Name: 사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 중성 충전 pH 반응형 고분자 나노입자를 사용한 siRNA 전달 방법을. 이 기술은 암과 자가면역 질환 등 다양한 질병 치료를 위한 유전자 침묵 요법의 생체이용률을 높여줍니다.

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저자는 크레이그 듀발과 레 베 카 쿡이 연구를 수행 하기 위한 데이터 및 실험실 리소스에 액세스 할 수 있도록 감사 합니다. 저자는 DLS와 TEM (NSF EPS 1004083) 계기에 접근 하기를 위한 나노 규모 과학 및 공학 (VINSE)에 대 한 밴 더 빌 트 연구소에 감사 합니다. 저자 들은 대학원 연구 펠로 우 십 프로그램 (NSF # 1445197)을 지원 하기 위한 국립 과학 재단에 감사 드립니다. 저자는 재정 지원 (NIH R01 EB019409)에 대 한 국가의 건강 연구소에 감사 합니다. 저자는 국방 CDMRP (OR130302) 재정 지원을 위한 국방부 의회 감독 의료 연구 프로그램에 감사 드립니다.

1. 시-NPs의 준비 및 특성화
<ol><li>si-NP 준비<ol>
<li>3.33 Mg/ml의 구 연산 완충 액 (pH 4.0)에서 10 mM의 고분자를 녹 이세요. 중합체는 먼저 용 해를 보장 하기 위해 에탄올에 10 배 농도로 용 해 될 수 있다. 참고: 고분자는 낮은 농도에서 용 해 될 수 있지만, 3.33 mg/m l 이상의 농도에서 사용 하 여 균질 한 NP 형성을 방지할 수 있습니다.</li>
		<li>SiRNA (50 μ m)를 추가하 여 N+:P 10의 비율로 생성 한다. 파이 펫 팅으로 폴리머 및 siRNA 용액을 철저히 혼합 하 고 30 분 동안 배양 하십시오. 상기 N+:P 비는 상기 siRNA 상에 음으로 하 전 된 인산 염 기의 수에 대 한 고분자 상의 양 전 하를 띤 아민 기의 수를 나타내고, 하기의 화학식으로 계산 된다: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59549/59549eq1.jpg"> 여기서, 몰 폴은 폴리머의 몰 양 이며, RU 아민은 폴리머 당 양의 아민의 반복 단위의 수 이며, 몰 siRNA는 sirna의 몰 량 이며, bp siRNA는 siRNA 분자 당 염기 쌍의 수 이다.</li>
		<li>10mm 인산 염 완충 액 (pH 8.0)을 5 배로 추가 하 고 튜브를 피 펫 팅 하거나 반전 시켜 부드럽게 섞어 줍니다. 최종 pH가 중성 (~7.2-7.5) 임을 확인 하기 위해, pH 시험 스트립 위에 10 μ l의 si-NP 용액을 피 펫 한다. 참고: 시트르산 및 인산 염 버퍼는 밀리 포어 시그마 버퍼 레퍼런스 센터 차트에 따라 제조 된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si-NPs의이 화학적 특성 분석</li>
	<li>동적 광산 산란 (DLS)을 사용 하 여 결과의 si-NPs의 크기 및 표면 전 하를 기록 합니다. 0.45 μ m 포어 사이즈 시린 지 필터를 통해 사각 쿼 츠 또는 폴리스 티 렌 큐 벳으로 0.1의 1Ml(5-1.0 mg/ml)를 여과 하 여 DLS 샘플을 준비 합니다. 제조업체의 사양에 따라 DLS 계측기를 사용 하 여 크기 및 표면 전 하 측정을 기록 합니다.<ol>
<li>투과 전자 현미경 (TEM)을 이용한 이미징 분석을 통해 si-NPs의 크기와 형태를 확인 합니다.<ol>
<li>1 mg/ml에서 5 μ l의 si-NP 용액을 TEM 그리드에 추가 하 고 3 초 동안 60 건조 시킵니다.</li>
			<li>3% uranyl 아세테이트 용액을 5 μ l 씩 첨가 하 고 20 초 동안 건조 시킵니다. 건조 한 격자에 밤새 탈수 하 여 말립니다.</li>
			<li>사용 되는 특정 현미경에 대해 확립 된 프로토콜에 따른 이미지 그리드.</li>
		</ol>
</li>
		<li>아가 로스 겔 지체를 사용 하 여 다양 한 N+:P 비율로 siRNA의 로딩을 특성화 합니다.<ol>
<li>2% 아가 로스 겔을 생산 하기 위해 pH 8.0에서 전기 영동 학년 아가 로스 분말 2 g을 100 mL의 1x 태 (트리-아세테이트-EDTA) 버퍼에 추가 합니다. 아가 로스를 중단 하도록 저 어 주세요. 모든 아가 로스가 용 해 될 때까지 열을 전자 렌지에서 밝혀 냅니다 (1-3 분).</li>
