Name: Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 마우스 간외 담관에서 3차원 오가노이드를 분리 및 배양하는 방법을. 이 기법은 담관세포 생물학 및 조직 재생 연구에 활용할 수 있는 성인 조직 특이적 모델을 제공합니다.

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이 작품은 간 질병 피나 클의 연구 상 (N.R.)에 국립 보건원, 국립 연구소의 당뇨병과 소화기를 위한 미국 협회 및 신장 질병 (N.R., J.L.M. P01 DK062041 P30 DK34933 수상)에 의해 지원 되었다. 이 방법론의 발달로 그의 도움에 감사 박사 라몬 Ocadiz-루이즈 (미시간 대학) 하 고.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 EHBD 절연 용 장비 및 재료의 준비
<ol><li>시드 매체 및 세척 버퍼 (자료 테이블) 50 ml에서 원뿔 관을 준비 하 고 그들에 게 사용까지 4 ° C에서 또는 얼음에 계속.</li>
	<li>수술 테이블 (그림 1B)를 설정 합니다. 멸 균된 수술 도구 (그림 1C)을 준비 합니다.</li>
	<li>미리 그것을 따뜻하게 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 살 균 24-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>얼음에 지 매트릭스의 약 수를 놓습니다. 지 매트릭스를 사용 하 여 완전히 액 화 하는 경우에.</li>
</ol>2. EHBD 절연 및 담 즙 Organoid 문화
<ol><li>
절연 및 마우스 EHBD의 단일 세포 현 탁 액의 준비
	<ol>
<li>기관 지침에 따라 (2 개월 이상)는 성인 마우스 안락사 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 복 부 구멍 중간 접근을 사용 하 여 열고 철회 횡 경 막에 간.</li>
		<li>부드럽게 당겨 한 hemostat와 근 위 십이지 간 hilum 아래 바로 있는 일반적인 담 관을 식별 합니다. 메스 블레이드를 사용 하 여 주변 조직에서 EHBD를 구분 합니다. 집게와 일반적인 담 관의 근 위 끝을 잡고, 바로 그 시점으로 십이지 장, 위의 distally 부 다음 간 (그림 1D)에서 덕트의 근 위 끝을 해 부. 즉시 버퍼를 세척 하는 감기에 고립 된 EHBD (그림 1E) 장소.</li>
		<li>세척 버퍼에서는 EHBD를 제거 하 고 살 균 메스 블레이드를 사용 하 여 0.5 m m 섹션으로 말하다. 절차 (그림 1B) 동안 조직 얼음 유리 접시에 놓습니다.</li>
		<li>분리 버퍼의 500 µ L을 포함 하는 튜브에 EHBD 섹션을 놓습니다. 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 얼음 처럼 차가운 세포 배양 매체의 500 µ L을 추가 하 여 분리 버퍼를 중화.</li>
		<li>20 번 각각 18 G와 G 20 바늘을 통해 진행 위아래로 세포 현 탁 액 triturate 세포 현 탁 액 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링을 50 mL 튜브에서 흐름 통해 수집 합니다. 참고: 미리의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 세포 현 탁 액의 흐름을 촉진 하기 위해 필터링 전에 500 µ L와 스 트레이너 상태.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EHBD organoids 설정
	<ol>
<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g 에 단계 2.1.5에서에서 흐름 통해 원심 분리기</li>
		<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한. 살 균 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 셀 resuspend 새로운 1.5 mL 튜브에는 물의 resuspension 전송. 2.2.1 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>원심, 후 조심 스럽게 씻어 셀 튜브 하단에 수집에서 상쾌한 제거. P200 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 액 화 차가운 지 매트릭스의 120 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 셀 공 물의 resuspension 지 매트릭스에서 얼음 목욕에서 수행할 수 있다.</li>
		<li>미리 데워 진된 24-잘 접시에 잘의 중심에 지 매트릭스에서 셀 물의 resuspension의 40 µ L 플레이트. 참고: 거품 형성을 방지 지 매트릭스를 조작 하는 동안 공기를 suctioning 하지 마십시오.</li>
		<li>지하실 또는 지하실 매트릭스 경화 될 때까지 15 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터를 매트릭스에 resuspended 세포와 접시를 반환 합니다. 시드 매체의 600 µ L을 각 영역 (자료 테이블) 37 ° C까지 예 열을 추가 합니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
		<li>시드 중간을 3 일에 그 후에 3 일 마다 신선한 organoid 문화 매체의 600 µ L에 바꿉니다. 거꾸로 현미경으로 모니터 organoid 성장입니다. 다운스트림 응용 프로그램 또는 분할 intraluminal 파편과 organoid 붕괴의 축적 하기 전에 모든 7 ~ 9 일에 대 한 사용 organoids (그림 2A) 관찰 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD Organoid 통로 및 저장
<ol><li>
