 x PBS, 및 원심 분리기를 추가 합니다.</li>
		<li>1.3, 1.3.1 단계를 반복 하 여 총 3 세척 2 x.</li>
		<li>최종 세척 후는 상쾌한 삭제 하 고 다시 5% 식용 1 x PBS에 색소의 50 µ L에서 1.6 mg/mL에 입자를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>튜브 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서. 4 ° C에서 저장, 1 주 후 삭제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 주입 역 및 파리 준비
<ol><li>사출 패드를 준비 합니다. 최대 삽입 직사각형 CO2 비행을 분할 사용 실험실 테이프 동시에 파리의 4 genotypes 4 섹션으로 패드. 현미경 근처 벤치에서 파리는 패드 (패드의 각 모서리에 대 한 하나)에 줄지어 되었습니다 일단 튜브를 배치 하는 영역을 지정 합니다.</li>
	<li>튜브 나이 일치 하는, 4-7 일 준비-주입에 대 한 오래 된, 파리. 테스트를 각 스트레인에 대 한 5 남성과 5 여성 준비 비행 식품의 신선 하 고 레이블이 유리병으로 전송과 25 ° c.에 계속</li>
	<li>공기 주입기를 준비 ( 재료의 표참조) 악기는 100 밀리초 (sub nanoliter 볼륨의 배달을 허용-액체를 추방 하기 위해 가스 압력의 짧은 파열) TIMED 모드로 설정 하 여.</li>
	<li>현미경 슬라이드를 준비 합니다. 전기 테이프의 1.5 인치 스트립, 루프, 접착 면으로 접어 잘라내어 레이블이 현미경 슬라이드에 배치.</li>
</ol>3. 유리 모 세관 바늘 준비
<ol><li>당겨 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여 유리 바늘 (얇은 벽 유리 모 세관).<ol>
<li>마이크로미터와 현미경 바늘을 잡고 고 #5 좋은 포인트 스테인리스 핀셋을 사용 하 여 팁. 100 µ m 팁 부상 최소화 하면서 파리의 표 피를 관통 하기 위하여 충분 하다.</li>
		<li>각 비행에 투입 될 것입니다 액체의 양을 측정 합니다. 1 x PBS에 색칠 하는 살 균 5% 음식 바늘을 로드 하 고 0.01 m m 단계 마이크로미터에 미네랄 오일 한 방울에 액체를 추방. 참고: 액체 작은 물방울 구형 이면 picoliters에서 볼륨 (크기)3/1910으로 계산 됩니다. 30 100 µ m 직경 바늘 ~ 2 꺼내지지 100 ms에 nL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 주사 파리
<ol><li>1.6 mg/mL 입자 parafilm의 작은 광장에 10 µ L 플라스틱<ol>
<li>바늘에 액체를 당겨 하 고 인젝터 노즐에서 탑재 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>CO2 파리 anesthetize 하 고 flypad, 패드의 앞으로 동쪽으로 향하게 하는 머리와 복 부 쪽에 그들의 지정 된 지역에서 줄을. 벤치에 해당 지역에 튜브를 배치 합니다.</li>
		<li>액체 (~ 10 nL 총)의 5, 100 ms 펌프와 복 부의 상단에 파리를 주사.</li>
