Name: 3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 인간 근종 유래 매트릭스를 활용한 3차원 스페로이드 침입 분석법으로 암 미세환경에서 종양 세포 침입을 연구하는 방법을. 이 기법은 환자 유래 고형암 샘플에 적용 가능하며 고처리량 약물 테스트와 실시간 세포 분석을 지원합니다.

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저자는이 연구의 기금 자에 게 감사 합니다: Sigrid 주 리소 재단, 핀란드 암 학회, 헬싱키 대학 중앙 병원 연구 기금. 저자는 기술 도움을 위해 헬싱키 대학의 바이오 메디 움 이미징 유닛을 인정 합니다.

1. 다중 세포 종양 구형 체의 생성
참고: 이 프로토콜은 여기에서 UT-SCC-42A 및-42B 세포 주를 통해 입증 되었지만 다른 세포 주를 사용 하 여 적용할 수도 있습니다.
<ol><li>42A 및-42B 세포를 인산 완충 식 염 액 (PBS) 6 mL에 넣고 0.05%의 트립 신-EDTA를 75 플라스 크에 첨가 하 고 플라스 크 를 세포 배양 인큐베이터 (37 ° c, 5% co2, 95% 습도)로 세척 하여 2-5 min으로 한다.</li>
	<li>세포가 현미경으로 분리 되어 있는지 확인 하십시오. 그런 다음 완전 한 Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM) 배지 (DMEM)를 첨가 하 고 50 효소를 중화 하는 100의 페니실린, 100 μ g/m l streptomycin, 250 ng/ml의 암포 테리 신 B, 0.4 μ g/m l 아 스 코르 브 산) 2 플라스 크)를 넣고 세포 현 탁 액을 15ml 원뿔형 튜브로 전달 한다. 주: 연구 중인 세포에 적합 한 세포 배양 배지를 선택 하십시오.</li>
	<li>200 x g 에서 세포 현 탁 액을 5 분간 원심 분리 합니다.</li>
	<li>상층 액을 제거 하 고 2-5 mL의 완전 DMEM에서 세포 펠 릿을 중단 합니다.</li>
	<li>세포를 카운트 하 고 완전 한 DMEM 세포 현 탁 액을 2만 세포/m l의 최종 농도로 희석 하십시오. 참고: 최적의 세포 수는 각 세포 라인에 대해 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션의 50 μ l을 각각의 초 저 부착 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 잘 주입 하 여 최종 농도의 1000 세포를 잘 추출 합니다.</li>
	<li>플레이트를 세포 배양 인큐베이터 (37 ° c, 5% CO2, 95% 습도)로 이송 한다. 4 일 후, 반전 현미경으로 종양 세 포스 페 로이드 형성을 육안으로 확인 하 고 분석을 진행 한다. 우물 당 하나의 구형 체만 있는지 확인 하십시오. 참고: 구형 체를 형성 하는 데 걸린 시간은 다른 세포 주 들 사이에서 변한다.</li>
</ol>2. 입체 세 포스 페 로이드 침 습 분석
참고: 젤이 우물에 추가 될 때 1:1 희석 되기 때문에 2x 솔루션을 준비 하십시오.