EHBD organoids 1:3 1:4 7 9 일 마다 통과
	<ol>
<li>우물에서 매체를 제거 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS의 400 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 pipetting 혼합물을 위아래로 10 배는 잘에서 여는 organoids resuspend. 1.5 mL 튜브에 혼합물을 전송.</li>
		<li>통로 4 25g 바늘을 통해 혼합물은 organoids 해리를 시간. 400 x g 4 ° c.에 4 분 대에서 혼합물을 원심</li>
		<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한 지 매트릭스 (1:3 1:4) 추가 (2.2.4 단계.) 경작에서 셀 resuspend 또는 추가 처리를 위해 얼음 차가운 PBS 가진 세포를 씻어. 참고: 일반적으로, 250-300 셀 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 24-잘 접시에 도금 된다. 효율성을 도금 하는 것은 organoids의 수를 세 초기 세포 수에서 그들의 %를 계산 하 여 뿌리고 후 3-5 일째에는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 밝은 분야 현미경 검사 법에 의해 평가할 수 있습니다. mRNA는 EHBDOs guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬 적 출을 사용 하 여 표준 프로토콜을 사용 하 여 PBS로 세척 으로부터 격리 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EHBD organoids의 장기 저장
	<ol>
<li>우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS와 organoids 세척. 지하실 매트릭스 드롭 방해 하지 않고 잘에서 PBS를 제거 합니다.</li>
		<li>매체는 잘 얼어 얼음 처럼 차가운 셀의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 액상된 지 매트릭스와 매체를 동결 하는 셀에 organoids resuspend과 극저온 튜브에 혼합물을 전송.</li>
		<li>수증기 단계에서 48 h. 전송-80 ° C에서 튜브 장기 저장을 위한 질소 탱크 병을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Organoid Pprocessing 파라핀 포함
<ol><li>5 ~ 10 배 아래로 pipetting으로 얼음 처럼 차가운 PBS (4 ° C)의 500 µ L에서 EHBDOs를 resuspend. 1.5 mL 튜브에 액 화 지 매트릭스에서 resuspended EHBDO를 수집 합니다. 참고: Organoids 위반을 피하기 위해, 하단의 P1000 팁의 2-3 m m 잘라 고는 상쾌한을 매우 신중 하 게 제거.</li>
	<li>5 분에 대 한 350 x g 에서 원심 분리기 EHBD organoids 조심 스럽게 organoid 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 제거.</li>
	<li>얼음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL는 organoids에 추가 하 고 4% PFA 4 ° c.에서 하룻밤에 organoids를 품 어 4% 제거 PFA 하룻밤 부 화 후 P1000 팁을 사용 하 여 organoids에서.</li>
	<li>organoids와 함께 튜브를 실내 온도 PBS의 1000 µ L을 추가 하 고 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어. 원심 350 x g 5 분 반복에서 PBS에 organoids와 튜브가이 과정 두 번 더.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고는 organoids에 30% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 실시간에서 5 분 동안 품 어</li>
	<li>실시간 제거 30% 에탄올에 5 분 동안 350 x g 에서 튜브 원심 70% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어</li>
	<li>350 x g 5 분 제거 70% 에탄올에 centrifugate. 100% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 실시간에 5 분 동안 품 어 참고: Organoids 추가 처리 전에 최대 48 h에 대 한 실 온에서 100% 에탄올에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>견본 프로세싱 젤 20 전자 레인지에가 열 s 또는 액 화 될 때까지. 표본 처리 organoids와 튜브로 젤의 50 µ L를 추가 합니다. 젤을 처리 하는 견본 경화 될 때까지 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>표본 튜브에서 organoids 젤 처리 방울을 제거 하 고 조직 프로세서에서 추가 처리를 위해 카세트에 파란색 스폰지 패드 사이 장소. 파라핀 embedder의 각 단계에 대 일 분을 사용 하 여 처리 하는 동안...</li>
	<li>섹션 파라핀 포함 organoids 견본 처리에서 앞에서 설명한16얼룩 immunohistochemical와 4 µ m. 진행 젤.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li>
<li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+the+Wild+West+of+Organoids%2C+Enteroids%2C+and+Mini-Guts%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