			<li>식힌 후에 티 듐 브 로마 이드 (10mg/ml)의 5 μ l를넣고 잘 섞어 줍니다. 아가 로스를 젤 트레이에 붓고 빗을 넣어 우물을 만들어 30 분간 건조 시킵니다. 우물을 적재 하는 빗을 조심 스럽게 제거 하 고 젤 트레이를 1x 태 버퍼를 사용 하 여 최대 필 라인에 채웁니다.</li>
			<li>위의 절차에 따라 0, 1, 2, 5 및 40 N+:P 비율로 si NPs를 생성 합니다. 각각의 si-NP 제형에 대해 파라핀 막에 로딩 염료 (SDS 및 환 원제 없음)의 2 μ l 분 취 액을 넣습니다. 피 펫에 의해 파라핀 필름에 로딩 염료와 함께 si-NP 용액 10 μ l를 혼합 한다.</li>
			<li>아가 로스 젤 웰에 si-NP/로딩 염료 용액을 추가 합니다. 35 분 동안 또는 샘플이 겔 길이의 80%를 통과 할 때까지 100 V에서 전압 소스를 실행 하십시오.</li>
			<li>제조업체의 사양에 따라 UV 트랜스 조명에 siRNA 밴드를 시각화 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 시-NPs의 시험관 내 생물 활성 결정
<ol><li>모델 유전자 루시퍼 라 제의 녹 다운<ol>
<li>루시퍼 라 제 (위의 절차에 따라)를 생성 하 여 루시퍼 라 제 siRNA 및 스크램블 된 시-NPs를 대조 군으로 하 여 스크램블 된 siRNA 서 열을 사용 한다. 모두 si-NPs와 동일한 최종 N+:P 비율로, 아가 로스 겔 위상차 연구에 의해 확인 된 최적 비율로 formualte. 예시 된 siRNA 서 열은 재료의 표에포함 되어 있다.</li>
		<li>루시퍼 라 제 셀 [MDA ~ 231/루시퍼 라 제 안정 세포] 96-우물에서 2000 세포의 밀도에 있는 검은 색 벽 플레이트. 배양 기 (37, 5% CO2, 95% 습도)에서 풀 미디어 (DMEM 10% FBS)에서 밤새부착 하도록 허용 한다.</li>
		<li>Si-NPs를 웰 당 100 μ l의 최종 부피 및 100 nM의 siRNA 농도로 완전 한 혈 청 배지로 희석 한다. Si-NPs를 가진 24 시간 동안 세포를 취급 하십시오.</li>
		<li>24 시간 후, 처리를 제거 하 고 150 μ g/m l 루시페린를 포함 하는 전체 혈 청 매체로 배지를 교체 하십시오. 제조업체의 사양에 따라 플레이트 리더 또는 생체 내 광학 이미징 시스템에서 발광을 측정 하기 전에 5 분 동안 세포를 배양 하십시오.</li>
		<li>루시페린 포함 된 매체를 신선 하 고 완전 한 혈 청 매체로 바꾸고 24 시간 더 배양 하십시오. 위 단계를 반복 하 여 배지를 제거 하 고 150 μ g/m l 루시페린를 함유 하는 전체 혈 청 배지로 교체 하 고, 48 h timepoint에서 발광을 측정 하기 전에 5 분간 인큐베이션 하였다.</li>
		<li>세로 연구의 경우, 냉 광을 측정 하는 동안 무 균 상태에서 세포를 유지. 루시페린를 교체한 후에는 측정 간의 신선 하 고 완전 한 미디어로 계속 문화를 유지 하십시오. 참고: 적절 한 siRNA 농도는 다른 si-NPs 및 siRNA 분자에 따라 달라질 수 있습니다. 내 분 자체 코어 (예: PEG-DB)를 사용 하 여 중성자 충전 된 폴 리 플렉스를 사용할 경우, 100 nM는 일반적으로 세포에 의해 잘 용납 루시퍼 라 제 녹 다운 &gt; 75%를 생산 합니다. 10n+:P 비 및 100 nM에서 sirna에 대한 PEG -db의 질량 비 sirna 처리 (26 bp sirna를 가정)는 23.3, 즉 sirna의 모든 1.0 ng에 대해 peg-db의 23.3 ng를 추가 한다. 예를 들어, 96-웰 플레이트 (웰 당 100 mL 미디어 볼륨)에서 100 nM에서 잘 치료 하기 위해 siRNA의 166.5 ng에 대 한 3.33 mg/mL 중합체의 1.16 μ l를 추가 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li>
<li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li>
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저자는 잠재적인 이해 상충을 공개 하지 않습니다.

