Name: 카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 학습하세요 CFSE 염색을 이용한 증식 CD4+ T 세포 정량화 방법으로, 항원 특이적 희귀 면역 세포를 검출하고 분리하는 기술입니다. 이 프로토콜은 자가면역 질환 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품에 의해 지원되었다: 청소년 당뇨병 연구 재단 [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). 국립 보건 의료 연구 위원회 (NHMRC GNT123586) (S.M.), 당뇨병 호주 연구 신탁 밀레니엄 상 (Y17M1-MANS) (S.M.), 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (S. M., A.D., E.T., M.S.), 및 NHMRC 대학원 장학금 APP1094337 및 JDRF 박사 학위 업 장학금 (M. S.).

모든 피험자는 말초 혈액을 수집하기 전에 정보에 입각한 동의를 했습니다. PBMC를 사용 하 여 실험에 대 한 윤리적 승인 세인트 빈센트의 hosptial에 의해 주어졌다 (HREC-A 135/08, 그리고 HREC-A 161/15).
1. 시약 준비
<ol><li>
휴먼 T 세포 매체
	<ol>
<li>RPMI 1640, 1x 비필수 아미노산, L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드(2 mM), 페니실린(100 U/mL)/스트렙토미신(0.1 mg/mL), 그리고 5% 풀링된 인간 혈청(PHS)으로 구성된 RP-5 미디어를 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CFSE 재고 솔루션
	<ol>
<li>5 mM의 농도로 최종 재고 솔루션을 달성하기 위해 DMSO의 ~ 9 mL에 25 mg의 CFSE를 용해시킴으로써 마스터 스톡을 준비합니다.</li>
		<li>PBS의 마스터 스톡을 희석하여 작업 재고를 준비하여 10 μM의 작업 농도를 달성합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 전혈에서 인간 PBMC의 준비
<ol><li>인간 말초 혈액의 0.5-1.5 x 106 PBMC/mL 사이 일반적으로 있습니다. 따라서 필요한 혈액의 양은 원하는 PBMC 수에 따라 달라집니다. 적어도 1:2 PBS로 인간 말초 혈액을 희석. PBMC를 50 mL 튜브에 15 mL의 밀도 구배 배지를 추가한 다음 희석된 전혈 35 mL를 오버레이합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 감속 없이 15분 동안 850 x g의 원심분리기. 이것은 3개의 명확한 층 귀착될 것입니다: 적혈구 펠릿을 포함하는 하단 층, 그것의 상단 인터페이스를 일렬로 세우는 백혈구를 가진 조밀도 구배 매체의 중간 층, 및 상부 혈장 층14.</li>
	<li>상부 플라즈마 층의 약 20 mL를 제거합니다. 적혈구 펠릿을 피하기 위해주의, 백혈구 층을 수집합니다. PBS로 3x를 씻고 혈세포계에서 trypan 파란색 제외를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산하십시오. PBS에서 1 x 106 PBMC /mL로 희석하십시오.</li>
	<li>
비 CFSE 염색 세포
	<ol>
<li>이들 세포는 유세포측정을 위한 보상 대조군으로서 사용되며, 무스테인 및 CD4+ 단일 염색 된 세포로 구성된다. 각 대조군 샘플 PBMC 현탁액의 300 μL을 10 mL 튜브에 추가하고, PBS가 있는 상단, RT에서 5분 동안 550 x g의 원심분리기를 넣습니다.</li>
		<li>RP-5 미디어에서 1 x 106 셀/mL을 다시 일시 중단합니다. 이러한 표지되지 않은 세포를 CFSE 표지 된 세포와 함께 37 °C / 5 % CO2 인큐베이터에서 7 일 동안 배양하십시오 (단계 2.6.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CFSE 염색 된 세포
	<ol>
<li>2.3단계에서 세포를 50 mL 튜브로 옮김. 튜브 측면에 셀 현탁액 1mL당 CFSE 작업 스톡 솔루션(10 μM)을 1.0 μL 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 빠르게 섞어 보냅니다. CFSE의 최종 농도는 10 nM입니다.</li>
