Name: 거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 배우세요 거대한 소포 내부에서 단세포 수준으로 세균을 배양하는 방법을. 드롭릿 전이법으로 소포를 제조하고 지지막에 고정하여 세균 성장을 직접 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 미생물학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 일본 의 문부과학성(MEXT)의 우수 청년 연구자(리더, 제16812285호)의 우수 청년 연구자 주도 이니셔티브(16812285호)와 젊은 과학자 연구 보조금(18K18157, 16K21034)의 지원을 받았습니다. 일본과학진흥회(JSPS)에서 M.M.까지, MEXT에서 K.K.까지 의학지원(No. 17H06417, 17H06413).

1. 액적 전달 방법에 의한 세균세포를 함유하는 GV의 제조
<ol><li>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC, 10 mMM, 1 mL) 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[바이오티닐(폴리에틸레네글리콜)-2000] (비오틴-PEG-DSPE, 0.1 mM, 1 mL) 클로로폼/ 메탄올 용액 (2/1, v / v)을 하고 재고를 -20 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>지질 함유 오일 용액의 제조
	<ol>
<li>POPC 용액의 20 μL과 비오틴-PEG-DSPE 용액의 4 μL을 유리 튜브에 붓습니다(도 1b(i)).</li>
		<li>유기 용매를 기류에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조제에 필름을 배치한다(도 1b(ii)). 참고: 연기 후드에서 유기 용매를 증발할 필요가 있습니다.</li>
		<li>유리 병 (그림1b (iii))에 미네랄 오일 200 μL (0.84 g / mL, 재료표)를 추가합니다.</li>
		<li>유리 병의 개구부를 필름으로 감싸고 초음파 욕조 (120 W)에서 초음파 처리하여 적어도 1 시간 (그림1b (iii)).) 동안 초음파 처리하십시오. POPC와 비오틴-PEG-DSPE의 최종 농도는 각각 1mMM 및 0.002 mM이다.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 세포의 사전 배양
	<ol>
<li>대장균을 1x LB 배지(효모 추출물 1g, 바토 트립톤 2g, 염화나트륨 2g)를 LB 플레이트에서 200 mL에 접종하고 37°C에서 12-14시간(하룻밤)에 배양합니다.</li>
		<li>배양 후, 배양 액의 20 μL을 수집하고 신선한 1x LB 배지의 1.98 mL로 전달하고, 세포를 2시간 동안 다시 배양한다.</li>
		<li>사전 배양 용액의 600 nm(OD600)값에서 광학 밀도를 확인한다(단계 1.3.2에서 제조). OD600 = 1.0-1.5의 배양 전 솔루션을 사용해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>GV의 외부 및 내부 수성 용액의 제조
	<ol>
<li>1x LB 배지에 포도당을 용해하여 GV의 외부 수성 용액을 준비합니다.</li>
		<li>스톡 포도당 용액을 1x LB 배지에서200 mM으로 희석합니다(표 1).</li>
		<li>자당을 1lb 배지에 용해하여 GV의 내부 수성 용액을 준비합니다.</li>
		<li>배양 전 용액(OD600 = 1.0-1.5), 자당 용액(500 mM), 및 1x LB 배지(표 1)를 혼합한다. 배양 용액의 최종 OD600 값은 0.01-0.015이어야 하며 최종 자당 농도는 200 mM이어야 합니다. 참고: 삼투압을 피하십시오. 내부 용액과 외부 수성 용액 사이의 농도를 균형 잡을 필요가 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 세포를 포함하는 물 인 오일 (W / O) 방울의 준비
	<ol>
<li>지질(POPC 및 비오틴-PEG-DSPE를 함유한 미네랄 오일)을 함유하는 오일 용액의 50 μL에 GV의 내부 수성 용액 2 μL을 0.6 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브(그림 1b(iv))에 첨가한다.</li>
		<li>튜브를 손으로 탭하여 플라스틱 튜브의 두 성분을 유화합니다(도 1b(v))).</li>
	</ol></li>
	<li>세균 세포를 포함하는 GV의 대형
	<ol>
<li>1.5mL 뚜껑이 달린 플라스틱 튜브(그림 1b(vi))에 GV의 외부 수성 용액 50 μL을 추가하고 외부 수성 표면에 지질(POPC 및 비오틴-PEG-DSPE가 있는 미네랄 오일)을 함유하는 오일 용액의 150 μL을 부드럽게 층화합니다. (그림 1b(vii)))) 이 샘플을 실온(RT, 25°C)에서 10-15분 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 오일 및 수성 용액의 계면에 W/O 액적 용액(단계 1.5.2에서 제조)의 50 μL을 추가합니다(도 1b(viii)).</li>
		<li>데스크탑 원심분리기에서 RT에서 1,600 x g에서 10분 동안 1.5 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브(단계 1.6.2)를 원심분리기(그림 1b(ix)). 원심분리 후, 피펫을 이용하여 1.5 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브로부터 오일(상부 층)을 흡인하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 수집한다(도 1b(x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. GV 관찰 시스템 준비 (세균 세포 배양 시스템)