		<li>적절 한 튜브에 주입 된 파리를 전송, 유리병에 시간 참고. 25 ° c.에 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 바늘 0.4%와 함께 로드 Trypan 블루 솔루션.</li>
	<li>공 압 인젝터 제어, 바늘에서 액체를 밀어 공기의 지속적인 흐름을 수 있는 설정 합니다.</li>
	<li>그들은 30 분 동안 휴식을 후 파리를 anesthetize 하 고 때까지 복 부 가득 부풀어 Trypan 파랑 주사. 참고: 때 입자는 pH에 민감한 염료와 표시 phagosome 성숙 검사, 파리 1 시간 동안 휴식을 허용 하 고 trypan 블루 장착 파리 전에 주입 하지 마십시오.</li>
	<li>전기 테이프, 아래로 복 부 측으로 현미경 슬라이드에 파리를 탑재 합니다. 테이프에 그들을 보호 하 고 비행의 측에 날개를 밀어. 또한, 부드럽게 즉시 이동 하지 것입니다 수 있도록 테이프에 머리를 밀어.</li>
	<li>즉시 5 단계로 이동 합니다.</li>
</ol>5. 영상 파리
<ol><li>이미지 하나, 25 x 또는 32 x 배율 ( 재료의 표참조)는 디지털 카메라와 컴퓨터에 연결 된 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 한 번에 이동 합니다. 디지털 카메라에 대 한 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 비행의 등 쪽 혈관에 초점.</li>
	<li>실험 사이 확대 및 노출 시간을 기록 합니다. 참고: genotypes의 추적을 잃고 단일 앉아에 여러 종자를 촬영의 오류 때. 파리를 mislabeling를 방지 하려면 각 유전자 형에 대 한 첫 번째 및 마지막 비행 사진 이미지 수의 기록을 합니다.</li>
</ol>6. 측정 하 고 형광을 정상화
<ol><li>소프트웨어를 열고 한 번에 하나의 이미지를 엽니다.<ol>
<li>등의 형광 강도 측정 합니다. 등 선박 주위에 다각형을 그립니다. 측정값 을 선택 하 고 다각형 안에 형광 강도 기록.</li>
		<li>배경 형광 강도 결정 합니다. 첫 번째 다각형을 복사 하 고 비행의 등 쪽 혈관에 인접 한 지역으로 이동. 측정 및 기록 형광 강도의 배경 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>표준화 배경 형광에 의해 지 배 형광: 등 선박 ÷ 배경입니다.</li>
		<li>평균 정규화 등 선박 긴장에서 모든 파리의 형광 강도 계산 합니다.</li>
		<li>실험 2 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>사용 학생의 짝이 없는 t-3 실험에서 파리 제어 파리의 평균 상대 형광 강도 비교 하 고 테스트 하는 시험. 계산 하는 수식을 사용 하 여 효과 크기: 코헨의 d (M1-M2) ÷ SD풀링된, M1 은 유전자 1 형의 의미와 M2 는 유전자 2 형의 평균 = &amp; SD 풀링된 =<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59543/59543eq1.jpg"> 어디 SD1 유전자 1 형의 표준 편차 이며 SD2 유전자 2 형의 표준 편차입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