<ol><li>37 ° c에서 유지 되는 수 조에서 얼음 및 피 브리 노 겐 원 액에 HMDM을 재개 한다. 완전히 가용 화 되 고 얼음에 용액을 넣지 않을 때까지 피 브리 노 겐을 방해 하지 마십시오. 침전이 발생 합니다.</li>
	<li>각 시 약의 적절 한 부피를 섞어 주세요: 1MG/MLHMDM (최종 농도: 0.5 밀리 그램), 0.6 (최종 농도: 66.6 0.3/ml), 최종 농도: 7mg/ml의 피 브리 노 겐 1 밀리 그램/m l 33.3. ). 참고: 단지 우물에 혼합물을 분주 하기 전에 피 브리 노 겐을 추가 하 고 신속 하 게 작동; 그것은 몇 분 안에 젤을 형성 합니다. 한 번에 몇 개의 우물을 치료 하십시오.</li>
	<li>젤의 50 μ l을 각각의 웰에 넣습니다. 팁을 우물의 안쪽 벽 쪽으로 향하게 하 고 pipet를 천천히 향하게 하십시오. 기포 (역 피 펫 팅 기법 사용)를 피하고 포스 페 로이드를 웰의 중심에서 움직이지 않도록 하십시오.</li>
	<li>플레이트를 다시 세포 배양 인큐베이터에 반납 하 고 HMDM/피 브린 매트릭스가 30 분 동안 응고 되 게 하 고, 젤의 상단에 DMEM 완전 한 수 100 μ l를 각각의 웰에 첨가 한다.</li>
</ol>3. 이미징
<ol><li>역 광 현미경을 사용 하 여 구형 체를 매일 이미지 한다. 또는 자동 이미징 시스템을 사용 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 분할
<ol><li>일 아 티 크를 열고 픽셀 분류 워크플로 (그림 1A)를 선택 합니다. 사용자가 만든 주석을 기반으로 픽셀을 분류 합니다. (Ilp)를 컴퓨터에 저장 합니다.</li>
	<li>분석용 이미지를 추가 합니다. 입력 데이터 를 클릭 하 고 새로 추가 를 선택한 다음 이미지를 선택 합니다 (그림 1B).</li>
	<li>
피쳐 선택에서 피쳐 선택을 클릭 하 고 피쳐 (그림 1C, 빨간색 직사각형)를 선택 합니다. 주: 선택한 피쳐는 대략적으로 배경과 객체를 분리 하는 시각적 특성과 일치 해야 하며 분류자를 학습 하는 데 사용 됩니다.<ol>
<li>상자를 클릭 하 여 기능을 선택 합니다. 선택한 상자가 녹색으로 바뀝니다 (그림 1C, 파란색 직사각형). 참고: 여기서 사용자는 여러 가지 기능 유형 및 축척 중에서 선택할 수 있습니다. 색상 또는 명도를 기준으로 개체를 분리 하려면 색상/강도를 선택 해야 합니다. 밝기 또는 색상 그라디언트를 기준으로 오브젝트를 분리 하려면 가장자리를 선택 해야 합니다. 질감은 이미지의 개체에 특별 한 텍스처 모양이 있는 경우 중요 한 기능입니다. 이 분석에서는 컬러/강도 (시그마 0)와에 지 시그마 6이 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
교육의 경우 교육을 클릭 하 고 교육 섹션에 레이블 1과 레이블 2 라는 레이블이 있습니다 (그림 1D, 빨간색 직사각형). 레이블이 하나만 있는 경우 레이블 추가를 눌러 새 레이블을 추가 합니다 (그림 1D, 파란색 직사각형).
	<ol>
<li>배경을 레이블 중 하나 (그림 1d, 노란색)와 다른 레이블이 있는 셀로 표시 합니다 (그림 1d, 파랑).</li>
		<li>이미지의 처음 10%에 대 한 소프트웨어를 훈련. 현재 보기에서 다음 이미지를 선택 합니다.</li>
		<li>첫 번째 이미지의 셀과 배경이 표시 된 후 라이브 업데이트 (그림 1D, 자주색 사각형)를 누릅니다. 참고: 다음 이미지를 사용 하면 이전 이미지에 따라 분석이 자동으로 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>훈련이 완료 되 고 일 아 티 크는 모든 이미지를 분석 한 후, 예측 내보내기를클릭 합니다. 소스에서 간단한 세분화 를 선택 합니다. 확률 또는 다른 것을 선택 하지 마십시오 (그림 1E).</li>
	<li>예측 내보내기 섹션에서 이미지 설정 내보내기 선택 에서 원하는 출력 파일 형식을 선택 합니다 (그림 1E). 모두 내보내기를 클릭 하 여 라벨의 결과를 내보냅니다 (그림 1F). 이 파일은 원본 이미지와 동일한 폴더로 내보내집니다. 참고:이 실험에서는. h5 형식이 사용 됩니다.</li>
</ol>5. 피지 ImageJ 지역 분석
<ol><li>
배율 설정
	<ol>
<li>피지 ImageJ에서 스케일 막대로 원본 이미지를 엽 니 (그림 2a). 이미지의 크기와 치수가 분석 된 이미지와 동일한 지 확인 합니다. 선 선택 도구를 사용 하 여 알려진 길이의 선을 그립니다 (그림 2B). 참고: 이 프로토콜은 피지 ImageJ 1.51 (64 비트)를 사용 하 여 실행 되 고 일 라이 크-1.3.2 rc.</li>