		<li>37°C/5% CO2 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다. 염색을 중지하려면 RP-5 매질 5 mL을 추가하고 550 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛하십시오. RP-5 미디어에서 1 x 10 6/mL에서 PBMC를 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>10 mL 튜브에 1.0 mL의 셀 현탁액을 추가하십시오. 각 항원마다 하나의 튜브를 사용하여 검사합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 PBMC 및 세포 배양의 항원 자극
	<ol>
<li>배양 인간 CFSE-37°C/5%CO2 인큐베이터에서 7일 동안 RP-5 배지에서 항원을 가진 PBMC를 표지하였다. 배양 1 x 105 세포 / 웰 (100 μL) 희석 된 항원을 함유하는 RP-5 배지의 100 μL / 웰을 가진 96 웰 플레이트. 참고: 작업 농도를 포함하여 사용되는 항원들은 표1에 요약되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FACS 분석을 위한 반대로 CD4 염색
<ol><li>배양된 세포의 피펫 200 μL을 FACS 튜브내로, 0.1% FCS를 함유하는 PBS의 1.0 mL에서 1x, 550 x g에서 5분 동안 원심분리기를 세척한다.</li>
	<li>반인간 CD4 알렉사 플루어 647 (0.25 mg/mL)의 100 μL의 PBS/0.1% FCS로 얼룩. FACS CFSE 보정을 설정하는 데 사용할 다른 형광단과 함께 얼룩이 없는 CFSE 라벨이 부착된 세포의 샘플을 제쳐두십시오. 4 °C에서 세포를 20 분 동안 빛으로부터 보호하여 배양하십시오.</li>
	<li>1 mL의 PBS/0.1% FCS를 추가하여 세포를 세척하고, RT에서 5분 동안 550 x g의 원심분리기를 추가하고, 100 μL의 PBS/0.1% FCS로 다시 정지합니다. FACS 분석 직전에, 모든 튜브에 프로피듐 요오드화물 1 μL(PI, 0.1 mg/mL)을 추가하여 죽은 세포가 유세포 분석에 의해 배제될 수 있도록 합니다.</li>
</ol>4. 유량 세포 측정 구성 및 게이팅 전략
참고: 도 1은 보정 제어 및 게이팅 전략을 포함하는 FACS 구성을 보여 군요.
<ol><li>게이트 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) (그림1A)모든 림프구를 포함하는 집단.</li>
	<li>Pi 음성 세포에 대한 FSC 대 PI(그림1B)모집단을 게이트하여 세포 사멸 세포를 배제한다.</li>
	<li>얼룩지지 않은 셀을 사용하여 비형광 전지에 대한 전압 기준을 설정합니다. 형광 신호가 각각 1,000 미만이되도록 CD4-A647 및 CFSE의 전압을설정합니다(그림 1C). 단일 색상 컨트롤 CFSE(그림1D)및 CD4-A647(그림1E)을사용하여 스테인이 없는 셀로 설정된 전압을 사용하여 각 색상에 대해 양수 형광 신호(~10,000)를 확인합니다.</li>
	<li>CFSE 및 PI에는 약간의 스펙트럼 이첩이 있습니다. CFSE 전용 샘플이 PI 채널에서 신호를 생성하지 않을 때까지 CFSE 형광에서 PI 형광을 빼기 위해 보정을 조정합니다. 참고: 이들 게이트는 본명세서에서 분석된 모든 샘플에 적용되었다.</li>
</ol>5. 항원 특이적 CD4+ T 세포 증식을 열거하는 세포 분열 지수 계산
참고: 세포 분열 지수(CDI)는 5,000개의분할되지 않은 셀당 분할된 셀(CD4+ /CFSE dim)의 수를 의미한다(CD4+/CFSE밝은). 분할되지 않은 CD4+ 세포의 수가 정확히 5,000이 아닌 경우, 분할된 셀의 수는 5,000개의 분할되지 않은 세포당 분할된 세포의 수를 발현하도록 보정된다. 예를 들어, 파상풍 독소 특이적 증식(도2D)을사용하여, 4,930개의 분할되지 않은 세포(CFSEbright)및 3,268개의 분할 된 세포(CFSE dim)가 있었다; 따라서 분할된 셀의 수정된 수는 (5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3입니다.
<ol><li>CDI(표1)를 계산하여 항원 자극군으로부터 분할된 세포/5,000개의 분할된 세포의 수를 항원 없이 배양된 세포로부터의 평균 분할 된 세포 수(5,000개의 분할되지 않은 세포당)로 나눈 값(표 2).</li>
</ol>