여기에 설명 된 si-NPs는 음이온 성 siRNA와 양이온 고분자를 폴 리 이온 복합체 (폴 리 플렉스)로 정전기 협회에 의해 형성 됩니다. PEG-DB 중합체의 siRNA 및 양이온 DB 블록의 정전기 적 복합체는 낮은 pH (4.0)에서 혼합 하 여 촉진 된다. PH 4.0에서 DMAEMA는 고도로 양성자 화 되어 결과적으로 DB 블록이 매우 충전 됩니다. 이것은 중합체가 미 셀을 형성 하는 것과 반대로 용액에서 unimers로 용 해 되 고 siRNA로 효율적으로 DB 복합체를 만드는 것을 보장 한다. 이어서, 용액의 pH를 중성 (pH 7.4)으로 조정 하 여 DB 블록의 ' hydrophobization ', 미 셀 형성 및 생성 된 폴 리 플렉스의 코어 내에서 복합 된 siRNA의 포획을 유발 한다. 이러한 폴 리 플렉스는 PEG가 DB/siRNA 코어 주위의 친수성, 불활성 쉘을 형성 하도록 설계 되어 전신 투여에 필요한 중성 표면 전 하를 초래 합니다. 고분자 화학 및 폴 리 플렉스 형성 과정은 <strong c...