		<li>분석 및 배율 설정 (그림 2C)을 클릭 합니다. 알려진 거리 필드에 알려진 거리 를 설정 하 고 적절 한 단위를 설정 하 고 전역 (그림 2d)을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
매크로 설치
	<ol>
<li>플러그인이 설치 되지 않은 경우 다음 단계를 따르십시오. 도움말, 업데이트를 클릭 합니다. 열기 창 Imagej 업데이터, 업데이트 사이트 관리를 클릭 합니다. 열린 창에서 업데이트 사이트 관리를 클릭 하 고 다음 닫기를클릭 합니다. 다음 클릭 변경 적용 창 imagej 업데이터. 이 프로세스는 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 다음 창은 텍스트가 성공적으로 업데이트된 정보 입니다. 확인 을 클릭 하 고 imagej를 다시 시작 합니다.</li>
		<li>플러그인, 매크로및 설치 를 클릭 합니다 (그림 3a). 그런 다음 카운터 .ijm 파일을 선택 하 고 ( 추가 정보참조) 열기를 클릭 합니다. 참고: 매크로는 특히 영역을 측정 하기 위해 작성 되었습니다. 소프트웨어를 열 때마다 매크로를 설치 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면적 분석
	<ol>
<li>모든 플러그인이 설치 되 면 이미지를 분석 합니다. 플러그인 을 클릭 하 고 ( 그림 3C)로 스크롤합니다. HDF5 가져오기를선택 하 고,. h5 형식의 파일을 선택 하 고 열기 및 로드를 클릭 하 고 LUT를 적용 합니다 (그림3c, D).</li>
		<li>키보드 (매크로)에서 a 버튼을 누르면 요약 창에 전체 영역이 표시 됩니다 (그림 3E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spheroids+with+Enhanced+Aggressiveness+to+Mimic+Human+Liver+Cancer+In+vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo.</a> Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
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<li>Hoornstra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermented+Lingonberry+Juice+Inhibits+Oral+Tongue+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+In+vitro+Similarly+to+Curcumin%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin.</a> In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).</li>
</ol>

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제시 된 방법은 인간 종양 미세 환경 모방 행렬 내에서 암 세포의 침투성을 평가 하는 3 차원 인간 종양 기반 분석을 제공 한다. 암 세포 침략은 표준 현미경으로 매일 화상 진 찰과 심상 분석 소프트웨어를 사용 하 여 쉽게 측정 될 수 있습니다. 이 방법은 단순히 증식 하는 것이 아니라 세포 침공을 보여줍니다.
MSDM과 달리 HMDM/피 브린 매트릭스는 온도 제어가 필요 하지 않습니다. 이 방법은, 특히 한 플레이트에서 다른 판으로 구형 oid를 전송할 필요 없이, 수행 하기 쉽다. 그것은 단지 하나의 기술적으로 민감한 단계, 매트릭스에 피 브리 노 겐의 추가. 피 브리 노 겐은 몇 분 후 겔을 시작 하기 때문에, 피 브리 노 겐을 추가 하려면 한 번에 몇 개의 웰만을 강력 하 게 파이 펫 팅 하 고 처리 해야 합니다. 또한 파이 펫 팅이 고압 방식으로 수행 되는 경우 스 페 로이드를 교란 하 고 U 자형의 중심 위치에서 이동 하는 위험이 있습니다. 구형 체의 전위는 이미징 및 결국 분석을 복잡 하 게 할 수 있습니다.
분석은 HMDM 또는 피 브리 노 겐의 농도를 변경 하 여 수정할 수 있습니다. 세포는 또한 뒤에 오는 분자 연구를 위해 고정 되 고 염색 될 수 있습니다. 이 방법은 완전히 자동화 된 형태로 수정 될 수 있지만, 일반 현미경과 두 개의 오픈 소스 소프트웨어로 수행 할 수 있으며 값비싼 장비가 필요 하지 않습니다.