이 작품의 마우스 EHBD cholangiocytes organotypic 3 차원 모델의 생성을 설명합니다. 췌 장 세포 오염, 세균 및 곰 팡이 오염 및 피하기 위해 원심 분리 후 주의 조작 방지 하기 위해 살 균 조건의 유지 보수를 방지 하려면 세심 한 EHBD 해 부를 포함 하는 EHBDO 문화 세대의 중요 한 단계는 세포질 물자의 손실입니다. 설명된 온도 조건에 가까운 준수가 필요 합니다. 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 성인 생쥐의 EHBDs는 작은 (약 1 m m 직경; 그림 1E)는 격리 기교가 필요합니다. 해 부 현미경 해 부 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용 되는 지하실 매트릭스 알려진 및 알 수 없는 성장 요인19의 농도 로트에서 다를 수 있습니다 포함 된 생물학 매트릭스가입니다. 기술 복제, 동일한 많은 또는 약 수 지 매트릭스의 사용 ...

Cholangiopathies는 내부-및 extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)1에 있는 담 즙 셀에 영향을 주는 불 치 만성 진보적인 장애. 기본 차 경화 담 관 염, cholangiocarcinoma, 담 즙이 폐쇄 증, choledochal cysts 같은 일부 cholangiopathies EHBDs에 주로 영향을 줍니다. Cholangiopathies에 대 한 치료의 개발 전 임상 모델의 제한 된 가용성에 의해 제한 됩니다. 또한, 이전 연구 cholangiopathies 그룹화에 초점: 간, 내부 및 EHBDs. 그러나, 내부-및 EHBDs 다른 배아 기원 있고, 따라서, 명료한 분자 병 리도 고려 되어야 한다. Intrahepatic 담 즙 덕트 intrahepatic ductal 접시와 간장 계실의 두개골 부분에서 개발, 전체 EHBDs 간 계실2의 꼬리 부분에서 개발. 그들은 또한 성인 항상성, intrahepatic 담 즙 덕트 및 EHBDs2,3peribiliary 동맥에서 Hering의 운하를 포함 하 여에 대 한 다른 조상 세포 구획에 의존. 전 임상 연구를 위한 동물 모델의 사용 비용에 의해 제한 하 고 윤리적인 이유로 최소화 한다. 따라서, reductionist, 재현성, 시간 및 비용 효율적인 체 외 모델은 매우 바람직하다.
Cholangiopathies의 대부분의 이전 연구 활용 일반 마우스 또는 쥐 암 모델, 또는 인간의 cholangiocarcinoma 셀 라인 내부-및 EHBDs4,5,,67에서 파생 된. 그러나,이 변형 된 세포의 모델 이며 정상적인 cholangiocyte 생물학 항상성 또는 정상 상태에서를 정리 하지 않습니다. Organotypic 문화 모델의 개발에 최근 진행 다른 조직 종류, 하지만 하지 일반 마우스 EHBDs8,9, 간담 조직를 포함 하 여 3 차원 구조의 개발을 허용 했다 10. 이러한 "기관" 구조로 기본 조직을 흉내 낸 겨냥 하 고 기관 특정 줄기/뿌리 세포11의 자기 갱신을 지 원하는 인공 틈새에서 성장 된다.
"Organoid"는 광범위 한 용어는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 파생 된 3 차원 조직 모델을 설명 합니다. Organoids 재설정된 pluripotent 줄기 세포 배아 줄기 세포로 표현 하 고 유도 만능 줄기 세포에서에서 생성 될 수 있습니다. 그들은 또한 기관 특정 성인 줄기 세포12에서 생성 될 수 있습니다. 일부 cholangiocyte organoid 모델 이전 연구에서 제안 되었습니다. 따라서, 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 보고7,,913 이었고 다른 세포 유형의 동시 세대에 대 한 수 가치, 시간 효율적인 도구를 제공. 그러나, 이러한 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 organoids 구조와 기본 성인 EHBD cholangiocytes의 기능 완벽 하 게 반영 하지 않습니다.
인간의9 의 성인 줄기 세포에서 파생 된 Organoids 그리고 고양이10 간도 제안 했다. 고양이 모델 널리 사용 되지 않으며 도구 armamentarium 연구 목적에 대 한 제한. 또한, 이러한 간 파생 성인 줄기 세포 유래 organoids extrahepatic cholangiocytes 하지만 오히려 intrahepatic cholangiocytes 모델 하지 않습니다.
EHBD organoid 세대는 인간의 정상적인 EHBDs14 와 마우스 EHBD cholangiocarcinoma15에서 보고 되었다. 그러나, 인간의 EHBD 조직에 대 한 액세스는 매우 제한 된, 그리고 cholangiocarcinoma15 의 유전자 murine 모델에서 파생 된 organoids 항상성에서 건강 한 cholangiocyte 생물학을 대표 하지 않는다 유전자 변형 세포에서 파생 됩니다.