Sirnas는 mRNA 서 열에서 단백질의 번역을 억제 하기 때문에 이론적으로는 모든 알려진 병 리 제1,2,4,5의 약물에 사용 될 수 있습니다. 그러나, 의학에서 sirna의 사용은 sirna 분자6,7의 포괄적으로 가난한 약물 동태 학적 프로 파일에 의해 제한 된다. 정 맥 주사 시, sirnas는 뉴 클레 아 제8,9에 의해 신장 및/또는 저하를 통해 급속히 제거 된다. 그것의 큰 크기 및 음 전 하 때문에, siRNA는 세포에 들어갈 수 없고 또는 내 생포 하는 통로를 이스케이프 하 여 사이토 솔 (10)에 상주 하는 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)에 접근 하 고, 13. 따라서, 광범위 한 노력은 siRNA 전달 전략 (14)의 설계 및 구현에 초점을 맞추고 있다. 이러한 노력은 주로 siRNA를 패키지 하는 지질 및 폴리머 기반 나노 입자의 개발에 초점을 맞추고, 생체 내에서의 클리어런스 및 분해 로부터 보호 하 고, 이온화 가능한 양이온 성 아민 기를 통해 세포 흡수 및 내 염색체 탈출을 개시 한다. 많은 사전 임상 성공이 보고 되 고 가장 최근에는 유전 트랜스 티 레 틴 매개 (해 트) 아 밀 로이드 증15를 치료 하기 위해 나노 입자 기반 간 siRNA 전달에 대 한 첫 번째 임상 성공은 보고 되었습니다.
기존의 약리학 (즉, 소 분자 약물)에 의해 현재 "undruggable" 되는 많은 암 유발 유전자 들이 암 치료 용 고분자 siRNA 나노 입자의 설계에 동기를 부여 하 고 있다. 그러나, 비 간장 siRNA 납품을 위해 고려 되어야 하는 디자인 매개 변수의 개별적인 세트가 있습니다. 전달 시스템은 전신 순환17,18,19내에서 응집을 야기 하는 폴 리 플렉스의 양이온 성 전 하를 차폐 한다. 종양 전달을 위해, 구체적으로, si-NP 안정성은 향상 된 투과성 및 유지 (epr) 효과를 통해 종양 내에 축적이 증가 하 고 따라서 긴 순환을 부여 하는 것이 필수적 이다20,21. 더욱이, si-NP 크기에 대 한 제어는 약 20-200 nm 직경 크기의 나노 입자만을 레버리지로 서 필수적 이며, 보다 작은 Si-NPs (~ 20 50 nm 직경) 더 큰 크기의 나노 입자에 대 한 개선 된 종양 침투를 나타낸다 미세 입자23.
이러한 추가적인 설계 제약을 해결 하기 위해 정 맥 내 투여에 따르는 siRNA의 전신 종양 전달을 위한, 중성-충전, pH 반응 시-NPs가 개발 되었다 (도 1)24. 이러한 si-NPs는 페 길 화 된, 또는 가장 최근에는, 중성 표면 전 하 및 순환에 있는 단백질 흡착 및 오 손 화에 저항을 위한 Zwitterionated25입니다. 그들은 세포내 전달을 구동 하기 위해 양이온 성 문자에 전적으로 의존 할 수 없기 때문에, 매우 효율적인 내 염색체 탈출은 강력한 유전자 침묵을 달성 하기 위한 필수적 이다. 따라서, 이러한 si-NPs의 코어는 세포 외 pH (7.4)에서 불활성 인 고 내 분 비 핵으로 구성 되어 있으 나,이는 내 리소 소 통로의 산성화 조건에서 스위치 유사 방식으로 촉발 된다 [pH 6.8 (초기 내 상 염색체) – 5.0 ( ). 마지막으로, si-NPs의 코어 내에서 양이온 성 및 소수 성 함량의 혼합물은 정전기 및 반 데르 발스 안정화 힘을 모두 제공 하 여, 단지 양이온 시스템에 비해 혈액에서의 시-NPs의 안정성을 향상 시킨다.
다양 한 기능을 비교적 단순한 설계로 통합 하는 것은 가역 적인 추가-프 래그 멘 테이 션 체인 트랜스퍼 (뗏목) 제어 중 합을 사용 하 여 복잡 한 구조와 정밀한 조성을 가진 폴리머를 생산할 수 있습니다. 중성 표면 전 하, pH 반응성 및 NP 안정성을 갖춘 dimethylamino를 생산 하기 위해 폴 리 에틸렌 글리콜을 합성 하는 데 사용 됩니다() 에틸 메타 크 릴레이 트공동부 틸 메타 크 릴레이 트)) (PEG-DB; 그림 1a). PEG-DB는 PEG 코로나 및 DB/siRNA 코어를 사용 하 여 시-NPs를 형성 하는 siRNA와 함께 정전기 적으로 복합 화 된다 (도 1b). PEG는 si-NP 코로나 상에 서 불활성의 중립-충전 된 친수성 층을 형성 한다. 상기 DB 블록은 2-dimethylamino) 에틸 메타 크 릴레이 트 (DMAEMA) 및 부 틸 메타 크 릴레이 트 (BMA)의 50:50 몰 비로 이루어진다. 양이온 DMAEMA 정전기 적으로 복합체는 음으로 충전 된 siRNA. BMA는 np 안정성을 증가 시키고 반 데르 발스 상호 작용에의 한 NP 코어 내에서의 자가 동료 이다. 함께, DMAEMA 및 BMA는 DB 폴리머 블록에 pH 의존적 지질 이중-용 해 거동을 부여 한다. 세포 외 pH에서, DB 블록은 si-NP 코어에 금속 화 되 고 지질 이중 층에 불활성 이다. 내 상 염색체 통로 내에 있는 것과 같은 산 성 조건 하에서, DB 블록 내 이온화 가능한 DMAEMA는 양성자 스폰지 효과를 용이 하 게 하 고, 내 상 염색체 완충은 삼 투 팽 윤 및 파열을 유도 한다26. 추가적으로, DB 블록 내의 소수 성 BMA 모이 어 티는 지질 이중 층으로 활발 하 게 통합 되 고, 강력한 내 혈관 분해를 초래 한다. 따라서, siRNA는 PEG-DB와 함께 복합 화 되어 세포 외 pH에서 중립으로 충전 되 고 안정성이 높게 유지 되 고 있으 나 산 성 pH에서 지질 이중 층을 교란 시켜 siRNA 페이로드의 세포 졸 전달을 보장 한다.