상용, 붙일 레이블 입자는 일반 (0.2 µ m 카복실산 수정 스피어)에 식 균 작용 또는 미생물 (붙일 레이블 열-화학적 살해 박테리아 또는 효 모)의 식 균 작용을 평가 하는 데 사용 됩니다. Phagosome 성숙 평가, 연구원은 입자는 phagolysosome에서 산 성 하에서 중립 pH 감소 때 fluoresces pH에 민감한 염료와 함께 표시를 선택할 수 있습니다. 또는, 먹어서, 병원 체 인식 및 이해의 초기 단계를 검사 하 연구원은 입자 내부와 세포 외부 형광 형광 태그로 표시를 선택 해야 합니다.
신중 하 게 통제 실험 조건 vivo에서 먹어서 분석 결과 재현할 수 있는 방식으로 수행 됩니다 있도록 열쇠입니다. 첫째, 초파리 실험에 사용 하는 파리 4-7 일의 범위 내에서 최적의 나이 일치 해야 하므로 세포 immunosenescence32, 겪 습. 둘째, 주사 사이 기간 일관 ...

타고 난 면역 방어는 병원 성 미생물에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 형성 한다. 이러한 응답 기능 둘 다 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)1감각에 의해 중재는 체액과 세포 타고 난 면역으로 나눌 수 있습니다. 신호 통로의 많은 및 타고 난 면제의 effector 메커니즘 포유류에는 선 충 류, 꼬마 선 충, 과일 파리, 초파리 melanogaster2같은 무척 추 동물 보존 됩니다. 과일 파리 감염 미생물3에 대 한 호스트 방어를 공부 하는 강력한 시스템으로 떠오르고 있다. 초파리 유전자 온순한 쉽고 저렴 하 게 실험실에 reared 이며 짧은 생성 시간을 보내고 있다. 또한, 과일 파리는 다양 한 세균, 바이러스, 세균, 곰 팡이, 또는 기생 하는 병원 체에 대 한 호스트의 시험 사용에 대 한 매우 효율적인 방어를 전시 한다.
초파리 immunologists 앞으로 유전 스크린, 게놈 넓은 중재 하는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 세포 라인의 검사 및 검사에 지도 하는 타고 난 면제-돌연변이 비행 긴장 기존 활용 역사적으로 식별 및 여러 진화론 보존된 체액 면역 경로4,5,6,,78의 특성 체액의 타고 난 면역 반응, 틀림 없이, 최고의 특징 과일 파리에 면역성이 있는 방위. 감염, 다음 체액 반응 리드 생산 및 항균 펩타이드의 조직 릴리스 (AMP) 분자 hemolymph, 곤충에 해당 혈액으로. 앰프는 매우 보존된 수신자와 Imd 신호 통로 의해 생산 됩니다. 수신자 통로 포유 동물에 동종 TLR/IL-1R 수용 체 신호 전달, 그리고 Imd 통로 포유류 종양 괴 사 인자-알파 신호 동종. 초파리, 통행세에 있는 그람 양성 박테리아, 곰 팡이, 그리고 초파리 X 루의6,,910 에 의해 유도 된다 신호 및 그램 음성 박테리아11에 의해 유도 된다 Imd 신호 ,12.
캡슐화, melanization, 및 침략 병원 균의 식 균 작용의 구성 세포 면역, hemocytes13라는 특수 혈액 세포에 의해 수행. 과일 파리에서 hemocytes의 3 개의 종류가 있다: 크리스탈 셀, lamellocytes, 및 plasmatocytes13. 크리스탈 셀, 애벌레에서 순환 hemocytes의 5%를 구성 하는 병원 체와 상처 사이트에 호스트 조직의 melanization에 지도 하는 proPhenoloxidase (proPO) 효소를 놓습니다. 일반적으로에 없는 건강 한 태아 또는 애벌레, Lamellocytes는 외국 개체를 캡슐화 하는 부착 세포 이다. 이러한 셀 pupariation 또는 parasitizing 말 벌 계란은 애벌레에 예금 될 때 유발 됩니다. Phagocytic plasmatocytes, 애벌레에서 hemocytes 및 모든 나머지 hemocytes 성인 순환의 95%를 구성 하는 조직 개발 중 개장에 역할 그리고, 특히, 초파리 세포 면역의 주요 효과 기 세포로 될.