만능 줄기 세포 및 간 파생 된 cholangiocyte organoid 모델 및 전 임상 모델에서 필요한 인간의 조직에 대 한 제한 된 액세스의 한계를 해결 하기 위해 우리는 murine EHBD organoid 모델 (그림 1A)를 개발 했다. 이 원고 마우스 성인 조직에서 EHBD 파생 된 organoids에 대 한 기술 개발을 설명합니다. EHBDOs 라는이 EHBD organoids EHBDs cholangiocyte 항상성 및 질병 과정, cholangiopathies 같은 기본 메커니즘의 연구에 대 한 중요 한 생체 외에서 도구가 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>L-WRN 세포 배양 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Washing buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amphotericin B&nbsp;</td><td>6.25 &마이크로; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td>Organoid 배양 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 컨디셔닝 매체&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-글루타민</td><td>10 &마이크로; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &마이크로; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &마이크로; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td>Organoid 시딩 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Organoid 배양 배지&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 (CK19) 항체, Rabbit</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) 항체, Rabbit</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) 항체, Rabbit</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>E-cadherin 항체, Goat</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Acetylated &alpha;-tubulin 항체, Mouse</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 표지된 항토끼, 당나귀 IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 표지된 항염소, 당나귀 IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 표지된 항-마우스, 염소 IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt 리포터 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TopFlash HEK293 세포주</td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>루시페라제 분석 키트</td><td></td><td>비오튬</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td></td><td>라이프 테크놀</td>로지스 <td>25300054</td></tr><tr><td>0.4% 트리판 블루 솔루션</td><td></td><td>라이프 테크놀</td>로지스 <td>15250061</td></tr><tr><td>추가 재료 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basement 매트릭스, 페놀 프리 Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Dissociation buffer, Accutase</td><td></td><td>Gibco A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture 동결 배지, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Cell strainer (70 &micro; m, 멸균)</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate-phenol RNA 추출, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>검체 처리 젤, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>범용 마이코플라즈마 검출 키트</td><td></td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td></td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E800</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>부검 트레이</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-814-61</td></tr></tbody></table>

