근육 질환의 구조적 기초를 연구하기위한 도구로 그대로 뮤린 골격 근육의 X 선 회절

생리학적으로 그대로 마우스 골격 근은 생리적 과정에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 많은 구조적 정보를 포함하는 고품질의 X 선 회절 패턴을 생성 할 수 있습니다. X선 회절은 실제 생리적 시기에 실제 생리적 조건에서 살아있는 근육 조직으로부터 고해상도 구조 정보를 습득할 수 있는 유일한 기술이다. 많은 근육 질환은 상속됩니다.

대부분의 근막병을 유전적으로 수정할 수 있는 가용성이 증가함에 따라 X선 회절은 질병 메커니즘에 대한 구조적 통찰력을 제공하고 치료 전략을 나타낼 수 있습니다. 대부분의 엑스텐소 디포럼 롱러스와 솔레우스 근육은 이 목적을 위해 특히 편리합니다. 그러나 작은 동물의 다른 많은 근육은 그대로 해부하고 비슷한 방식으로 처리 될 수 있습니다.

절차를 시작하기 전에 결합된 모터 포스 트랜스듀서, 고출력 바이파티스 전류 자극기를 갖춘 모터 포스 트랜스듀서 컨트롤러 및 컴퓨터 제어 데이터 수집 제어 시스템을 켭니다. 다음으로, 차가운 링거의 용액으로 마우스의 뒷다리에 피부를 뿌리고 미세해부 가위를 사용하여 허벅지 주위의 피부를 자른다. 숫자 다섯 개의 집게를 사용하여 피부를 빠르게 당겨 근육을 노출시키고 뒷다리를 절단합니다.

사지를 산소링거 용액이 들어 있는 탄성모머 코팅 해부 접시에 놓고 쌍안경 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 밑바닥 근육을 수확하려면 위쪽을 향한 위장관 근육으로 뒷다리를 고정하십시오. 위트론혈증/솔레루스 근육 그룹의 단면 힘줄을 자르기 위해 미세 한 가위를 사용하십시오.

근육이 뼈에서 부드럽게 천천히 멀리 들어 올릴 수 있도록 위트론혈증 근육의 양쪽에 근막을 잘라. 그런 다음 발바닥 근육의 근위 힘줄을 해제합니다. 위장관 근육과 접시에 있는 말단 힘줄을 포함하는 근육 단을 아래로 고정하십시오.

근위체 힘줄을 통해 발바닥 근육을 부드럽게 들어 올려 위장관 근육과 분리하고 가능한 한 솔레탈 성향의 많은 것을 그대로 둡니다. 엑스텐소 디포럼 롱클로스 또는 EDL 근육을 수확하려면, 티비알리스 전방 근육이 위쪽으로 향하는 접시에 뒷다리를 고정하고 티비알리스 전방 근육을 따라 근막을 자른다. 집게를 사용하여 근막을 깨끗하게 당기고 티비알리스 전방 근육의 단부 힘줄을 자른다.

티비알리스 전방 근육을 들어 올리고 EDL 근육을 당기지 않고 조심스럽게 잘라 내고 무릎의 측면을 열어 두 힘줄을 노출시합니다. 근위 힘줄을 잘라, 우리에게 가능한 한 힘줄의 대부분을 떠나 여전히 근육에 부착하고 부드럽게 EDL 근육을 들어 올리기 위해 힘줄을 당겨. 그런 다음 다정한 힘줄이 노출되면 잘라냅니다.

수확 된 근육을 장착하려면 힘줄을 통해 근육을 고정하고 가능한 한 여분의 지방, 근막 및 힘줄을 많이 다듬습니다. 미리 묶인 매듭에 힘줄을 넣고 봉합사를 묶어 봉합사를 단단히 묶습니다. 금속 후크 주위에 두 번째 매듭을 묶고 힘줄의 다른 쪽 끝에 절차를 반복합니다.