기존의 MSDM 기반 3D 분석과 비교 하 여,이 분석은 세포 침 습 특성을 더 잘 나타낼 수 있었다. MSDM과 같은 지 하 막 함유 라미 네이션이 풍부한 매트릭스에서 성장 하는 구형 체는 실제 침 윤 보다 암 세포의 증식이 더 많을 수 있으며,이는 낮은 침입 용량으로 인해 여러 암 세포 주에서 침략 분석에 부적합 합니다. 또 다른 자주 사용 되는 매트릭스 인 I 형 콜라겐은 3 차원 배양 시 가장자리에서 줄어드는 경향이 있으며,이는 스 페 로이드 현지화와 웰의 이미징에 영향을 줍니다. 또한 인간 종양 미세 환경 모방 모델 (myoma 디스크 및 그것의 녹는 형태)를 사용 하 여 더 많은 (HSC-3) 및 더 적은 (SCC-25) 공격적인 혀 암 세포 주에 대 한 내재 성 침 습 적 성질 간의 차이가 입증 되었습니다 10,13.
이 분석은 또한 인간 근 종 종양의 잔여 물질 로부터 HMDM이 추출 되기 때문에 MSDM을 사용 하는 것 보다 더 윤리적 이다. 현재, hmdm은 인간 종양 유래 ECM 제품으로 서, 많은 암 관련 시험관 내 분석8,10에 적합 한 것으로 보인다. 앞으로 동물 조직 유래 매트릭스는 매트릭스 생산을 위해 동물을 희생할 필요성을 줄이기 위해 인간 종양 기반 매트릭스로 대체 될 수 있습니다.
2D 세포 배양 분석을 3D 방법으로 대체 하면 암 세포 거동에 대 한 보다 정확한 정보를 제공 합니다. 현재 여러 가지 3D 모델과 상업용 행렬이 있지만 불행히도 모든 암 세포 주에 적합 한 것은 없습니다. 연구원은 그들의 특정 분석을 위한 가장 적합 한 매트릭스를 선택 해야 합니다. 분석 및 매트릭스의 최적 매칭은 까다로울 수 있지만 결과의 신뢰도를 현저 하 게 높일 수 있습니다.

종래의 2 차원 (2D) 세포 배양 연구는 암 연구에 상당히 기여 하였다. 현재, 연구원은 더 나은 생체 내 조건1을 모방 하기 위하여 3 차원 (3d) 세포 배양 분석을 향해 더 이동 하 고 있습니다. 상기 3 차원 암 세포 배양 액은 세포 세포 및 세포 기질 상호작용, 유전자 발현 프로필, 약물 감수 성 및 신호 전달 경로의 활성 측면에서 복잡 한 종양 미세 환경을 보다 정확하 게 반영 한다.
여러 가지 3 차원 세포 배양 모델은 종양 조직에 대 한 종양의 설명과 같은 암 연구에 사용 되는, 칩 상에 서, 그리고 다중 세포 종양 스 페 드 로이드3,4. 다중 세포 종양 구형은 현재 인간 종양1,5에서 생체 내 조건의 여러 특징을 모방 함에 따라 널리 사용 되 고 있다. 스 페 로이드 직경이 500 μ m 보다 크면, 저 산소 부위 및 괴 사 중심을 갖고,이에 따라 생체 내 종양 상황2를 나타내는 것 이다.
많은 합성 (예를 들면, 실록) 및 동물 유래 (예를 들어, 랫 트 테일 타입 I 콜라겐 및 마우스 육 종 유래 매트릭스, msdm 이라고 함) 매트릭스는3차원 세포 배양 분석 실험을 위해 개발 되어 왔으며, 7,8. 지금까지, 상업적으로 이용 가능한 기질 중 누구도 인간 종양 조직에서 유래 하지 않았습니다. 따라서 암 세포 침 습 과정8에 상당한 영향을 미치는 인간 종양 미세 환경의 특징이 결여 되어 있다.