organoids 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)에 영향을 미치는 담 즙이 폐쇄 증, 기본 차 경화 담 관 염, 및 cholangiocarcinoma 포함 됩니다. 그들은 효과적인 치료 옵션이 있다. EHBD를 공부 하는 도구는 매우 제한 됩니다. 우리의 목적은 야생 유형 및 유전자 조작된 생쥐에서 쉽게 생성 될 수 있는 기관 특정, 다목적, 성인 줄기 세포 유래, 전 임상 cholangiocyte 모델을 개발 했다. 따라서, 우리는 성인 마우스 EHBDs에서 EHBD organoid (EHBDO) 문화 시스템 개발의 새로운 기술에 보고 합니다. 모델은 비용 효율적이 고 쉽게 분석할 수 있으며 여러 다운스트림 응용 프로그램. 특히, 마우스 EHBD 절연 및 단일 세포 분리, organoid 문화 개시, 전파, 그리고 장기적인 유지 관리 및 저장의 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 EHBDO를 실시간 양이 많은 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (qRT-PCR) immunohistochemistry, 형광 현미경 검사 법, 그리고 mRNA 풍부 정량에 대 한 처리를 설명 합니다. 이 프로토콜 EHBD 특정 organoids를 생산 하는 것 외에도 중요 한 장점이 있습니다. L WRN 셀에서 조건 화 된 매체의 사용은 크게이 모델의 비용을 줄일 수 있습니다. 마우스 EHBDs 사용 하 여 거의 무제한 조직을 문화 세대, 인간의 조직 달리 합니다. 생성 된 마우스 EHBDOs endodermal 조상의 표식이 있는 상피 세포의 순수한 인구를 포함 하 고 담 즙 세포 분화. 교양된 organoids 여러 통로 통해 동일한 형태를 유지 하 고 액체 질소에는 장기 저장 후 복구할 수 있습니다. 모델 담 즙 조상 세포 증식의 연구에 대 한, 약리학, 조작할 수 있으며 유전자 조작된 생쥐에서 생성 될 수 있습니다. 미래 연구는 도금 효율을 평가 하는 기능 세포 성숙, 직접 세포 분화 배양 조건 최적화 필요 합니다. 개발 공동 문화 모델과 더 생물학적으로 중립 세포 외 매트릭스의 바람직한 있습니다.

우리의 프로토콜 마우스 EHBD organoids는 조직 관련 성인 줄기 세포 유래의 생성을 설명 합니다. 후에 organoids 교양, 낭 성 구조 형성 빠르면 1 일 EHBD 격리 후 관찰할 수 있습니다. 섬유 아 세포와 오염 문화 생성 하는 동안 일반적으로 관찰 하지. EHBDO 도금 효율은 약 2% (2 개월 이상) 신생아 또는 성인에서 고립 된 쥐 (그림 2B). EHBD organoids의 효율성을 도금 파생 성인 쥐에서 증가에 통로 2와 남아 안정 (그림 2B)에 11%. Organoids의 대다수는 드문 "불규칙 한" organoids (그림 2C-E)와 함께 모든 구절을 통해 낭 성 형태를 보여 줍니다. Organoids 5-7 일 후 그들은 축적 intralumin...