본 명세서는 PEG-DB 로부터 si-NPs를 생산 하는 실험 절차를 설명 한다. 이 화학적 매개 변수를 특성화 하는 방법과 si-NPs의 생물 활성을 제시 하 고 논의 합니다. 신속 하 게 si-NP 생물 활성을 평가 하기 위해, 루시퍼 라 제는 녹 다운 연구를 위한 모델 유전자로 서 사용 된다. 반딧불이의 루시퍼 라 제에는 ' 글로우 '를 담당 하는 프로 틴27가 있습니다. 이에 따라, 상기 반딧불 루시퍼 라 제 유전자로 형질 감염 된 포유류 세포는 루미 노 미터를 이용 하 여 포획 하 여 루시퍼 라 제 발현 수준을 정량화 할 수 있는 바이오 발광 ' 발광 '을 생성 한다. 여기서 우리는 루시퍼 라 제를 사용 하 여 루시퍼 라 제에 대 한 siRNA를 제공 하 고 루시퍼 라 제 발현 세포의 생물 발광에 상응 하는 감소를 정량화 하 여 스크램블 된 siRNA를 받는 세포와 비교 하 여 시-NPs의 생물 활성을 평가 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 &#956; m 기공 크기 주사기 필터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F25133</td><td>17mm 직경, PTFE 멤브레인</td></tr><tr><td>0-14 pH 테스트 스트립</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4786</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>6-7.7 pH 테스트 스트립</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3536</td><td></td></tr><tr><td>96웰 블랙 월 플레이트</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>조직 배양 처리</td></tr><tr><td>된 아가로 오스 분말</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>구연산 일 수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산나트륨 수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88294</td><td>모노 칼륨 염</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>고포도당 및 피루브산</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Millipore Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>loading dye</td><td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase siRNA</td><td>IDT</td><td>해당 없음</td><td>안티센스 스트랜드 시퀀스: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand 시퀀스: CAAUUGCACU GAUAUGAACUCCT*C* *DNA 염기</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / 루시퍼라아제(Bsd) 안정 세포</td><td>GenTarget Inc</td><td>SC059-Bsd</td><td>루시퍼라제 발현 세포 si-NP 생체 활성을 평가하기 위해 고소됨</td></tr><tr><td>단일염기성 인산나트륨 일수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Scarmbled siRNA</td><td>IDT</td><td>N/ 안티</td><td>센스 스트랜드 시퀀스: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand 시퀀스: CGUUAAUCGCGUAUAAC GCGUA*T* *DNA 염기</td></tr><tr><td>사각 폴리스티렌 큐벳</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td>4.5mL 용량</td></tr><tr><td>TEM 그리드</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>1GC50</td><td>PELCO 중앙 표시 그리드, 50 메쉬, 3.0mm OD, 구리</td></tr><tr><td>삼 나트륨 시트르산 이수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td></td></tr></tbody></table>년