묘 겔 (HMDM으로 지칭 되는 인간 근 종 유래 매트릭스)은 인간 자 궁 근 종 종양 조직9로부터 추출 된다. HMDM의 단백질 함량이 MSDM의 단백질과 크게 다르다는 것이 밝혀졌습니다. 사실, HMDM 단백질의 66%는 MSDM 단백질과 다릅니다. 한편, 라미 닌, IV 형 콜라겐, 헤 파란 설 페이트 proteoglycans, 니도 겐 및 표 피 성장 인자와 같은 일부 단백질은 모두 매트릭스10에 존재 한다. 추가적으로, 마우스는 효소 내용에서 인간과 다르지만, 인간으로는 생쥐11보다 78 더 적은 단백질 분해를 갖는다.
피 브린은 단독으로 또는 다른 물질과 결합 하 여 스 캐 폴드 재 (12)로 널리 사용 되 고 있다. 3 차원 세포 배양 분석에서, 상업적으로 입수 가능한 인간 피 브리 노 겐 및 트 롬 빈이 결합 하 여 피 브린 하이드로 겔 (12)을 형성 한다.
이 프로토콜은 이전에 도입 된 3 차원 종양 세 포스 페 로이드 침입 분석 법7의 개선을 설명 한다. 이 새로운 프로토콜은 마우스 유래 종양 매트릭스 대신에 인간 종양 유래 매트릭스를 적용 합니다. 그것은 또한 일 아 티 스크와 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미징 및 분석 기술을 포함 한다. 이 프로토콜은 여러 가지 고체 암 세포 주의 세 포스 페 로이드 분석에 사용 될 수 있습니다. 그것은 새로운 항 암 치료를 개발 하 고 암 세포 침략에 특정 분자의 효과 연구 하는 생물학적으로 관련 된 도구를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>암포테리신 B 용액</td><td>Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>소 폐의 아프로티닌</td><td>Merck</td><td>A6279</td><td>사용하기 전에 단백질 농도를 측정하십시오.</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Applichem</td><td>A1052</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 세포 배양 처리 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi2 디지털 카메라</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-U3 디지털 카메라 컨트롤러</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS100 도립 현미경</td><td>니콘 인스트루먼트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td> <td>Gibco by Life Technologies</td><td>10270106</td><td>Heat는 56 &deg에서 30분 동안 비활성화; C 사용하기 전에 수조에 담그십시오.</td></tr><tr><td>피브리노겐, 플라스미노겐 고갈, 인간 플라즈마</td><td>머크</td><td>341578</td><td>용해도 : H2O에서 25 mg / ml. H2O와 피브리 노겐을 37 °C로 가열합니다. C 해산 전. 피브리노겐이 완전히 용해될 때까지 방해하지 마십시오. -70 &deg에 저장된 재고 솔루션; C는 37°C로 유지되는 수조에서 해동해야 합니다.</td></tr><tr><td>피지 ImageJ 1.51 이미지 처리 프로그램</td><td>프리웨어, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Merck</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분류 및 세분화를 위한 Ilastik 소프트웨어</td><td>프리웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myogel</td><td>Lab 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Life Technologies의 페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>실험실에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 세포 계수기</td><td>Merck</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 세포 계수기 센서, 60 &마이크로; m</td><td></td><td></td> 인간 혈장에서 추출한 Merck PHCC60050 <td></td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>Merck</td><td>T6884-100UN</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, 페놀 레드</td><td>없음 Gibco by Life</td> Technologies <td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 96-Well Plate</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>UT-SCC-42A 및 UT-SCC-42-B 세포주</td><td></td><td></td><td>세포주는 투르쿠 대학 병원(핀란드 투르쿠)의 이비인후과-두경부 외과에서 확립되었습니다.</td></tr></tbody></table>

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

