Name: 자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 자유 부동 면역 형광 분석법을 이용하여 피부 생검에서 알파 시누클레인 응집체를 검출하는 방법을. 이 기술은 파킨슨병 조기 진단을 위한 바이오마커 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 이 연구의 재정적지원을 위해 파킨슨 슈바이츠와 ABREOC(엔테 오스페레아에로 칸토날레의 과학 연구 자문위원회)에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 주 윤리 위원회의 승인을 받았으며 등록된 모든 과목은 연구에 대한 서면 동의를 받았습니다.
1. 피부 생검 컬렉션
<ol><li>자격을 갖춘 의사가 적절한 임상 환경에서 피부 생검을 수행하게하십시오.</li>
	<li>피부 생검을 수행하고 알코올 면봉으로 청소 할 영역을 선택합니다.</li>
	<li>리도카인 1 cc2 %로 마취 제를 준비하십시오.</li>
	<li>바늘이 부위와 평행하게 되면 국소 마취를 피하주사하십시오.</li>
	<li>마취의 효과를 확인 한 후, 3mm 일회용 펀치를 가지고 피하 지방에 도달 할 때까지, 표피와 진피를 통해 아래로 회전 회전 회전 회전 과 섬세한 하향 압력을 적용합니다.</li>
	<li>펀치를 철회하십시오.</li>
	<li>일회용 집게를 사용하여 피부 플러그를 부드럽게 당깁니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 지방 조직의 수준에서 시편의 기저를 잘라냅니다.</li>
	<li>시편을 10 mL의 주기-리신-파라포름알데히드(PLP) 고정 용액을 함유하는 튜브에 놓습니다.</li>
	<li>부위를 소독하고 접착제 붕으로 덮습니다.</li>
</ol>2. 조직 고정 및 저장
<ol><li>새로운 PLP 고정 솔루션을 만듭니다(표 1참조).</li>
	<li>피부 생검의 수집 직후, PLP 고정 용액 10 mL을 포함하는 튜브에 담그고 4 °C에서 하룻밤 (O / N)을 배양하십시오.</li>
	<li>다음 날, 연기 후드 에서, PLP 고정제를 부드럽게 제거하고 동일한 튜브에서, 생검을 5 분 동안 3 회 5 mL0.1M 소렌슨 용액 (표 1).</li>
	<li>Sorensen의 용액을 버리고 4 °C에서 5 mL의 저온 보호 용액 O / N으로 생검을 배양하십시오.</li>
	<li>생검을 4°C에서 보관하여 저온종으로 절단하면 1주일 이내에 수행되는 경우; 절단이 3 개월 이내에 수행되는 경우 -20 °C에서 생검을 저장; 생검을 cryomold (단계 3.2-3.4)에 포함하고 더 긴 기간 동안 보존하기 위하여 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>3. 극저온으로 티슈 컷
<ol><li>저온 을 -20 °C로 설정합니다.</li>
	<li>크라이오폴드를 타고 저온 포함 매체로 채우십시오. 거품을 만들지 마십시오.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 생검을 저온 삽입 배지에 세로 축(표피-진피)을 사용하여 저온 졸음의 바닥에 평행하게 담급니다.</li>
	<li>스냅은 액체 질소로 샘플을 동결하여 올바른 방향으로 생검을 포함하는 저온 포함 배지의 고체 큐브를 얻습니다.</li>
	<li>샘플을 저온 극저온에 넣고 생검이 순응할 때까지 30 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>저온 극저온에 샘플을 수정하고 50 μm 섹션을 잘라.</li>
	<li>약간의 브러쉬의 도움으로, 각 우물에 부동액 200 μL을 포함하는 96 웰 플레이트에 저온 절편을 옮니다. 우물 당 하나의 섹션.</li>
	<li>-20 °C에서 보관하십시오. 참고: 전체 생검을 분석하지 않으면 부분적으로만 잘라냅니다. 이 경우, 단면도는 -20°C에서 저장되어야 하며, 생검의 나머지 부분은 -80°C에서 장기간 보존해야 한다.</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>100 μL의 세척 용액으로 96 개의 웰 플레이트를 채웁니다.</li>
	<li>저장 플레이트에서 분석할 섹션을 세척 용액을 포함하는 새로운 섹션으로 옮니다. 각 우물 당 1 섹션 (해부학 사이트 당 4 섹션, 환자 당 : 일반적으로 환자 당 총 12 섹션).</li>
	<li>실온(RT)에서 10분 동안 세척 용액에 섹션을 둡니다. 동일한 용액을 함유 한 다른 우물로 섹션을 옮기고 세척을 반복하십시오.</li>
	<li>100 μL의 블로킹 용액을 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮기고 RT에서 최소 90 분 동안 최대 4 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>일차 항체 항체를 PGP9.5(토끼 폴리클로날, 1:1000) 및 항-5G4(마우스 모노클로날, 1:400)를 작동 용액에서 희석한다.</li>
	<li>1차 항체의 작동 용액의 100 μL을 포함하는 새로운 우물로 섹션을 전송하고 RT에서 O/N을 배양합니다.</li>
	<li>4.3 단계로, RT에서 10분 동안 10분 동안 100 μL의 세척 용액으로 섹션을 2회 세척하십시오.</li>
	<li>이차 항체(상이한 형광과 결합된 공액)를 희석하여 PGP9.5(1:700) 및 염소 항마우스를 검출하여 작동 용액에서 5G4(1:700)를 검출한다.</li>
	<li>RT에서 90 분 동안 이차 항체의 작동 용액의 100 μL을 포함하는 새로운 우물로 섹션을 전송합니다. 이 시점에서, 이차 항체 / ies와 공조 형광소의 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 96 웰 플레이트를 덮습니다.</li>