사이토 솔 릭 sirna 전달을 위한 중성 충전, ph 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

표적으로 하는 분자 의학으로 siRNA의 성공은 병리학 조직 내 세포에 대 한 효율적인 사이토 졸 전달에 달려 있습니다. 이전 ' undruggable ' 간 질환 표적을 siRNA로 치료 하기 위한 임상 성공이 달성 되었다. 그러나 효율적인 종양 siRNA 전달은 긴 순환 시간, 틈새 장기의 회피 (예: 간과 신장) 및 종양 침투 및 유지 를 포함 하는 추가적인 약동 학적 설계 고려 사항을 필요로 합니다. 여기서, 우리는 특히 종양과 같은 비 간 조직에 효율적인 siRNA 전달을 위해 설계 된 중합체 나노 입자의 제제 및 시험관 내 물리 화학적/생물학적 특성화를 설명 한다. 상기 siRNA 나노 입자는 폴 리 이온 복합체를 형성 하는 siRNA와 디 블록 공중 합체 (dimethylamino) 에틸 메타 크 릴레이 트코뷰 틸 메타 크 릴레이 트) (PEG-db)의 정전기 적 복합체에 의해 제조 된다 ( 상기 siRNA는 폴 리 플렉스 코어 내에 금속 이온이 격리 되 고, PEG는 친수성, 중 화제의 코로나를 형성 한다. 더욱이, 상기 DB 블록은 내 상 염색체 통로의 소포가 산성화 함에 따라 막 용 해 되 고 (< pH 6.8), 내 상 염색체의 탈출 및 siRNA의 사이토 솔 릭 전달을 유발 한다. SiRNA의 물리 화학적 특성을 특성화 하는 방법으로는 크기, 표면 전 하, 입자 형태학 및 siRNA 하 중 등이 기재 되어 있다. SiRNA 나노 입자의 생물 활성은 신속 하 고 높은 처리량의 유전자 침묵 분석에서 모델 유전자로 서 루시퍼 라 제를 사용 하 여 측정 된다. 이러한 초기 테스트를 통과 한 설계 (예: PEG-DB 기반 폴 리 플렉스)는 종양 또는 병리학의 다른 사이트에 대 한 siRNA의 전달을 평가 하는 전 임상 동물 연구로의 번역에 적합 한 것으로 간주 됩니다.

생체 내 siRNA 전달을 위한 효과적인 si-NPs의 몇 가지 필수적인 특성은 적절 한 크기 (~ 200 nm 직경), siRNA 패키징 및 유전자 침묵 생물 활성 이다. 이것은 완전 한 목록 (토론에서 언급 된 대로)이 아니지만, 이러한 기본 특성은 제제의 추가 테스트를 고려 하기 전에 확인 되어야 합니다.
도 2 는 제제 화 시의 SI-NP 크기 및 표면 전 하의 특성화를 도시 한다. DLS 및 TEM은 si-NP 크기 (둘 다), 다 분산 지 및 형태학을 관찰 하기 위한 보완적인 방법으로 사용 됩니다. DLS 측정은 다 분산 지 1의 평균 직경이 35 nm, 단일 피크의 존재에 의해 표시 되는 유 니 모달 분포 및 상대적으로 좁은 피크 폭에 의해 지시 되는 낮은 (그...