먹어서 타고 난 면역성이 있는 방위;의 즉각적이 고 중요 한 선 호스트 상피 방 벽을 위반 하는 미생물에 휩 싸이 빠르고 phagocytic 혈액 세포에 의해 제거 (식 균 작용의 세포 생물학의 종합적인 검토에 대 한 참조 14참조). 이 프로세스는 생식 인코딩 패턴 인식 수용 체 (호흡기) hemocytes 인식 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) 미생물의 때 시작 됩니다. 한 번 그들의 목표에 바인딩된, 호흡기 말라 골격 개장을 통해 pseudopods의 형성으로 이어질 신호 폭포를 시작 합니다. pseudopods 잠겼습니다 이후 이며 초기 세포 기관이, 있는 phagosome로 내 면 미생물을 둘러싸고 있습니다. 미생물은 phagosome는 hemocyte의 내부로 매매 하 고 일련 리소좀과 상호 작용의 산성화는 phagosome phagosome 성숙의 과정을 겪 습으로 파괴 된다. 시험관에 세포 생물학 연구 포유류 1 차 셀에 식별 및 포유류 Fc 감마 수용 체 등 C3b 수용 체15,16먹어서 조절 요인에 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대형 스크린 또는 vivo에서 학문을 실행 하는 능력은 포유류 시스템에서 제한 된다.
여기 우리는 200017에 데이비드 슈나이더의 연구소에 의해 처음 도입 절차를 기반으로 성인 초파리에 있는 식 균 작용에 대 한 vivo에서 분석 결과 제시. 슈나이더 연구소 무 hemocytes 쉽게 복 부 등 혈관을 따라 클러스터링 phagocytose 폴리스 티 렌 구슬 및 박테리아를 보여주었다. 먹어서 시각화, 파리 붙일 레이블된 입자 (와 같은 E. 콜라이 fluorescein isothiocyanate (대장균-FITC)으로 표시), 주사는 hemocytes 시간을 입자를 삼 켜 수 있도록 30 분 동안 incubated 그리고 인큐베이션 기간 동안 하지 phagocytosed 입자의 형광 냉각 trypan 파랑, 함께 주입. 비행 등 혈관은 다음 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 이 정액 종이, 라텍스 구슬, 파리 hemocytes phagocytose 박테리아 하 고 라텍스 구슬, 그 세균 먹어서 미리 주입 하 여 저해 수 있는 상대적으로 간단한 실험을 사용 하 고는 세포와 체액 없이 면역 응답도 대장균을 따르게 됩니다. Vivo에서 먹어서 등 선박 관련 된 hemocytes에 의해 잠겼습니다 하는 입자의 형광 강도 측정 하 여 계량 슈나이더 연구소의 작품을 바탕으로이 보고서에서 제시 하는 분석 결과.
포유류 시스템에 접근 방식과 마찬가지로, 초파리 유전학 처음 사용 게놈 넓은 생체 외에서 RNAi 스크린 휴대 면역 응답18,19,20에 필요한 유전자를 식별 하 ,21,,2223. 그러나, 성인 vivo에서 먹어서 분석 결과의 개발 활성화 후속 실험 체 외 연구에서 식별 된 요소의 역할 연구원 생물 학적 확인 되므로 전체 동물에 쉽게 실시 하. 막 횡단 수용 체 공룡, s 2를 사용 하는 RNAi 스크린에 세균성 수용 체 세포가24 로 처음 확인 되었고 나중 대장균 (대장균), Enterococcus 중재에 표시 된 경우 있 었 어 요 faecalis, 및 성인25에 황색 포도상구균 (S. 구 균) 먹어서.
우리의 실험실 성인 hemocytes에 식 균 작용을 조절 하는 새로운 유전자를 식별 하기 위해 앞으로 유전 스크린 및 게놈 넓은 협회 연구 ( 초파리 유전자 참조 패널 (DGRP)를 사용 하 여)에서 vivo에서 먹어서 분석 결과 고용. 이러한 연구 수용 체 PGRP-SC1A 및 PGRP SA26, 단백질 Rab1427, 글루타민 산 염 운송업 자 Polyphemus28와 RNA 의무적인 단백질 폭스-129밀매 세포내 소포 특성에 지도 했다.
우리는 미래의 화면 통합 vivo에서 먹어서 추가 유전자 초파리의 세포 면역 반응에 대 한 중요 한 식별 이어질 수 예상. 화면 완전히 시퀀싱 타고 난된, 등 라인은 DGRP 또는 초파리 합성 인구 자원 (DSPR)를 사용 하 여 식 균 작용 또는 hemocyte 개발에 영향을 미치는 자연 변종 식별할 수 있습니다. 기술은 수 초파리 의 다른 종에 채택 또는 유지로 국가 초파리 종 사진 센터 (NDSSC 250 초파리 종 컬렉션이 화면 새로운 커뮤니티 리소스를 하는 데 사용 하는 또한, ) 코넬에서. 이러한 실험 실시 될 수 있습니다. 붙일 표시 된 세균 이나 곰 팡이 벽 bioparticles 상업적으로 사용할 수 있는 사용 하 여 또는 어떤 수 종의 세균 이나 곰 팡이-는 미생물 형광 마커 표현 제공를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. .