	<li>4.3 단계로서, 100 μL의 세척용액으로 적어도 10분 동안 2회 세척한다.</li>
	<li>RT에서 5분 동안 100 μL의 DAPI(PBS 1x에서 1:5,000 희석)를 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮니다.</li>
	<li>4.3 단계로서, 100 μL의 세척용액으로 적어도 10분 동안 2회 세척한다.</li>
	<li>슬라이드에 섹션을 올바른 위치에 놓고 잘못 접지하지 않도록 합니다.</li>
	<li>슬라이드에 장착 매체 몇 방울을 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다.</li>
	<li>공초점/형광 현미경을 사용하기 전에 슬라이드를 건조O/N하게 하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 4°C의 적절한 상자에 보관하여 빛노출을 피하십시오. 정확하게 저장되면, 신호는 약 6 개월 동안 표시됩니다. 참고: 새로 절단된 슬라이스를 포함하는 96웰 플레이트로부터 세척용액을 함유하는 96웰 플레이트(단계 4.1)로 단면도의 이송은 생검을 포착하는 데 도움이 되는 작은 브러시를 사용하여 수행된다. 첫 번째 우물에 섹션을 전송 한 후, 슬라이스가 다른 용액으로 배양 될 필요가있을 때마다 브러시의 도움으로 잘에서 잘 로 이동합니다.</li>
</ol>5. 면역 형광 화상 진찰
<ol><li>반전된 형광 현미경 또는 공초점 현미경(20X, 40x 이상 배율)에서 섹션을 보려면 최상의 결과를 위해 Z 스택 평면에 2 μm 증분의 연속프레임을 사용합니다.</li>
	<li>현미경 연결 카메라로 이미지 획득</li>
	<li>
적절한 이미징 소프트웨어(즉, ImageJ)를 사용하여 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션에서 긍정적인 신호를 분석합니다. 이렇게 하려면 아래에 언급 된 단계를 수행 합니다.
	<ol>
<li>ImageJ 소프트웨어로 파일을 엽니다.</li>
		<li>각 색상 채널을 분석하기 위해 이미지 > 색상 > 분할 채널을 클릭합니다.</li>
		<li>이미지 > 스택 > Z 프로젝트를 클릭하여 여러 섹션 획득의 병합을 가져옵니다.</li>
		<li>이미지 > 색상 > 채널을 병합하여 동일한 수집의 다른 색상 채널의 병합을 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>
부동액 (최대 6개월 동안 4°C에서 보관)</td>
			<td>글리세롤 30% 에틸렌 글리콜 30% 30% dH2O 10% 2x 인산완충</td>
		</tr>
<tr>
<td>
차단 솔루션 (지금 준비)</td>
			<td>4% 일반 염소 세럼 1% 트리톤 X-100 세탁 용액에서</td>
		</tr>
<tr>
<td>
냉동 보호제 (최대 6개월 동안 4°C에서 보관)</td>
			<td>글리세롤 20% 80% 소렌슨솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>
디소듐 수소 인산염 용액 (RT에서 최대 6개월까지 보관)</td>
			<td>dH2O에서 0.45M 디소듐 수소 인산염 (Na2HPO4) 멸균 병의 필터</td>
		</tr>
<tr>
<td>
리신 솔루션 (최대 3주 동안 4°C에서 보관)</td>
			<td>0.3M L-리신 모노하이드로염화물 용액 50% 0.1M 소렌슨 용액 pH7.6의 50% pH 7.4, 멸균 병의 필터</td>
		</tr>
<tr>
<td>
파라포름알데히드 (PFA) 8% (연기 후드 에서 준비하고 최대 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오)</td>
			<td>dH2O의 2.6M PFA (포름산 형성을 피하기 위해 60 °C를 초과하지 않는 55 °C_)<nr> 멸균 병의 필터</nr>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인산염 버퍼 2x (최대 6개월 동안 4°C에서 보관)</td>
			<td>6% 인산나트륨(NaH2PO4) 용액 dH 2O의 45% 디소듐 인산염(Na2HPO4) 용액</td>
		</tr>
<tr>
<td>
PLP 픽서솔루션 (순간에 준비, 연기 후드 아래)</td>
			<td>25% 파라포름알데히드 8% 0.01M 나트륨 (메타) 주유 75% 리신 솔루션&lt;</td>
		</tr>
<tr>
<td>
이수소 인산나트륨 모노하이드레이트 (RT에서 최대 6개월까지 보관)</td>
			<td>dH2O에서 0.52M 디수소 인산나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4*H2O) 멸균 병에 걸으세요.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
소렌슨의 솔루션 (최대 1개월 동안 4°C에서 보관)</td>
			<td>2.5% 모노나트륨 인산염 용액 18.7% 디소듐 인산염 용액 pH7.6, dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>
세척 용액 (지금 준비)</td>
			<td>0.25M 트리즈마 베이스 0.26M 나클 pH7.6, dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>
작업 솔루션 (지금 준비)</td>
			<td>50% 차단 솔루션 50% 세척 용액</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 필수 솔루션입니다. 프로토콜에 필요한 솔루션 목록및 프로토콜을 준비하는 방법에 대한 간략한 설명입니다.