그런 다음 실험 챔버의 바닥에 짧은 후크를 부착하고, 듀얼 모드 힘 트랜스듀서 모터에 긴 후크를 부착합니다. 100% 산소로 실험 챔버에서 용액을 거품. 자극 프로토콜과 근육 길이를 최적화하기 위해 트랜스듀서 모터에 부착된 마이크로 조작기를 조정하여 15내지 20밀리뉴턴 사이의 기준선 장력을 생성하여 근육을 스트레칭하는 최상의 자극 파라미터를 찾습니다.

자극 전압을 40볼트로 설정합니다. 자극 전류는 트위치 힘이 추가적으로 증가하지 않을 때까지 체계적으로 증가합니다. 최적의 길이를 찾으려면 활성 힘이 증가하지 않을 때까지 근육 길이를 늘리고 단일 트위치로 근육을 활성화합니다.

1초 파상 수축을 수행하여 마운팅을 테스트하고 필요에 따라 근육을 최적의 기준력으로 다시 늘이시게 합니다. 그런 다음 디지털 캘리퍼로 근육 길이를 밀리미터로 기록합니다. 빔 위치를 확인하려면 X 선과 비디오 십자선 생성기에 반응하여 어두운 지점을 생성하는 X선 민감한 용지 조각을 사용하여 종이의 화상 마크와 일치하는 십자선을 만듭니다.

BioCAT가 제공된 그래픽 사용자 인터페이스를 샘플 포지셔너에 사용하여 빔 위치에 근육을 중앙으로 지정하고 샘플 스테이지를 초당 10 내지 20밀리미터로 진동하여 노출 시 근육 전체에 X선 용량을 퍼뜨립니다. 콜라겐을 포함하는 근막의 큰 영역을 피하고 여행의 전체 경로 동안 조명상태를 유지하기 위해 이동하는 시료를 관찰한다. 검출기를 무장하고 데이터 수집 시스템에서 트리거를 기다립니다.

그런 다음 기계적 및 X선 데이터를 동시에 트리거하여 동기화합니다. X선 패턴은 10밀리초 노출 시간과 50밀리초 노출 기간으로 프로토콜 전체에서 지속적으로 수집됩니다. 이 대표적인 동위원소 파탄 수축에서 EDL 근육은 0.5초 동안 쉬고 1초 동안 활성화되었고, 그 다음으로 1.5초의 이완이 뒤따랐다.

근육 X 선 회절 패턴은 sarcomere 내부의 구조에서 나노미터 해상도 구조 정보를 제공 할 수 있습니다. 두꺼운 필라멘트를 포함하는 Myosin 기지를 둔 층 선은 근육 휴식에서 패턴에 강하고 날카로운, 얇은 필라멘트를 포함하는 actin 기지를 둔 층 라인은 수축 근육에서 패턴에서 더 두드러진 동안. 수축 패턴으로부터 휴식 패턴을 빼서 얻은 차이 패턴은 건강하고 병들인 근육의 힘 발달 시 구조적 변화에 빛을 비출 수 있다.

근육 수축 및 이완 동안 분자 이벤트의 밀리초 시간 척도에서 이러한 구조적 변화에 따라 X 선 회절 패턴은 상당한 구조적 정보를 나타낼 수 있습니다. 이러한 대표적인 적도 반사 분석에서 오픈 소스 MuscleX 패키지에서 적도 루틴을 이용한 적도 반사 분석에서 적도 강도 비는 근육에서 작용하는 근신의 근접성을 나타내며 수축하는 뮤린 골격 근에서 부착된 교차 교량의 수와 밀접한 상관관계가 있다. 두 1, 0 반사 사이의 거리는 인터필라멘트 간격과 반비례한다.

깨끗한 해부는 성공적인 그대로 근육 X 선 실험의 열쇠이므로 근육 준비 중에 기계적 손상을 피하십시오. 전체 근육을 가진 모든 표준 생리 프로토콜은 이 실험에서 구현될 수 있고 급속한 기계적인 과기 도중 근육 활성화, 이완 및 교차 다리 행동을 공부하는 데 이용될 수 있습니다. 마우스의 유전 적 조작은 점점 더 정교해지고 있습니다.

새로운 형질전환 마우스 모델은 인간 근막환자에 대한 새로운 치료 방향을 나타내기 위해 보다 구체적이고 통찰력있는 실험을 할 수 있게 합니다.