<ol><li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+BrdU+and+3H-Thymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation%2C+position+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106, 87-95 (2002).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).</li>
<li>Ten Brinke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+T-cell+responses+in+translational+studies%3A+Optimization+of+dye-based+proliferation+assay+for+evaluation+of+antigen-specific+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).</li>
<li>Gillespie, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+Conservation+and+Altered+T+Cell+Cross-Reactivity+Characterize+a+B%2A57-Restricted+Immune+Response+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolgy%22%5BJournal%5D)">Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection.</a> Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).</li>
<li>Tynan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structures+of+Highly+Bulged+Viral+Epitopes+Bound+to+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I%3A+Implications+for+t-cell+receptor+engagement+and+t-cell+immunodominance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).</li>
<li>Blanchard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+aminopeptidase+associated+with+antigen+processing+defines+the+composition+and+structure+of+MHC+class+I+peptide+repertoire+in+normal+and+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells.</a> Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specificity+groups+in+the+T+cell+receptor+repertoire+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire.</a> Nature. 547, 94-98 (2017).</li>
<li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+cloning+human+autoantigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).</li>
<li>So, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin+C-peptide+is+an+autoantigen+in+people+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+Virus+Growth-transformed+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).</li>
<li>Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expansion+of+high+or+low+avidity+cytotoxic+T+lymphocytes+and+efficacy+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

CFSE-기반 증식은 항원 특이적 인간 CD4+ T 세포를 검출하고 열거하는 간단하고 강력한 방법이다. 이전에는 최적의 결과 4에 대해 CFSE의 최적농도를 사용하는 것이 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 너무 많은 CFSE는 증식을 폐지하는 반면, 너무 적게는 분할된 세포와 분할되지 않은 세포가 구별되는 것을 허용하지 않습니다. 대조적으로, CFSE의 상대적으로 높은 농도 (5.0 μM)는 정제 된뮤린 T 세포를 라벨에 사용된다 3. 배치 간의 가변성으로 인해 각 배치를 적정하여 최적의 농도를 결정하는 것이 좋습니다. 우리는 원래 간행물 (200 nM)에서보다 훨씬 낮은 농도 (10 nM)에서 현재 배치를 사용4.
이 방법의 또 다른 중요한 양상은 항원 용량의 최적화입니다. 적은 항원으로 배양된 T 세포가 더 민감하고 향상된 기능을...