<ol><li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+Tool+for+the+neurologist%27s+Tollbox%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li>
<li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilkinson%2C+PF+%22Skin%22">Skin</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).</li>
<li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+endings+in+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Federation+of+Neurological+Societies%2FPeripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li>
<li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-center%2C+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li>
<li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li>
<li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+%26+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li>
<li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li>
<li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson%27s+disease%3A+a+window+into+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li>
<li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson%27s+disease+from+multiple+system+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li>
<li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li>
<li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+nerve+phosphorylated+%CE%B1-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li>
<li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease%3A+a+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li>
<li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Disease%22%5BJournal%5D)">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 PD의 진단을 위한 피부 생검을 위한 자유 부동 면역형 광형 분석분석서를 기술합니다: 그것은 반대로 PGP9.5 항체를 가진 이중 면역 염색을 이용합니다, panaxonal 마커 및 반대로 5G4, 집합된 양식을 인식하는 형태 특정 항체 αSyn.
PD에 있는 진단 목적을 위한 피부 생검의 큰 이점은 그리고 그밖 단백질 형태 무질서에서: 1) 온화한 침략적인 기술에 의하여 질병에 수그린 신경 조직에 직접 접근하고 이렇게 예상되는 더 나은 결정으로 혈액 또는 CSF 와 같은 생물학적 유체보다 αSyn 응집체에 대한 민감도; 2) 신경 변성의 척도로서 표피 및 자율 신경 섬유 밀도를 검출하고 정량화 할 수있는 기회; 3) 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 가능성이 있으며, 질병 진행과의 상관관계를 세로방향으로 연구한다.
여기에 제안된 프로토콜은 빠르고 다재다능하며 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 조...