2 차원 세포 배양 기반 분석 법은 시험관 내 암 연구에서 흔히 사용 된다. 그러나, 그들은 종양 미세 환경을 형성 하는 몇 가지 기본 요소 부족. 보다 신뢰할 수 있는 시험관 내 결과를 얻기 위해, 몇몇 3 차원 (3d) 세포 배양 분석 법이 도입 되었다. 이러한 검정은 암 세포가 세포 외 기질과 상호작용할 수 있게 합니다. 이 상호 작용은 세포 형태학 뿐 아니라 증식 및 침략과 같은 세포 행동에 영향을 미칩니다. 추가적으로,이 상호 작용은 몇몇 프로 및 항 종양 분자의 발현을 유도 하거나 억제할 수 있었습니다. 스 페 로이드 침략 분석은 암 세포 침입을 연구 하기에 적합 한 3D 시험관 내 방법을 제공 하기 위해 개발 되었다. 현재 마우스 육 종 유래 매트릭스 (MSDM)와 쥐 꼬리 유형 I 콜라겐과 같은 동물 유래 매트릭스는 주로 스 페 로이드 침입 분석에 사용 됩니다. 인간 종양 미세 환경과 동물 유래 매트릭스의 차이를 고려 하 여, 인간 근 종 유래 매트릭스 (HMDM)는 양성 자 궁 평활 근 종 조직 으로부터 개발 되었다. HMDM은 MSDM 보다 더 나은 암 세포의 이주와 침략을 유도 하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 HMDM/피 브린 매트릭스를 사용 하는 단순 하 고 재현성이 높고 신뢰할 수 있는 3D 인간 종양 기반 세 포스 페 로이드 침입 분석 법을 제공 했습니다. 또한 이미징 및 분석에 대 한 자세한 지침이 포함 되어 있습니다. 구형 oid는 HMDM/피 브린 매트릭스 내 U 자형 초 저 부착 플레이트에서 성장 하 고이를 통해 침입 합니다. 침공 매일 이미지, 측정, 그리고 일 아 티 스크와 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 분석 플랫폼은 인간 후 두 일차 및 전이성 편평 세포 암 세포 주를 사용 하 여 입증 되었다. 그러나, 상기 프로토콜은 다른 고 형 암 세포 주에도 적합 하다.

4 일 후에 UT-SCC-42B (전이성 후 두 SCC 세포 주) 세포 시드, 매트릭스 (HMDM/피 브린, MSDM 또는 콜라겐)를 형성 된 스 페 로이드 (day 0)에 첨가 하 고 3 일 동안 침공을 모니터링 하였다. 여기에 이미지는 도립 현미경을 사용 하 여 매일 얻었다 (그림 4).
일단 포함 되 면, HMDM/피 브린 매트릭스의 세포는 하루 후 급속 하 게 침입 하 여 매트릭스로 확장 되기 시작 했습니다 (그림 4A). MSDM의 셀은 주변 매트릭스로 침입 하지 않고 대신 비대칭 구조를 형성 합니다 (그림 4B). 한편, 콜라겐의 세포는 약간 침범 하지만, 매트릭스 수축으로 인해 분석이 어려웠다 (도 4c). 일부 콜라겐 웰에서, 스 페 로이드는 3 일 후에도 사라졌다 (그림 4C).
도 5 는 1 차 후 두 SCC 세포 주 UT-Scc-42A 및 대응 하는 전이성 세포 라인 UT-Scc-42B의 hmdm/피 브린의 세포 침 윤의 정량화를 나타낸 것 이다. HMDM/피 브린 스 페 로이드의 라이브 셀 분석 시스템을 사용 하 여 촬영 한 비디오 (동영상 1)는 매트릭스 내에서 그 뒤에 다른 세포에 의해 가닥을 형성 하는 SCC 세포의 이동을 보여준다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2.jpg"> 그림 1 : 이미지 세분화. 이미지 분할의 선택 된 단계를 사용 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig2.jpg"> 그림 2 : 크기 조정 설정. 피지 ImageJ를 사용 하 여 확장 설정의 선택 된 단계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig3.jpg"> 그림 3 : ImageJ를 이용한 침략 분석. 피지 ImageJ를 사용 하 여 이미지 분석의 선택 된 단계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig4.jpg"> 그림 4 : UT-SCC-42B 세포가 세 가지 다른 매트릭스로 침입 합니다. 3 차원 구형에서의 SCC 세포 침입의 대표 이미지. 침략은 3 일 동안 따르고, 심상은 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 매일 촬영 되었습니다. (C) 콜라겐을 함유 하는것이다. 마지막 열은 3 일째 침공의 설명을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig5.jpg"> 그림 5 : HMDM/피 브린의 SCC 세포 침입 정량화. 일차 후 두 UT-SCC-42A 및 상응 하는 전이성 후 두 UT-SCC-42B SCC 세포 주 침입은 일 아 티 스크 및 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 되었다. 결과는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를, 각각 삼중으로 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59567/59567video1.jpg"> 비디오 1: 3 일 동안 HMDM/피 브린 내에서 SCC 세포 이동. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/Video_1.wmv" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 다운로드 합니다.)</a>

종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암의 진행을 모방 하기 위해 생물학적으로 관련 된 인간 매트릭스가 필요 합니다. 이 프로토콜은 인간 평활 근 종 기반 매트릭스를 적용 하 여 시험관 내 3 차원 세 포스 페 로이드 침입 검정에 대 한 개선을 도입 한다. 이 프로토콜은 또한 컴퓨터 기반 세포 침입 분석을 소개 합니다.