<ol><li>
구성에 대한 작은 소포 (SV)의 준비 ng a 지원되는 이중층 멤브레인
	<ol>
<li>POPC 용액의 20 μL및 4 μL의 비오틴-PEG-DSPE 용액을 유리 튜브에 붓습니다(단계 1.1에서 GV 제제에 사용되는 것과 동일한 지질 조성물을 사용함).</li>
		<li>유기 용매를 공기 흐름에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 이 샘플을 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조기에 놓습니다.</li>
		<li>유리 바이알에 1x LB 배지(GV의 외부 수성 용액)에 200 μL의 200 μL을 추가합니다.</li>
		<li>유리 병의 개구부를 필름으로 감싸고 초음파 욕조 (120W)에서 적어도 1 시간 동안 초음파 처리하십시오.</li>
		<li>100 nm 크기의 미니 압출기 및 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 압출 방법(21)에 의해 SV를 제조한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수제 챔버의 준비
	<ol>
<li>양면 씰(10mm x 10mm x 1mm)에 중공 펀치가 있는 7mm 구멍을 뚫습니다.</li>
		<li>커버 글래스(30mm x 40mm, 두께 0.25~0.35mm)에 구멍이 있는 양면 씰을 붙여넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
챔버의 구멍에 커버 유리에 지원 되는 이중 층 막의 제조
	<ol>
<li>챔버의 구멍에 SV 용액의 30 μL을 추가하고 (섹션 2.2에서 제조) 30 분 동안 RT에서 배양.</li>
		<li>파이펫팅을 통해 200 mMM 의 포도당 (GV의 외부 수성 용액)을 함유 한 1x LB 배지의 20 μL로 구멍을 두 번 부드럽게 씻으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
에 GV의 고정 챔버 구멍의 커버 유리에 지원 되는 이중 층 멤브레인
	<ol>
<li>10 μL의 뉴트라비딘을 GV(1 mg/mL)의 외부 수성 용액으로 구멍에 넣고 RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>파이펫팅을 통해 200 mMM 의 포도당 (GV의 외부 수성 용액)을 함유 한 1x LB 배지의 20 μL로 구멍을 두 번 부드럽게 씻으십시오.</li>
		<li>챔버의 구멍에 GV (단계 1.6.3에서 제조)를 포함하는 모든 용액을 추가하고 커버 유리 (18mm x 18mm, 두께0.13-0.17mm)로 밀봉 (그림 2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GV 내부의 세균 세포 성장의 현미경 관찰
	<ol>
<li>40x/0.6 수치 조리개(NA) 대물 렌즈가 장착된 역현미경으로 미세한 가열 스테이지 시스템을 긴 작동 거리(그림2b)로 설정합니다.</li>
		<li>챔버를 미세 한 가열 단계 시스템에놓습니다 (그림 2b). 37°C에서 6시간 동안 정적인 상태에서 챔버 내의 세균 세포를 함유하는 GV를 배양한다.</li>
		<li>과학적인 보완 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라를 사용하여 30분마다 GV 내부에서 세균 세포 성장의 현미경 이미지를 캡처하고 기록합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
<li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li>
<li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+From+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li>
<li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesizing+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells%2C+proteins%2C+and+microbeads+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li>
<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li>
<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li>
<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li>
<li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
<li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564(2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기서, 우리는 GV 내부의 단세포 수준에서 세균 세포를 배양하는 방법을 기술한다. 이 간단한 방법은 액적 전달 방법을 사용하여 단일 세포 수준에서 세균 세포를 포함하는 GV를 형성하는 것을 포함한다. 세균 세포를 함유하는 GV를 얻기 위한 다른 접근법과 비교하여, 이 방법은 두 가지 장점이 있다: (i) 개발하기 쉽고, (ii) 샘플 용액의 작은 부피(2 μL)가 GV를 제조하는 데 필요하다. 세균세포를 함유하는 GV를 제조하기 위한 액적전달방법(20)은 고전적인 수화방법(22)과 미세유체학방법(17)보다 간단하다. 예를 들어, 고전적인 수화방법(22)은 GV를 제조하기 위한 간단하고 쉬운 방법이지만, GV내의 물질의 캡슐화 효율은 매우 낮고 적어도 수백 마이크로리터의 샘플이 요구된다. 최근 개발된 셀룰로오스 종이-아베트 수화(23)와 겔 보조 수화<sup...