피부 생검은 신경 장애 분야의 진단 및 연구 도구로서 큰중요성을 획득했습니다 1. 실제로, 표피와 진피는 풍부한 신체 감각 신경 섬유를 포함 (myelinated 및 unmyelinated), nociceptive 무료 신경 엔딩, 감각 수용체 및 땀샘의 자율 적 내심, 혈관, 피지선과 근육 arrector pilorum 2.
20세기 중반에, PGP9.5 항체의 면역운동화학에 대한 설정은 인간 표피 포유류 피부의 광범위한 내막의 증거를 허용했다3. PGP9.5는 중추 및 말초 신경계(PNS)의 축축을 따라 균등하게 분포된 카복실 말단 하이드라제이다. 이 항체의 가용성은 피부에서 PNS의 형태 및 해부학을 명확히 할뿐만 아니라3,4와관련된 질병에 대한 연구를 구현할 수있었습니다. 피부 생검은 새로운 임상 엔티티를 정의하는 데 기여했습니다: 작은 섬유 신경병. 몇몇 국제적인 단은 피부 생검 분석에 의하여 작은 섬유 신경병의 경피 신경 섬유의 손실 및 현상/표시 사이 협회를 보여주었고 신경 morphometry를 위한 표준화한 프로토콜을 제공했습니다. 임상 실습6,7,8에사용되는 규범적 기준값.
최근 많은 양의 증거가 중추 신경계에서 잘못 접힌 단백질 축적을 특징으로하는 신경 퇴행성 질환이 다중 시스템 병리학인것으로나타났습니다 9. 실제로, PD는 체질니그라의도파민성 뉴런에서 αSyn 축적을 특징으로 하지만, αSyn 및 그의 병리학적 형태, 인산화αSyn(P-αSyn)이 말초 조직에서도 검출될 수 있음을 입증되었다. 위장관 점막10,침샘11,땀샘 및 필로모터 근육을 둘러싼 피부 자율 섬유12,13,14,αSyn의 병원성 형태에 대한 면역 반응성, Braak 가설에 따르면 αSyn 병리학이 뇌에 축적되기 전에 PNS에서 잘 시작될 수 있다고 흥미롭게 가정합니다15. 또한, p-αSyn의 존재는 프로드로멀 PD16,17따라서 피부 병리학αSyn이 유망한 초기 말초로 간주될 수 있는 REM 행동 장애를 가진 환자의 피부 신경에서 입증되었다. 조직병리학적 세포병리학적 마커.
PD에서 작은 섬유 신경병증의 연관성은 이전에 입증되었으며 상피 내 신경 섬유 밀도가 질병 진행을 반영하는 것으로 나타났다18,19. 따라서, 피부 생검은 PD에 있는 신경 변성을 공부하고 질병의 pre-mortem 조직 병리학 진단을 설치를 위한 유용한 공구입니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근하고 최소침습 절차인의 큰 이점이 있습니다. 마지막으로, 동일한 환자의 후속 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 세로 상관 관계를 연구할 수 있게 합니다.
우리의 실험실에서, PGP9.5및 형태 특이적 단일클론 5G4 항체로 이중 면역 염색을 이용하고, 작은 응집체20,21을포함하는 αSyn의 질병 특이적 형태를 인식하는, 유망한 높은 진단 효율성과 피부 신경에 αSyn 응집체의 존재19. 형태 질환에서 피부 생검의 면역 형광 분석은 단백질 응집체의 검출과 생체 내 신경 변성의 측정을 모두 결합하여 바이오 마커의 유망한 공급원으로 두드러집니다. 이하, 우리는 αSyn 응집체검출을 위한 피부 생검 및 자유 부동 면역형광 염색을 수행하는 것에 대한 쉽고 다양한 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 이 프로토콜은 피부 PNS에서 발현되는 관심 있는 임의의 다른 단백질을 표적화하기 위해 적응될 수 있다.
이하의 연구 프로토콜은 피부 생검19에의한 PD의 PNS에서 응집된 αSyn 분석의 진단 유틸리티를 평가하는 데 사용되었다. PD를 위한 포함 기준은: UK Brain Bank 진단 기준에 따라 명확한 임상 진단, 질병 기간 적어도 3 년, 아니 가족력, 및 역사에 있는 중요한 인식 손상 또는 중요한 dysautonomic 현상. 배제 기준은 신경병증(당화혈색소, 크레아티닌, 비타민 B12, TSH, 혈청 면역수정, HIV, HCV, 매독 및 보렐리아증)의 원인으로 알려졌다. 각 대상체는 3개의 해부학적 부위(C8 피부 수준에서 목, 무릎 위 허벅지 10cm, 측면 malleolus 위 다리 10cm)에서 3mm 직경의 피부 생검을 시행했으며, 이는 임상적으로 더 영향을 받았습니다. 일반적으로, 이하의 프로토콜은 피부 생검을 처리하고 자유 부동 면역형광 염색 및 분석을 수행하는 것에 관한 것입니다. 따라서 피부 조직에 관심 있는 다른 단백질의 검출을 위해 적응및 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>5G4 (안티 휴먼 &알파; Syneclein 5G4)</td><td>Analytik Jena Roboscreen</td><td>847-0102004001</td><td>마우스 단클론&nbsp;</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1971418</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 염소 안티 마우스 IgG&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>1922849</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>인산수소이나트륨 용액</td><td>Merk Millipore</td><td>106586</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신 모노하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>알드리치 화학</td><td></td><td></td>441244</tr><tr><td>PGP9.5</td><td>Abcam</td><td>ab15503</td><td>토끼 다클론</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 디하이드로겐 포스페이트 일수화물</td><td>Merck Millipore</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>나트륨(메타)주기물&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1878</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>벡타실드&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>마운팅 미디어</td></tr></tbody></table>