<table><tbody><tr><td>0.2&뮤; m Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>식세포의 일반적인 식세포 능력을 테스트하기 위한 형광 표지 라텍스 비드. (~580/~605nm) PBS에 1:20 희석액을 5% 염료로 주입합니다.</td></tr><tr><td>5430-10 PicoNozzle Kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-10</td><td>1.0mm 피펫</td></tr><tr><td>용 홀더E. coli(K-12 균주) 생체 입자, Alexa Fluor 488 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>E13231</td><td>사멸 E. coli Alexa Fluor 488로 라벨링됨. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E23370</td><td>Alexa Fluor 594로 라벨링된 E. coli 사멸. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~590/~617nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E2861</td><td>FITC(Fluorescein)로 표지된 E. coli 사멸. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Killed E. coli Texas Red로 라벨링. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~595/~615nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Killed E. coli Texas Red로 라벨링. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~595/~615nm)</td></tr><tr><td>바늘 피펫 풀러</td><td>David Kopf Instruments</td><td>모델 725</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioParticles Phagocytosis 용 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>사멸 E. coli pHrodo Red로 라벨링. 그람 음성 박테리아의 식세포 재조정, 흡수 및 식체 성숙을 테스트하는 데 사용합니다. (~560/~585nm)입니다. Trypan Blue로 담금질할 필요가 없습니다.</td></tr><tr><td>pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis</td><td>Invitrogen</td><td>A10010</td><td>사멸 S. aureus pHrodo Red로 표지. 그람 양성 박테리아의 식세포 재조정, 흡수 및 식체 성숙을 테스트하는 데 사용합니다. (~560/~585nm)입니다. Trypan Blue로 담금질할 필요가 없습니다.</td></tr><tr><td>공압 PicoPump PV820</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820은 차압을 사용하여 주입 사이에 유리 바늘에 액체를 고정합니다. 사용자는 수동으로 가스 압력의 짧은 폭발을 제어하여 액체를 배출합니다. 나노리터 미만의 부피를 전달할 수 있습니다. 전달되는 액체의 양은 두 가지 주요 변수에 따라 다릅니다. 유리 바늘 개구부의 크기와 사출 압력이 가해지는 시간. 기기를 100ms로 설정 " 시간 초과" 모드.</td></tr><tr><td>S. aureus (단백질 A가 없는 목재 균주) 생체 입자, Alexa Fluor 488 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>S23371</td><td>Alexa Fluor 488로 표지된 S. aureus 사멸. 그람 양성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>S. aureus (단백질 A가 없는 목재 균주) 생체 입자, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>S23372</td><td>Alexa Fluor 594로 표지된 S. aureus 사멸. 그람 양성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~590/~617nm)</td></tr><tr><td>S. aureus (단백질 A가 없는 목재 균주) 생체 입자, 플루오레세인 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>E2851</td><td>사멸 S. aureus FITC(플루오레세인)로 표지됨. 그람 양성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)</td></tr><tr><td>얇은 벽 유리 모세 혈관</td><td>세계 정밀 기기</td><td>TW100F-3</td><td>주입 바늘. OD = 1.0mm</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Fluorescein, Alexa Fluor 또는 Texas Red 표지 입자의 세포 외 형광을 소멸시키는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>ZEISS SteREO 현미경 (Discovery.V8)</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>이미징 플라이용 도립 형광 현미경. 디지털 카메라(예: AxioCam HC 카메라) 및 함께 제공되는 소프트웨어(예: AxioVision 4.7 소프트웨어)를 사용하여 사진을 촬영합니다.</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>Z23373</td><td>Alexa Fluor 488로 라벨링된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>Z23374</td><td>Alexa Fluor 594로 라벨링 된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~590/~617nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>Z2841</td><td>FITC (Fluorescein)로 표지 된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>텍사스 레드로 라벨링된 사멸. 효모의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~595/~615nm)</td></tr></tbody></table>