단일 세포 수준에서 세균 세포의 배양은 점점 더 주목을 받고 있다. 밀폐된 공간 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하면 자형형 가변성1,2,3,4,세포 동작5, 6개 , 7명 , 8개 , 9,항생내성10,11. 배양 기술의 최근 발전으로 인해, 단일 박테리아의 배양은 잘 칩4,7,8,젤 방울12,13과 같은 제한된 공간 내에서 달성 될 수있다 및 물 -에 - 오일 (W/ O) 물방울 5,11. 단일 세균 세포의 이해 또는 활용을 촉진하기 위해 재배 기술의 추가 기술 개발이 필요합니다.
생물학적 세포막을 모방하는 소포는 양서류 분자로 구성된 구형 구획이며 다양한 물질을 보유할 수 있습니다. 소포는 크기에 따라 분류되며 소형 소포(SV, 직경 및 100nm), 대형 소포(LAV, lt;1 μm) 및 거대 소포(GV, >1 μm)를 포함합니다. SV 또는 ROV는 생물학적 세포막(14)에 대한 그들의친화성 때문에 약물 담체로서 일반적으로 사용된다. GV는 또한프로토셀(15) 또는 인공세포(16)의시공을 위한 반응기 시스템으로 사용되어 왔다. 생물학적 세포를 GV내로 캡슐화한 것은 17, 18, 이에 따라 반응기 시스템과 결합될 때 세포 배양 시스템으로서의 잠재력을 보여준다고17,18.
여기서, 실험 적인 절차의 비디오와 더불어, 우리는 GV가 새로운 세포 배양 용기로 이용될 수 있는 방법19를기술합니다. 박테리아를 함유하는 GV는 액적 전달 방법(20)에 의해 제조된 후 커버 유리 에 지지된 막에 고정시켰다. 우리는 실시간으로 GV 내부의 단일 세포 수준에서 세균 성장을 관찰하기 위해이 시스템을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>박토트립톤</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리(18 &times; 18mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>C018181</td><td>두께 0.13&ndash; 0.17 mm</td></tr><tr><td>커버 유리 (30 &times; 40 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>맞춤 주문</td><td>두께 0.25&ndash; 0.35mm</td></tr><tr><td>데스크탑 원심분리기</td><td>하이테크</td><td>ATT101</td><td>스윙 로터 타입</td></tr><tr><td>양면 씰 (10 > 10 > 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>AS</td><td>ONE 6-306-01</td><td>더럼 발효관</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>미세한 가열 스테이지 시스템</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&times;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>폴리 카보네이트 멤브레인</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>기공 크기 100 nm</td></tr><tr><td>sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 플러스</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>초음파 욕조</td><td>AS</td> ONE <td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL 뚜껑 플라스틱 튜브</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 뚜껑 플라스틱 튜브</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-디스테아로일-sn글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000]</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>880129P</td><td>비오틴-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 단세포 수준에서 세균성 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 세균 세포 배양은 자연 환경에서 세균 세포의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 기술적인 진보 때문에, 다양한 세균성 세포 기능은 밀폐된 공간 안쪽에 단세포 수준에서 드러나질 수 있습니다. GV는 양과성 지질 분자로 구성된 구형 마이크로 크기의 구획이며 세포를 포함한 다양한 물질을 보유 할 수 있습니다. 본 연구에서, 단일 세균 세포를 액적 전달 방법에 의해 10-30 μm GV로 캡슐화하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 유리 기판 상에서 지지막 상에 고정시켰다. 우리의 방법은 GV 내부의 단일 박테리아의 실시간 성장을 관찰하는 데 유용합니다. 우리는 대장균 (대장균) 세포를GV 내부의 모델로 배양했지만,이 방법은 다른 세포 유형에 적응 할 수 있습니다. 우리의 방법은 미생물학, 생물학, 생명 공학 및 합성 생물학의 과학 및 산업 분야에서 사용될 수 있습니다.