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 synuclein 응집체를 표적으로 하는

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

현재까지 대부분의 신경 퇴행성 질환의 경우 사후 조직 병리학적 결정적 진단만 가능합니다. 파킨슨 병 (PD)의 경우, 진단은 여전히 도파민성 뉴런의 대부분이 이미 손실 된 질병 과정에서 나중에 나타나는 운동 관련 의 임상 징후에만 의존합니다. 그러므로, 질병의 시작또는 그것을 개발의 위험한 상태에 환자를 확인할 수 있는 biomarker를 위한 강한 필요가 있습니다. 지난 몇 년 동안, 피부 생검은 작은 섬유 신경 병증과 같은 말초 신경 질환에 대한 훌륭한 연구 및 진단 도구로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 작은 섬유 신경 병 증 및 알파 synuclein (αSyn) 신경 예금 PD 환자에서 피부 생 검에 의해 표시 되었습니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근할 수 있고, 최소침습및 고통없는 절차인의 큰 이점이 있습니다. 더욱이, 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 종방향 상관관계를 연구할 수 있게 한다. 우리는 PD 환자의 피부 신경 섬유에서 αSyn 응집체의 존재를 조사하기 위해 표준화 된 신뢰할 수있는 프로토콜을 설정합니다. 이 프로토콜은 몇 가지 짧은 고정 단계, 극저온 절편 및 다음 두 개의 특정 항체와 자유 부동 면역 형광 이중 염색을 포함: 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5) 검출을위한 절단 신경 섬유 및 항 5G4를 표시하기 위해 αSyn 집계. 그것은 또한 피부 신경에 관심있는 다른 단백질을 대상으로 적용 할 수있는 다재 다능하고 민감하고 수행하기 쉬운 프로토콜입니다. αSyn 응집체를 표시하는 능력은 PD의 사전 모뎀 조직 병리학 진단을 확립하기위한 도구로 피부 생검의 사용에 또 다른 단계 앞으로.

기재된 절차(그림 1)에 따라, PD 환자의 자율 구조를 내음하는 진피 신경 근막에서 5G4 항체로 표지된 αSyn 응집체를 검출하였다. 알파-시누클레인 침전물의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선신호로서 나타난다(그림 2). 실제로, 3개의 해부학적인 사이트 (자궁 경부, 허벅지 및 말단 다리)에 있는 19명의 PD 환자 그리고 17의 통제에 있는 이 프로토콜을 이용하는 우리는 5G4가 건강한 통제에 대하여 감도의 81%와 α-Syn의 86%가 있고 P-Syn은 감도의 56%가 있었다는 것을 것을을 발견했습니다 및 특이성의 100 %19.
특히, 우리는 5G4와 P-αSyn 양성 예금을 주로 땀샘 주위의 신경뿐만 아니라 근육 발기 필리, 작은 혈관 및 피상경 및 진피 신경총에서 발견했으며, 피상경 내 신경 섬유에서는 결코 발견되...

여기에서, 우리는 파킨슨 병및 파킨슨 병에 관여하는 알파 시누클레인의 질병 특정 형태 변이체의 식별을 허용하는 피부 생검 섹션에 자유 부동 간접 면역 형광 분석에 대한 프로토콜을 제시하고 말초 신경계.