항원 특이적 T 세포를 검출하고 연구하는 능력은 세포 매개 면역의 연구에서 중요하다. 그러나, 이렇게 하는 것은 매우 약하고 검출하기 어려운 자기 항원 특정 CD4+ T 세포 반응을 위해 특히 도전적입니다. 항원 특이적 림프구 증식의 검출에 사용되는 일반적인 방법은 [3H]-티미딘이며, 이는 증식 세포의 DNA에 통합된 방사성 표지된 뉴클레오티드이다. [3H]-티미딘 분석법은 DNA 합성을 검출할 수 있지만, 이 방법은 DNA 합성이 유사분열과 독립적으로 개시될 수 있기 때문에 세포 분열을 간접적으로 측정한다(즉, 유전자 복제 및 세포자멸 1). 이 문제는 세포의 항원 특이적 증식이 상당한 세포 자멸 2를초래할 수 있다는 사실에 의해 복합되어 항원 특이적 증식의 잠재적 인 과대 평가로 이어진다. 더욱이, [3H]-티미딘 방법은 항원 펩티드로 자극된 PBMC에서 CD4+ 또는 CD8+ 계보 증식과 같은 림프구증증을 위한 자형질 정보를 제공하지 않는다.
2003년에는 CFSE 기반 증식 분석3,4라고불리는 CFSE를 이용한 최초의 염료 희석 분석법을 발표했다. CFSE는 세포내 리신 잔류물과 공유 결합을 형성하여 세포내 단백질에 안정적으로 결합하는 형광 염료입니다. CFSE 표지된 단백질은 딸 세포3사이에서 동등하게 분할되기 때문에, 분할된 세포는 또한 림프구 집단의 양적 자형질에 허용하는 유세포 측정에 의해 분할되지 않은 세포에서 구별될 수 있습니다. 실제로, CFSE 염색 의 시간에서 세포가 겪은 분열의 수는 어느정도 5까지 측정될 수 있습니다. 최근에는 셀트레이스 바이올렛 증식 염료(VPD) 및 CytoTrack 염료와 같은 유사한 염료가 많이 개발되어 유사한 방식으로 작용하고있습니다6. 이 프로토콜은 CFSE에 중점을 두지만 원칙은 다른 관련 염료에도 동일하게 적용됩니다.
펩타이드-MHC 테트라머 염색은 항원 특이적 CD8+ T 세포를 검출및 복제하는 데 널리 사용되는 방법이다. 이것은 잘 확립 된방법 7,8,9,10; 그러나, tetramer 기지를 둔 복제는 에피토프/MHC 제한의 기존 지식을 요구하고 각 에피토프는 새로운 에피토프 특이적 T 세포의 발견 그리고 복제의 범위를 제한하는 그것의 자신의 tetramer11를요구합니다. CFSE 기반 증식은 펩티드, 단백질 또는 세포 용해와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 간단하고 견고하며, 반응하는 CD4+ T 세포는 다운스트림 기능성 및 생화학적 특성 분석기12,13에사용하기 위해 정렬될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Anti-human CD4-AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>317422</td><td>RRID:AB_2716180</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td><td>ThermoFisher</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1x)</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1</td><td>Sino Biological</td><td>40010- V07E</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (1x)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (1x)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>풀드 인간 혈청</td><td>호주 적십자사</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프로인슐린 C-펩티드 PI33-63</td><td>Purar Chemicals</td><td>N/A</td><td>Custom 합성 펩타이드</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>파상풍 톡소이드 단백질</td><td>Statens Serum Intitut</td><td>N/A</td><td></td></tr> 제작</tbody></table>

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 cd4+ t 세포의 정량화

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

기재된 것은 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 항원 특이적 CD4+ T 세포 증식을 측정하기 위한 간단한, 시험관내, 염료 희석-기반 방법이다. 카르복시플루오레세인 슈치니미딜 에스테르(CFSE)와 같은 안정적이고 무독성형 형광 염료의 발달은 유세포분석으로 검출된 바와 같이 형광 염색의 감소에 의해 방관자로부터 구별되는 희귀한 항원 특이적 T 세포를 허용한다. 이 방법은 대체 접근법에 비해 다음과 같은 장점을 갖는다: (i) 저주파 T 세포에 매우 민감하며, (ii) 항원 또는 에피토프에 대한 지식이 필요하지 않으며, (iii) 반응 하는 세포의 표현형을 분석할 수 있고, (iv) 실행 가능하고 반응한다. 셀을 정렬하고 T 세포 복제와 같은 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

파상풍 독소 단백질을 가진 인간 PBMC의 시험관 내 자극: PBMC는 CFSE로 염색하고 파상풍 독소의 존재에서 7일 동안 자극하였다. 거의 모든 기증자는 파상풍 독소가 유용한 긍정적 인 대조군 항원을 만드는 예방 접종을 받았기 때문에 파상풍 독소에 강한 T 세포 반응을 보였다. 도 2는 비자극된 PBMC로부터의 CD4+ T 세포의 CFSE 증식이 미미하였다는 것을 3중으로 입증한다(~12 CFSE희미한 세포; 그림 2A , B,C)파상풍 독소에 반응하여 CD4+ T 세포의 현저한 증식이 있었는 반면 (&gt;3,000 CFSE희미한 세포; 그림 2D , E,F).
...