이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

이 뮤린 외형 담관 오르가노이드 시스템은 전임상 담관증 모델에 대한 제한된 접근과 다능성 줄기 세포 및 간 유래 콜린고이티테 오르가노이드 모델의 한계를 해결할 수 있습니다. 우리의 모델은 성인 조직 특정, 감소주의자, 재현 가능, 시간과 비용 효율적인. 그것은 인간의 조직에 액세스 할 수없는 실험실에 특별한 도움이 될 것입니다.우리의 기술은 조직 재생 및 세포 대 세포 상호 작용을 연구하기 위하여 외형 담관 cholangiocytes의 거의 무제한 수의 배양을 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 의사 인 주야 시오타 (Junya Shiota)가 될 것입니다. 간 내 담관 격리의 경우 성인 마우스를 척추 위치에 놓고 중간선을 따라 복강을 엽니다.횡격막에 휴식 간을 철회하고 부드럽게 간 힐룸 바로 아래 일반적인 담관을 공개하는 근위 십이지장 당기기 기 위해 hemostat을 사용합니다. 메스를 사용하여 외형 담관과 주변 조직을 분리하십시오. 집게와 일반적인 담관의 근위 끝을 잡고, 간에서 덕트의 근접 끝을 해부하기 전에 십이지장과 그 시점 바로 위에 덕트를 해부.즉시 격리 된 외형 담관을 얼음에 차가운 세척 버퍼가 들어있는 유리 접시에 넣은 다음 주변 조직에서 담관을 청소하고 0.5 밀리미터 섹션으로 다진다. 모든 조직이 다진 경우, 37섭씨에서 20분 배양을 위해 500마이크로리터의 해리 버퍼를 포함하는 튜브로 섹션을 옮기십시오. 해리의 끝에서, 얼음 차가운 세포 배양 배지의 500 마이크로 리터로 버퍼를 중화하고 18 게이지 바늘을 통해 조직 현탁액을 20 번 세례한 다음 20 게이지 바늘을 통해 20 회.그런 다음 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 생성된 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 필터링합니다. 담즙 오르간 배양을 설정하려면 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 얼음 감기, 멸균 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 두 번째 원심분리를 위해 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.세척된 펠릿을 액화, 얼음 차가운 지하 매트릭스 120마이크로리터로 재차 중단하고 40마이크로리터의 세포를 37도의 3개의 우물 의 중심으로 한 다음, 약 15분 동안 37도의 섭씨 조직 배양 배양에 접시를 놓습니다. 지하 매트릭스가 고화되면 플레이트를 인큐베이터로 되돌리기 전에 각 양에 섭씨 37도의 마이크로리터 600개를 첨가합니다. 그 후 3일마다 파종 배지를

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

신생아 생쥐의 간외 담관에서 cholangiocytes을 분리하는 기술을 설명한다. 덕트 꼼꼼하게 해부 한 다음 세포는 두꺼운 콜라겐 젤의 부산물에 의해 격리됩니다. 이 방법은 간외 담관 개발 및 병리 공부를위한 유용한 도구를 제공합니다.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

우리는 마우스 간에서 담관 밀도의 정확한 정량화를 위한 다소 간단하고 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법은 유전 및 환경 수정자의 효과와 담즙 질환의 마우스 모델에서 잠재적 인 치료의 효과를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스 간에서 담관 밀도 결정

우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

3차원(3D) 셀룰러 시스템은 유기발생을 조사하기 위한 관련 모델이다. 담즙 낭종 생산 및 특성화를 위한 하이드로겔 기반 방법이 제안됩니다. 이 프로토콜은 낭종 형성 효율, 크기를 평가하고 기능을 테스트하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법으로 3D 특성화의 장벽을 해명합니다.

기능성 및 편광 담즙 상피 낭종의 생성 및 정량적 특성화

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

환자 종양에서 생성된 오가노이드를 생쥐 간에 항소적으로 주입합니다. 종양이 없는 간 조직의 절제는 종양이 위치한 간 조직에 재생 환경을 조성합니다.

간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

배우세요 마우스 간외 담관에서 3차원 오가노이드를 분리 및 배양하는 방법을. 이 기법은 담관세포 생물학 및 조직 재생 연구에 활용할 수 있는 성인 조직 특이적 모델을 제공합니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

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