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

파킨슨 병의 진단은 여전히 실질적인 니그라의 뉴런의 대부분이 이미 손실 될 때 질병의 과정에서 나중에 나타나는 운동 참여의 임상 징후에 의존합니다. 이 프로토콜은 질병의 잠재적인 새로운 biomarker를 나타내는 피부 생검에 의한 진피 신경 분석을 임상 시험에서 사용할 수 있게 합니다. 피부 생검은 병리학에 수그리는 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 평가할 수 있는, 침략적이지 않은 절차입니다.알파 synuclein 피부 생검에 의한 검출은 잠재적인 치료가 가장 효과적인 때, 아마 초기 단계에서 진단 목적을 위해 사용될 수 있습니다. 같은 환자에 있는 후속 피부 생검은 인간 적인 피부 신경계에 퍼지는 알파 synuclein 집계의 시간 및 특별한 과정 분석을 허용합니다. 이들은 질병의 병기 발생에 빛을 비출 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜 중 표 하나에 설명된 대로 새 PLP 고정 솔루션을 준비합니다. 피부 생검을 수집 한 직후 고정 용액의 10 밀리리터가 들어있는 튜브에 담급하십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오.다음 날, 연기 후드에, PLP 고정을 부드럽게 제거합니다. 같은 튜브에서 생검을 각각 5분 동안 3회 세척하여 각 세척에 대해 0.1 개의 어금니 소렌슨의 용액 5 밀리리터를 사용하십시오. 소렌슨의 용액을 폐기하고 5밀리리터의 냉동 보호용 솔루션을 추가합니다.섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 다음 날, 극저온으로 절단이 1 주일 이내에 수행 될 경우 4 섭씨에 생검을 저장합니다. 먼저 극저온을 영하 20도로 설정합니다.극저온을 가지고 극저온 포함 매체로 채웁니다. 핀셋을 사용하여, 극저온 의 바닥에 평행 세로 축으로, 극저온 포함 매체에 생검을 담급. 스냅은 액체 질소로 샘플을 동결하고, 올바른 방향으로 생검을 포함하는 극저온 염기질의 고체 큐브를 얻습니다.샘플을 냉동에 넣고 생검이 적응할 수 있도록 30 분 동안 기다립니다. 그런 다음 저온 측정기의 샘플을 수정하고 50 마이크로미터 섹션으로 자른다. 작은 브러시를 사용하여 저온 섹션을 각 우물에 200 마이크로리터의 부동액용을 포함하는 96웰 플레이트로 옮춥니다.그 후, 접시를 영하 20도에 보관하십시오. 우선, 신선한 96웰 플레이트의 우물 중 일부를 100 마이크로리터의 세척 용액으로 채우도록 하십시오. 저장 플레이트에서 세척 용액을 포함하는 섹션으로 옮기는 섹션.실온에서 10 분 동안 세척 용액에 섹션을 둡니다. 그런 다음 각 섹션을 동일한 세척 용액을 포함하는 빈 우물로 옮기고 세척을 반복합니다. 다음으로, 섹션에 세척 솔루션을 추가하고 차단 용액 100 마이크로 리터를 포함하는 새로운 우물로 전송합니다.실온에서 최소 90분, 최대 4시간 동안 배양합니다. 일차 항체, 안티 PGP9.5 및 항-5G4를 작업 용액에서 희석시. 1차 항체의 작동 용액의 100 마이크로리터를 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮기고, 실온에서 하룻밤 동안 배양한다.다음 날, 이전에 설명한 대로 세척용액을 함유한 우물의 섹션을 세척한다. 작업 용액에서 PGP9.5 및 염소 항마우스를 검출하기 위해 이차 항체, 염소 안티래빗을 희석한다. 세척된 부분을 이차 항체의 작동 용액 100마이크로리터를 포함하는 새로운 우물로 옮는다.알루미늄 호일로 접시를 덮고 이차 항체로 공칭된 플루오로포어의 표백을 피하고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그 후, 앞에서 설명한 대로 세척용액으로 2회 세척한다. 실온에서 5분 동안 DAPI 100 마이크로리터가 포함된 세척된 섹션을 새로운 우물로 옮겨 넣습니다.앞에서 설명한 대로 세척 용액으로 섹션을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 슬라이드에 섹션을 올바른 위치에 장착하여 잘못된 접이식을 피합니다. 슬라이드에 장착 매체를 몇 방울 더 추가하고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다.슬라이드가 하룻밤 동안 건조하게 하십시오. 다음 날, 슬라이드를 섭씨 4도에 적절한 상자에 보관하여 빛 노출을 방지합니다. 반전형 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 섹션을 봅니다.현미경에 연결된 카메라로 이미지를 획득합니다. 그런 다음, 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션에서 양양성 신호를 분석한다. 설명된 방법에 따라, 5G4 항체로 표지된 알파 시뉴클레인 응집체는 PD 환자의 내부 직속 구조인 진피 신경 매심에서 검출된다.알파 synuclein 예금의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선 신호로 나타납니다. 이 프로토콜을 대표로 사용하는 것은 19명의 PD 환자및 3개의 해부학적인 사이트에 있는 피부 생검에 있는 17개의 통제가 건강한 통제에 비교될 때 81%의 감도 및 86%의 특이성을 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 인광 알파 시뉴클레인은 56%의 민감도를 가지며, 100%5G4의 특이성 및 인포레이트 알파 시뉴클레인 양성 침전물은 주로 땀샘 주변에서 발견되지만, 근육 아레토르 필리, 작은 혈관, 피및 진피 플렉서스에서 발견되지만, 결코 피피연성 신경 섬유섬유에 들어가지 않는다.일반적으로 땀샘 내 루멘 내에서, 5G4 또는 인포리드 알파 synuclein 양성으로 잘못 해석될 수 있는 비특이적 신호를 관찰할 수 있다. 이러한 유형의 신호는 점선, 구형이며, 1차 및 이차 항체가 없는 기술적 제어에서 입증된 바와 같이 장루 내 자가형 물질때문일 수 있습니다. 형태학적으로 필라멘트및 길쭉한 신경 섬유를 표시하는 PGP9.5와의 공존은 올바른 신호를 식별하는 데 도움이됩니다.따라서, 5G4 신호의 특이성은 축산 마커를 가진 이중 면역염색에 의해 높게 증가된다. 생검의 정확한 고정은 양질의 면역 형광 염색을 생성하고 형광 신호의 신뢰할 수있는 해석을 위해 필요합니다. 고정제가 올바르게 준비되지 않았거나 과다 고정이 발생한 경우, 그 결과는 진피 표피 접합을 가로지르는 신경 섬유의 신호를 가하거나 주요 진피 구조를 내면으로 가리는 높은 자동 형광이 될 것입니다.이 절차의 가장 중요한 단계는 조직 고정입니다. PLP 고정 솔루션의 pH, 및 인큐베이션타이밍에 주의를 기울여 자동 불발성과 특정 신호를 피하십시오.