여기에 제시된 것은 염료 희석을 이용한 항원 단백질 또는 펩티드에 반응하여 증식CD4+ T 세포를 측정하기 위한 프로토콜이다. 이러한 분석종은 희귀 항원 특이적 T 세포에 특히 민감하며 항원 특이적 세포의 복제를 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다.

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

이 프로토콜은 종종 약하고 감지하기 어려운 CD4T 세포 응답을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 항원 프리젠 테이션에 관한 사전 지식없이 CD4T 세포의 검출, 열거 및 격리를 허용합니다. 주요 장점은 타입-1 당뇨병과 같은 자기 면역 조건과 관련되었던 아주 수시로 희소한 인구인 CD4T 세포의 분석입니다.건강한 기증자로부터 말초 혈액 샘플을 얻으면, 50 밀리리터 튜브에서 밀도 그라데이션 배지의 15 밀리리터 를 통해 35 밀리리터의 혈액을 겹쳐지기 전에 PBS에서 적어도 1 대 2 비율로 혈액을 희석시하십시오. 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고 결과 상단 플라즈마 층의 약 20 밀리리터를 제거합니다. 그런 다음 적혈구 펠릿을 피하고 신선한 PBS에서 세포를 세 번 씻기 위해 주의를 기울이는 백혈구 층을 수집합니다.계산 후, PBS 농도의 밀리리터 당 제6 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC에 10배씩 세포를 희석한다. 개별 10 밀리리터 튜브에 각 제어를 위한 300 마이크로리터의 세포를 추가합니다. PBS로 각 튜브를 토핑 한 후, 원심 분리에 의해 세포를 퇴적시키고 RP5 중간 농도의 밀리리터 당 여섯 번째 세포에 10 번 10에서 세포를 재중단.그런 다음 제어당 100 마이크로리터의 셀을 96개의 웰 각각에 플레이트하여 100마이크로리터의 RP5 배지를 잘 함유하고 있다. 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 다음으로, 남은 PBMC를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 세포 현탁액 1밀리리터당 CFSE 작업 스톡 솔루션 1개를 튜브 측면에 추가합니다.튜브를 여러 번 신속하게 반전하여 세포를 세포 배양 인큐베이터에 5분 동안 혼합하고 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, RP5 배지의 5 밀리리터로 반응을 체포하고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 펠릿을 신선한 RP5 배지의 밀리리터 당 10번에서 6번째 PBMC로 1회 다시 중단하고 항원당 10밀리리터 튜브에 1밀리리터의 세포를 첨가하여 테스트합니다.그런 다음 96개의 웰 각각에 항원당 100마이크로리터를 첨가하여 100마이크로리터의 RP5 배지를 잘 함유하고 있으며, 이는 잘 희석된 이자항원으로 보충한다. 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 유동 세포 측정 분석을 위한 CD4+T 세포 집단을 염색하기 위해 배양의 끝에 각 웰에서 세포의 전체 부피를 개별 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 전달한다.0.1%의 태아 종아리 혈청 또는 FCS로 보충된 PBS의 1밀리리터로 각 샘플을 세척합니다. 적절한 항인간 CD4 항체에서 페탄을 재중단하여 100마이크로리터의 PBS 플러스 튜브당 FCS를 재차한다. 빛으로부터 보호되는 20분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다.인큐베이션이 끝나면, 신선한 PBS+ 튜브당 FCS 1밀리리터로 샘플을 세척하고 100마이크로리터의 신선한 PBS 플러스 FCS로 펠릿을 재보종한다. 분석 직전에 각 튜브에 프로피듐 요오드 1 마이크로리터를 추가하여 죽은 세포를 배제할 수 있습니다. 전방 및 측면 분산 부위에 따라 림프구를 게이트합니다.세포 세포를 제외하려면, 전방 분산 영역대 요오드 음성 세포를 게이트하고 비형광 세포에 대한 전압 기준선을 설정하기 위해 스테인드 드 된 세포를 사용합니다. CD4 항체 형광및 CFSE 신호에 대한 전압을 설정하여 형광 신호가 각각 1000 미만이되도록 합니다. 단일 색상 제어 CFSE 및 CD4 샘플을 사용하여 스테인드 셀로 설정된 전압을 사용하여 각 색상에 대한 양양성 형광 신호를 확인합니다.CFSE 및 프로피듐 요오드제는 일부 스펙트럼 중복이 있기 때문에 CFSE만 샘플이 프로피듐 요오드 채널에서 신호를 생성하지 않을 때까지 CFSE 형광으로부터 요오드형 형광을 빼도록 보정을 조정한다. 모든 시료를 분석한 경우, 항원으로부터 분할된 세포의 수를 5000개의 분할된 세포로 나누어 항원 없이 배양한 세포로부터 5000개의 분리되지 않은 세포에 의해 분할된 세포 수를 분할하여 세포 분열 지수를 계산한다. 거의 모든 기증자는 기증자가 Tetanus 독소를 유용한 양성 대조군 항원으로 만드는 백신 접종되었기 때문에 시험관 내 자극 후에 Tetanus 독소에 강한 T 세포 반응을 보여줍니다.그러나 자극되지 않은 PBMC에서 CD4+T 세포의 확산은 최소화됩니다. 인간 프로 인슐린 C-펩티드와 7일간의 자극 후, 프로 인슐린 C-펩타이드 특이CD4+T 세포는 타입-1 당뇨병을 가진 개인의 말초 혈액에서 검출될 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 매트릭스 단백질로 자극된 PBMC는 또한 증식을 입증한다.종합, 이러한 데이터는 분석이 짧은 합성 펩타이드뿐만 아니라 전체 길이 단백질을 사용하여 수행 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법의 FACS 구성 요소는 세포 분류 흐름 세포계를 사용하여 수행 될 수있다. 세포 선별기를 사용하여 항원 특이적 T 세포는 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 수준에서 격리될 수 있다.이 방법은 초기 개시 타입-1 당뇨병을 가진 개별에 있는 CD4T 세포 반응의 발견을 허용했습니다. 다른 방법을 활용하는 이러한 희귀 한 T 세포 인구를 분석하는 것은 다양한 기술적 인 과제를 제시한다.