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

현재 프로토콜은 연구원이 siRNA 로드 된 나노 입자를 생성하고 이러한 나노 입자를 적절하게 특성화하여 후속 연구 전에 동물에 대한 투여적합성을 보장하기 때문에 중요합니다. 이러한 접근법의 장점은 siRNA의 생체 이용률을 증가시키고 중하되어 전신 투여에 적합한 나노입자를 생성하는 나노입자를 생산하는 것이다. 이 기술은 siRNA 나노 입자암, 심혈관 질환 및 자가 면역 질환을 포함한 전신 투여가 필요한 무수한 질병을 치료하기 위해 적용될 수 있기 때문에 영향을 미칩니다.시작하려면 밀리리터당 33.3 밀리그램의 농도로 에탄올에 폴리머를 녹이고 용해를 보장하기 위해 저어줍니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 폴리머 용액을 10 밀리머 구연산 버퍼로 이송하여 밀리리터당 3.33 밀리그램의 농도에 도달합니다. 50 마이크로몰라의 농도를 달성하기 위해 작은 간섭 RNA를 포함하는 튜브에 증류수를 추가합니다.10의 인산염 비율을 달성하기 위해 위아래로 파이프팅하여 폴리머 및 작은 간섭 RNA 용액을 튜브에 철저히 혼합한다. 튜브를 주변 온도에서 30분 동안 배치합니다. 그런 다음 pH 8에서 1밀리미터 인산염 버퍼1밀리리터를 튜브에 추가하여 밀리리터당 0.28 밀리그램의 농도를 달성하고 튜브를 피펫팅하거나 반전하여 부드럽게 섞습니다.최종 pH가 중성임을 확인하기 위해, 약 7.2 ~ 7.5, pH 테스트 스트립에 작은 간섭 RNA 나노 입자 용액의 파이펫 10 마이크로리터. 먼저, 밀리리터당 0.28 밀리그램의 농도로 밀리리터당 0.28밀리리터를 정사각형 석영 또는 폴리스티렌 큐벳으로 여과하여 다이나믹 라이트 산란 시료를 준비한다. 그런 다음 제조업체의 사양에 따라 동적 광 산란 장비를 사용하여 크기와 표면 충전 측정을 기록합니다.전송 전자 현미경을 사용하여 작은 간섭 RNA 나노 입자의 크기 및 형태를 확인하기 위해 먼저 각 TEM 그리드에 밀리리터 당 0.28 밀리그램에서 여과 된 작은 간섭 RNA 나노 입자 용액의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 그리드를 주변 온도에 60초 동안 배치합니다. 3초 동안 필터 용지로 블롯 드라이.다음으로 각 그리드에 3%의 우라일 아세테이트 용액 5개를 추가하고 20초 동안 배양합니다. 블롯은 3초 동안 건조합니다. 그런 다음 전염 전자 현미경 검사법에서 이미징하기 전에 밤새 건조기에 그리드를 놓습니다.아가로즈 젤 지체를 수행하기 위해 먼저 2 그램의 전기 포망등급 아가로즈 파우더를 100 밀리리터에 1X 트리아세테이트-EDTA 버퍼를 비커에 넣어 2%의 아가로즈 젤을 생산합니다. 아가로즈를 중단하기 위해 저어주세요. 모든 아가로즈가 용해 될 때까지 1 ~ 3 분 동안 가열전자 레인지에 발견 된 비커를 놓습니다.냉각되면 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 에티듐 브로마이드 5마이크로리터를 비커에 넣고 잘 섞어보세요. 그런 다음 아가로즈를 젤 트레이에 붓고 빗을 놓아 우물을 생산합니다. 젤을 30분 동안 건조시키십시오.조심스럽게 빗을 제거하여 적재 우물을 남기고 1X Tris-acetate-EDTA 버퍼를 젤 트레이에 부어 최대 채우기 라인을 채웁니다. 그런 다음 SDS없이 염색염을 적재하거나 각 작은 간섭 RNA 나노 입자 제형에 대한 파라핀 필름에 대한 두 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 다른 질소에서 인산염 비에 배치합니다. 파이펫은 파라핀 필름에 염색을 적재하는 작은 간섭 RNA 나노 입자 용액의 10 마이크로리터를 혼합합니다.아가로즈 젤 웰에 혼합물을 넣습니다. 전기 전광 시스템을 전원 공급 장치에 연결하고 전압 소스를 100볼트에서 35분 동안 또는 샘플이 젤 길이의 80%를 통과할 때까지 전력 공급 장치에 연결합니다. 트레이에서 UV 트랜실루미나이터로 젤을 옮기고 제조업체의 사양에 따라 UV 트랜실루미나이터에 있는 작은 간섭 RNA 밴드를 시각화한다.겔 의 바닥에 작은 간섭 RNA 대역의 실종에 기초하여 인산염 비율에 최적의 질소를 결정합니다. 모델 유전자 루시파아제를 노크하기 위해, 10%의 밀도로 DMEM을 가진 96웰 블랙 월판에서 첫 번째 종자 루시파아제를 발현하는 세포는 웰당 2, 000 세포의 밀도로. 세포를 부착할 수 있도록 밤새 인큐베이터에 접시를 넣습니다.아침에 는 미디어를 제거하고 100 나노 몰라의 최종 작은 간섭 RNA 농도에 대한 전체 혈청 매체로 희석 작은 간섭 RNA 나노 입자의 우물 당 10 마이크로 리터를 추가합니다. 작은 간섭 RNA 나노 입자로 세포를 취급하기 위해 24 시간 동안 인큐베이터에 우물을 반환합니다. 다음 날, 밀리리터 D-루시페린 당 150 마이크로그램을 포함하는 전체 혈청 매체로 미디어를 대체하십시오.플레이트 판독기에서 발광을 측정하기 전에 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 D-luciferin이 없는 신선한 풀 세럼 미디어로 미디어 다과를 두 번 반복한 다음 24시간 동안 인큐베이션을 반복합니다. 미디어를 밀리리터 D-루시페린당 150밀리그램이 함유된 전체 혈청 매체로 교체하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.48시간 시점에서 발광을 측정합니다. 세로 연구의 경우, 생체 안전 캐비닛 외부의 경우 우물 판 위에 뚜껑을 두어 멸균 조건하에서 세포를 유지하고 루시페린 함유 미디어를 신선한 전체 매체로 대체한 후 인큐베이션을 계속하십시오. 동적 광 산란 측정은 작은 간섭 RNA 나노 입자 하나 35 나노 미터의 평균 직경을 가지고 있음을 보여줍니다.피크 폭이 좁은 단일 피크의 존재는 단모달 분포와 낮은 다각형성을 나타냅니다. TEM 측정은 동적 광 산란으로부터의 크기 측정을 확인하여 작은 간섭 RNA 나노입자의 균일한 집단의 존재를 시사하고 작은 간섭 RNA 나노입자의 구형 형태를 드러냈다. 준비 단계에서 중합체의 너무 높은 농도는 200 나노미터 이상의 바람직하지 않은 직경, 멀티 모달 및 다분산 인구, 그리고 뚜렷한 입자 형태를 형성하지 않는 용액의 골재에서 작은 간섭 RNA 나노 입자 2를 초래했다.작은 간섭 RNA 나노 입자 하나 와 두 개의 디스플레이 중립 표면 전하 는 거의 제로에 의해 표시 제타 잠재적 인 값을 의미한다. 아가로즈 겔 지체 분석은 중합체에 작은 간섭 RNA의 복합화를 나타내는 젤 바닥에 작은 간섭 RNA 밴드의 실종을 나타낸다. 중합체 복합소형 간섭 RNA는 겔을 통해 마이그레이션할 수 없으며 따라서 하중 우물 근처의 겔 의 상부에 시각화된다.인산염 에 대한 질소가 증가함에 따라 겔 바닥에 있는 작은 간섭 RNA 대역의 강도감소로 나타난 바와 같이 작은 간섭 RNA 복합체가 증가한다. 생리활성 루시파아제 작은 간섭 RNA 나노입자 1은 스크램블 컨트롤과 비교했을 때 루시파라기 활성을 현저히 감소시켰다. 대조적으로, 루시파라제작은 간섭 RNA 나노입자 2는 생리활성으로 간주되지 않는다.원하는 물리화학적 특성을 가진 일관된 siRNA 나노 입자를 생성하려면 적절한 농도를 가진 폴리머 솔루션을 사용하고 프로토콜의 각 단계에서 완충액의 pH를 검증해야 합니다. 우리의 연구에서 이러한 방법을 사용하여 우리는 이전에 마약이 없는 암을 일으키는 유전자를 위한 siRNA 나노 입자 기지를 둔 치료를 생성하고 유방암의 전 임상 모형에 있는 이 치료의 효험을 시험할 수 있었습니다.