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

모든 동물에서 타고 난 면제는 광범위 한 병원 균에 대 한 즉각적이 고 강력한 방어를 제공합니다. 체액과 세포 면역 응답은 타고 난 면제의 주요 지점 그리고 이러한 응답을 조절 하는 요인의 많은 무척 추 동물과 포유류 사이 보존 진화론은. 식 균 작용, 세포 타고 난 면제의 중심 구성 요소 특수 혈액 세포의 면역 시스템에 의해 수행 됩니다. 과일 파리, 초파리 melanogaster, 분자 메커니즘 먹어서 전체 동물에서의 생리 적 영향을 조사 하는 강력한 유전자 모델로 떠오르고 있다. 여기 우리 초파리 혈액 세포, hemocytes에 의해 입자 통풍 관 그리고 파괴를 계량을 vivo에서 먹어서 주입 기반 분석 결과를 보여 줍니다. 절차 수 연구원은 정확 하 게 제어할 입자 농도 복용량, 시간의 짧은 시간에 높은 재현성 결과 얻을 수 있습니다. 실험은 양적, 수행, 쉽게 그 영향 병원 체 인식, 이해, 및 허가 호스트 요소에 대 한 화면에 적용할 수 있습니다.

Vivo에서 먹어서 분석 결과 fluorescein 표시 된 입자를 사용 하 여의 회로도 그림 1A에 표시 됩니다. 파리 탑재 된 복 부 측 아래로 전기 테이프의 조각에 있으며 등 쪽 혈관이 있는 곳, 복 부의 첫번째 2 개의 세그먼트는 명확 하 게 보이는 (그림 1B). 실험적인 과실의 주요 소스는 주입 및 이미징 절차 (그림 1C)의 단계에서 발생 한다. 비행 조직 또는 입자 막힌 될 수 발생할 수 있습니다 같은 바늘을 사용 하 여 여러 파리를 삽입 ( 그림 1C에서 상단 왼쪽된 패널). Drosophila 자동-fluoresces GFP 빛 아래에서 때문에 막힌된 바늘으로 주입 하는 파리 희미하게 형광 하지만 분명, punctate 형광 ...

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

생체 내 식세포 분석에서 이것은 연구원이 성인 혈액 세포에 있는 phagocytosis를 통제하는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 유전 스크린 및 게놈 전체 협회 연구 결과를 실행하는 것을 허용합니다. 본 실험은 정량적이고, 수행하기 쉬우며, 병원균 인식, 섭취 및 통관에 영향을 미치는 숙주 요인에 대해 살아있는 동물의 선별에 적용될 수 있다. 바늘 풀러와 얇은 벽 유리 모세 혈관을 당긴 후, 현미경에서 바늘을 잡고 마이크로 미터를 사용하고, 번호 5, 미세 점, 스테인레스 스틸 핀셋을 사용하여 팁을 100 마이크로 미터 팁 직경으로 부수습니다.각 비행에 주입될 액체의 양을 측정하기 위해 PBS에서 멸균 5%의 식품 착색으로 모세관 바늘을 적재하고 0.01mm 단계 마이크로미터에 미네랄 오일 한 방울에 액체를 추방합니다. 밀리리터 입자당 1.6밀리리터10마이크로리터를 작은 파라필름 사각형에 분배하고 액체를 바늘로 당깁니다. 바늘을 인젝터 노즐에 장착하고, 마취된 파리를 플라이 패드의 지정된 영역을 따라 줄을 서서, 복부 쪽은 패드 의 앞쪽을 향합니다.벤치에 해당 영역에 바이알을 배치하고, 총 입자의 약 10 나노 리터를 제공하기 위해 액체의 5, 100 밀리초 펌프와 복부의 상단 모서리에 파리를 주입. 각 비행이 주입될 때 적절한 바이알로 전송하여 바이알의 시간을 지적합니다. 다음으로, 0.4%의 Trypan Blue 용액으로 새 바늘을 적재하고 공압 인젝터를 게이트에 설정하여 공기의 일정한 흐름이 바늘에서 액체를 밀어 낼 수 있도록 합니다.초기 주사 후 30 분, 복부가 가득 하고 불경해 할 때까지 Trypan Blue로 각 비행 복부를 주입하십시오. 전기 테이프, 복부 측면으로 현미경 슬라이드에 파리를 장착하고 날개를 플라이 의 측면으로 밀어 테이프에 고정하십시오. 그런 다음 머리를 테이프에 부드럽게 밀어 넣고 비행이 움직이지 않도록 합니다.모든 파리가 확보된 직후, 디지털 카메라와 컴퓨터에 부착된 반전형 형광 현미경에 한 번에 하나씩 곤충을 이미지하여 디지털 카메라용 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 각 비행의 등쪽 용기에 초점을 맞춘다. 그런 다음 실험 간의 노출 시간과 배율을 기록합니다. 형광을 정량화하려면 적절한 이미징 분석 프로그램을 열고 하나의 이미지를 엽니다.등쪽 용기의 형광 강도를 측정하려면 등쪽 용기 주위에 다각형을 그리고 측정을 선택하여 다각형 내부의 형광 강도를 기록합니다. 배경 형광 강도를