액적 전달 방법을 사용하여 단일 세균 세포를 함유하는 GV를생성하는 간단한 방법을 제시한다(도 1). 도 1a는 박테리아를 함유하는 GV의 강수량의 개략적 이미지를 나타낸다. 박테리아를 포함하는 W/O 방울은 GV를 형성하기 위하여 원심분리에 의해 기름 물 (지질 단층) 계면에 걸쳐 전달됩니다. 자당 (내부 수성 용액)과 포도당 (외부 수성 용액)의 밀도 차이는 또한 W / O 방울의 오일 - 물 인터페이스의 교차를 돕습니다. 이러한 용액 간의 농도에 약간의 차이가 있어 GV의 변형및 붕괴를 유발할 수 있기 때문에 내부 및 외부 수성 용액의 삼투압을 모니터링할 필요가 있습니다. 액적 전달 방법에 의해 세균 세포를 포함하는 GV를 제조하기 위한 플로우 차트는 도 1b에나타내고 있다. 이 절차에 따라, 단일 세균 세...

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

이 프로토콜은 거대 소포 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하기위한 수단을 제공합니다. 거대한 소포를 개발하는 것은 쉽고, 소포를 준비하기 위해서는 매우 적은 양의 샘플 솔루션만 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 학위 후보인 유리 오타(유리 오타)가 될 것입니다.먼저 갓 준비된 POPC 용액 20마이크로리터와 갓 준비된 비오틴-PEG-DSPE 용액 4마이크로리터를 유리 바이알에 추가합니다. 지질 필름이 형성될 때까지 공기 흐름에 의해 유기 용매를 증발시다. 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1 시간 동안 건조기에 필름을 놓습니다.그런 다음 바이알에 200 마이크로리터의 미네랄 오일을 추가합니다. 유리병의 오프닝을 플라스틱 파라핀 필름으로 덮고, 120와트로의 초음파 욕조에서 유리병 함량을 1시간 이상 초음파 처리합니다. 작은 소포 준비를 위해, 방금 입증 된 것처럼 지질 필름을 만들고 LB 배지에 200 밀리의 포도당 200 마이크로 리터를 필름에 추가하십시오.그런 다음 적어도 한 시간 동안 120 와트로 필름을 초음파 처리한 다음 미니 압출기와 100 나노 미터 기공 크기의 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 생성된 거대한 소포를 작은 소포로 압출합니다. 세균성 세포 사전 배양을 위해, LB 플레이트에서 37°C에서 하룻밤 배양을 위해 LB 배지의 밀리리터로 대장균을 접종한다. 다음 날 아침, 문화권 상수 20마이크로리터를 신선한 LB 배지 1.98밀리리터로 2시간 더 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 분광계에서 배양 전 용액의 600 나노미터 또는 OD 600 값의 광학 밀도를 확인한다. OD 600의 1~1.5의 사전 배양 솔루션을 사용해야 합니다. 그런 다음 표 에 따라 갓 준비 된 자당 용액과 신선한 LB 배지와 사전 배양 용액을 혼합합니다.거대한 소포 형성을 위해, 1.5 밀리리터 뚜껑 플라스틱 튜브에 거대한 소포의 갓 준비 된 외부 수성 용액의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 지질 함유 오일 용액 150마이크로리터를 거대한 소포의 바깥 수성 용액 위에 부드럽게 레이어링합니다. 오일 및 수성 용액의 인터페이스가 평평한지 확인하기 위해 검사하기 전에 실온에서 10~15분 동안 생성된 솔루션을 배양합니다.물방울 형성을 포함하는 물과 오일 세균 세포의 경우, 0.6 밀리리터 뚜껑 플라스틱 튜브에 초음파 지질 함유 오일 용액의 50 마이크로 리터에 거대한 소포의 갓 준비 된 내부 수성 용액의 두 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 탭하여 두 구성 요소를 유화합니다. 다음으로, 파이펫을 사용하여 오일 및 수성 용액의 인터페이스에 50 마이크로리터의 물과 오일 액슬을 추가하고 원심분리에 의해 세균세포 함유 거대 소포를 퇴적시한다.그런 다음 상단 오일 층을 흡인하고 거대한 소포를 수집합니다. 수제 챔버를 준비하려면 7mm 구멍을 10-10에서 1밀리미터 양면 씰에 중공 펀치로 뚫은 다음 양면 씰을 30~40mm 커버 글래스에 붙여 넣습니다. 지원되는 이중 층 멤브레인을 준비하려면 소형 소포 용액 30 마이크로리터를 수제 챔버 구멍에 추가합니다.실온에서 소포를 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 200 밀리밀러 포도당으로 보충된 LB 배지 20 마이크로리터로 홀을 두 번 부드럽게 씻습니다. 후원자 이중 층 멤브레인에 거대한 소포를 고정하려면 실온에서 15 분 동안 구멍에 외부 수성 거대 소포 용액에 10 마이크로 리터의 중성구를 소개합니다.인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 20 밀리 밀러 포도당으로 보충 LB 매체의 20 마이크로 리터와 구멍을 두 번 세척하고, 챔버의 구멍에 거대한 소포 용액의 전체 볼륨을 추가합니다. 그런 다음 18 18mm 커버 유리로 구멍을 밀봉합니다. 거대한 소포 내의 세균 성장을 모니터링하려면 반전 된 현미경으로 40X 목표를 선택하고 현미경 가열 단계 시스템에 챔버를 배치하십시오.그런 다음 37°C에서 6시간 동안 정전기 조건하에서 챔버내세균세포 함유 거대 소포를 배양하고, 30분마다 세균세포 성장의 이미지를 캡처하고 기록하며, 과학적 보완금속 산화물 반도체 카메라로 배양한다. 세균 세포를 포함하는 거대한 소포는 전형적으로 10에서 30 마이크로미터사이크기범위입니다. 거대한 소포의 두 크기에 대 한, 대장균 세포 는 신장 및 분열 과정을 겪고, 일부 대장균 세포는 6 시간 관찰 기간 동안 세포의 매우 큰 수로 성장.단일 세포 수준을 포함하는 거대 소포의 상대적 주파수는 얻어진 거대 소포의 약 10%이며, 단일 세포 수준에서 캡슐화된 거대한 소포는 세균 세포를 포함하는 거대 소포의 약 50%이다. 오일-워터 인터페이스의 안정성은 세균 세포를 포함하는 거대한 소포를 얻는 데 중요합니다. 거대한 소포 보정 전에 조심스럽게 오일을 흡인주의하십시오.이 비디오를 시청 한 후, 당신은 개별 거 대 한 소포 내에서 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양 하는 방법의 좋은 이해 해야. 우리의 세균 배양 방법은 그들의 신진 대사 제품을 얻거나 분석하기 위하여 알려지지 않은 환경 박테리아를 배양하기 위한 미생물학에 있는 새로운 공구입니다.