preparation-neutrally-charged-ph-responsive-polymeric-nanoparticles

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

배달은 작은 간섭 RNA (siRNA의)의 치료 구현을위한 주요 과제로 남아. 이 프로토콜은 아르기닌 및 폴리에틸렌 이민 다공성 실리콘 그래프트 미립자로 구성된 다기능 및 생체 적합성의 siRNA 전달 플랫폼의 사용을 포함한다.

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다.  siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

우리는 광 반응성 블록 공중 합체를 사용하는 새로운 방법을 제시한다.이 방법은 검출 불가능한 오프 - 타겟 효과없이 유전자 침묵을보다 효율적으로 공간적으로 제어 할 수있다. 또한 유전자 발현의 변화는 간단한 siRNA 방출 분석 및 간단한 운동 모델링을 사용하여 예측할 수 있습니다.

광 반응성 고분자 나노 캐리어로부터의 siRNA 방출의 시공간 조절을 통한 유전자 침묵 예측

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.

합성과 기능화, Oligonucleotide 배달에 대 한 Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 특성

당사는 폴리전해질 복합 미셀, 폴리전해질 및 친수성 전하 충전되지 않은 블록 공중합체에 의해 형성된 코어 쉘 나노입자를 설계, 조립 및 특성화하기 위한 프로토콜 및 대표 데이터를 제공합니다.

폴리전해질 복합 미셀의 조립 및 특성화

지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

배우세요 중성 충전 pH 반응형 고분자 나노입자를 사용한 siRNA 전달 방법을. 이 기술은 암과 자가면역 질환 등 다양한 질병 치료를 위한 유전자 침묵 요법의 생체이용률을 높여줍니다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

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