assessing-cellular-immune-response-fruit-fly-drosophila-melanogaster

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

면역 반응과 행동 사이의 링크를 이해하기 위해, 우리는에서 전위의 행동을 측정하는 방법을...

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

이 비디오는 살아있는 성충 파리를 주입하는 방법을 설명하며, 표식작용 분석을 위해 표지된 입자와 트리판 블루를 파리 복부에 주입하는 프로토콜의 예시를 포함하고 있습니다.

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이 비디오는 Drosophila melanogaster의 균질화된 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 이 방법은 자가사멸 세포 삼킴의 정도를 결정하여 세포 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.

Phagocytosis Assay: Drosophila melanogaster의 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술

이 비디오는 성체 초파리 파리의 세균성 식세포작용을 측정하기 위해 고안된 생체 내 분석을 보여줍니다. 성충 파리의 복부에 형광 표지된 박테리아를 주입한 후, 등쪽 혈관과 관련된 혈구는 식세포작용에 관여합니다. 트리판 블루 염료의 도입은 세포외, 비식세포작용 박테리아가 방출하는 형광을 소멸시키는 역할을 합니다. 이 담금질 과정은 형광 현미경으로 관찰할 때 식세포작용 박테리아의 식별을 향상시킵니다.

성체 초파리 파리에서 박테리아 식세포작용을 정량화하기 위한 In Vivo 분석

Drosophila melanogaster는 선천성 면역 체계와 감염 및 질병의 생리학적 결과를 연구하기 위한 뛰어난 모델 유기체입니다. 이 프로토콜은 강력하고 정량적으로 반복 가능한 박테리아 감염을 D. melanogaster에 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 설명합니다.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

초파리 혈액 세포 또는 혈구는 거주 부위와 순환 사이를 순환합니다.  유충에서 상주(고착성) 혈구는 유도성 미세환경인 Hematopoietic Pockets에 국한되는 반면, 순환하는 혈구는 혈림프에서 자유롭게 움직입니다. 이 프로토콜의 목표는 행동적으로 다르지만 상호 변화하는 이 두 가지 혈구 집단의 표준화된 분리 및 정량화입니다.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

CApillary FEeder (CAFE) 분석은 음식 섭취의 기저에 있는 메커니즘을 조사하기 위한 간단하고 예산 친화적이며 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 다재다능한 유전자 모델 유기체인 Drosophila melanogaster와 함께 사용되는 이 제품은 음식 섭취의 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

이 프로토콜은 소아 세포토균에 젊고 숙성된 Drosophila 멜라노가스터 혈구세포의 능력을 평가하고 정량화하는 데 사용되는 phagocytosis의 생체 내 분석방법을설명합니다.

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과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

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