quantification-proliferating-human-antigen-specific-cd4-t-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

CFSE는 covalently 형광 염료, carboxyfluorescein와 긴 세포내 분자를 표시합니다. 따라서, CFSE - 표시 셀 분할 때, 그 자손 이는 세포 분열을 평가하는 데 사용할 수있는 형광의 절반 금액을 보유하고 있습니다. 이 문서는 일반적으로 CFSE와 마우스 lymphocytes를 라벨에 사용되는 절차를 설명합니다.

림프구 확산을 모니터 Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 Succinimidyl 에스터 (CFSE)의 사용

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된...

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

이 동영상은 다양한 세포주기 단계에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분석하는 분석을 보여줍니다. 형광 표지된 생존 세포는 유세포 분석을 사용하여 선택되며, 세포 증식 관련 핵 단백질 및 핵산 염색에 대한 항체를 사용하여 서로 다른 세포 주기 단계에 있는 세포를 DNA 함량으로 식별합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포주기 분석을 위한 분석

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생체 외에서 제조하는 기술을 보여줍니다. 인간 T 세포는 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 배지와 함께 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드로 배양되어 T 세포의 활성화 및 증식을 유도합니다. 형질전환 렌티바이러스 벡터가 도입되어 형질전환 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 전이유전자를 발현할 수 있습니다. 그 결과 형질도입된 T 세포가 표면에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현합니다. T 세포는 CAR 발현 및 동결 보존을 평가하기 위해 정의된 시점에 수확됩니다.

키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

학습하세요 CFSE 염색을 이용한 증식 CD4+ T 세포 정량화 방법으로, 항원 특이적 희귀 면역 세포를 검출하고 분리하는 기술입니다. 이 프로토콜은 자가면역 질환 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4⁺ T 세포의 정량화

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