targeting-alpha-synuclein-aggregates-cutaneous-peripheral-nerve

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

세제, 환원제 및 추적 염료가 포함된 로딩 버퍼를 추가합니다.

Western Blotting을 이용한 인산화된 알파-시누클레인 검출

이 비디오는 피부 생검 절편에서 신경퇴행성 질환 특이적 알파-시누클레인 응집체를 검출하기 위한 면역형광 분석을 보여줍니다. 자유 부유 면역 염색은 피부 뉴런의 카르복실 말단 가수분해효소와 알파-시누클레인 응집체를 형광 라벨링하는 데 사용됩니다. 컨포칼 현미경 하에서, 두 항체로부터 형광을 가진 세포는 진피 뉴런에 알파-시누클레인 응집체가 존재함을 나타냅니다.

피부 생검 절편에서 알파-시누클레인 응집체를 검출하기 위한 면역형광 분석

이 비디오는 알파-시누클레인(αS) 응집체로 처리된 뉴런의 면역 염색을 보여줍니다. 뉴런은 먼저 αS 응집체로 처리됩니다. 그런 다음 고정, 투과화 및 차단 용액으로 처리됩니다. 1차 항체가 추가되고, 그 다음에 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색이 추가됩니다. 그런 다음 샘플을 장착하고 현미경으로 관찰합니다.

Alpha-Synuclein 응집체로 처리된 뉴런의 면역염색

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

바이오패닝 기술과 원자력 현미경을 사용하여 낮은 농도에서도 모든 생물학적 물질에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 음성 및 양성 바이오패닝 시스템을 만들었습니다.  우리는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 관련된 TDP-43 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 데 성공했습니다.

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

이 기사의 목표는 단량체 성 알파-sy뉴 클레 인, 후속 품질 관리 및 생체 내에서 미리 형성 된 섬유 소의 사용 으로부터 피 브 릴의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

배우세요 자유 부동 면역 형광 분석법을 이용하여 피부 생검에서 알파 시누클레인 응집체를 검출하는 방법을. 이 기술은 파킨슨병 조기 진단을 위한 바이오마커 연구에 활용됩니다.

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

더 많은 동영상 탐색