bacterial-cell-culture-at-the-single-cell-level-inside-giant-vesicles

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Morita, M., et al. 거대 소포 내부의 단일 세포 수준에서 박테리아 세포 배양. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 지지된 지질 이중층에 고정된 거대한 소포 내부에 캡슐화된 개별 박테리아 세포를 배양하고 관찰하는 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 제한된 생리학적으로 관련된 미세 환경에서 단일 세포 성장 역학의 안정적이고 장기적인 이미징을 가능하게 합니다.

거대 소포 내 박테리아의 단일 세포 배양

출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

고도로 채워진 마이크로미터 크기의 구성 요소를 포함하는 거대한 소포는 유용한 세포 모델입니다. 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법은 캡슐화된 물질로 거대한 소포를 준비하기 위한 간단하고 강력한 도구입니다.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

여기서, 우리는 감염된 아메바의 분리를 위한 단일 세포 마이크로 흡인 방법을 기술한다. 파우스토바이러스와 알려지지 않은 거대 바이러스에 감염된 Vermamoeba vermiformis의 바이러스 하위 집단을 분리하기 위해, 우리는 아래에 자세히 설명된 프로토콜을 개발하고 두 개의 저풍부 신규 거대 바이러스를 분리하는 능력을 입증했습니다.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

이 프로토콜은 모델 막 단백질을 지질 이중층으로 합성하고 통합하는 연구를 위해 거대 단층 소포(GUV) 내에 CFE(cell-free expression) 시스템을 캡슐화하는 데 사용되는 역에멀젼 방법을 설명합니다.

Cell-Free Expression System의 캡슐화에 의한 박테리아 글루타메이트 수용체 채널의 재구성

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

배우세요 거대한 소포 내부에서 단세포 수준으로 세균을 배양하는 방법을. 드롭릿 전이법으로 소포를 제조하고 지지막에 고정하여 세균 성장을 직접 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 미생물학 연구에 활용됩니다.

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

더 많은 동영상 탐색