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

우리가 이미 알다시피, 종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암종 진행을 모방하기 위해 생물학적으로 관련된 인간 종양 매트릭스가 필요합니다. 이것은 체외 침입 분석체에 근거를 둔 유일한 인간 종양 매트릭스입니다.고전 스페로이드 분석법에 비해,이 방법은 온도에 민감한되지 않으며 스페로이드 전송이 필요하지 않습니다. 이 기술은 두경부 암과 같은 환자 유래 고형암 샘플에 적합하며 화학 요법을 포함한 개인화 된 약으로 확장 될 수 있습니다. 이 인간 종양 계열 매트릭스는 이미 고처리량 약물 검사, 라이브 세포 분석, 상처 치유 및 전달 분석 등을 포함한 여러 응용 분야에 사용되어 왔다.가장 기술적으로 민감한 단계는 피브리노겐의 방법의 처리가 추가되므로 먼저 빈 우물로이 단계를 연습할 수 있습니다. 매트릭스의 적절한 처리를 표시하는 것이 중요하며 방법을 시각적으로 보여 줌으로써 분석하기 쉽습니다. 다세포 종양 스페로이드 생성의 경우, 96웰 초저 부착 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 완전한 배지의 50 마이크로리터에 관심 있는 세포주에서 제3 세포로부터 10번 을 분배한다.그런 다음 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에 넣고 4일 동안 정시적으로 반전된 현미경으로 종양 스페로이드 형성을 확인합니다. 3차원 스페로이드 침입 분석법을 설정하려면 인간의 무종 유래 매트릭스를 얼음에 해동하고 피브리노겐 스톡 용액을 섭씨 37도의 수조에 해동하십시오. 시약이 따뜻해지면, 완전한 배지, 인간 근종 유래 매트릭스, 트롬빈, 아프로틴 및 피브리노겐의 적절한 양을 혼합하고, 세포에 매트릭스 혼합물을 분배하기 직전에 피브리노겐을 첨가한다.즉시 생성 된 젤의 50 마이크로 리터를 스페로이드 배양 플레이트의 각 우물에 추가하여 각 우물의 내부 벽을 향해 팁을 지시하고 우물의 중심에서 스페로이드를 움직이지 않고 감속합니다. 피브리노겐은 몇 분 후에 젤을 시작하기 때문에 견고하지만 정확한 역 파이프팅과 한 번에 몇 개의 우물만 처리해야합니다. 각 겔의 상단에 완전한 배지 100 마이크로리터를 부드럽게 추가하기 전에 인간 근종 유래 매트릭스 피브린 젤이 고화되도록 30 분 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.그런 다음 매일 스페로이드 침공을 이미지합니다. ilastik로 이미지 세분화의 경우 오픈 소스 이미지 분류 및 세분화 소프트웨어를 열고 픽셀 분류 워크플로를 선택합니다. ilast식 프로젝트를 컴퓨터에 저장합니다.픽셀은 사용자가 주석을 기반으로 분류됩니다. 입력 데이터를 클릭하고 새로 추가하여 분석을 위한 이미지를 선택합니다. 기능 선택을 위해 기능 선택을 클릭하고 피처를 선택합니다.관심 있는 기능을 선택하려면 적절한 상자를 클릭합니다. 선택한 상자가 녹색으로 바뀝니다. 교육을 보려면 교육을 클릭합니다.교육 섹션에는 레이블 1과 레이블 2라는 두 개의 레이블이 있어야 합니다. 레이블 중 하나로 배경을 표시하고 다른 레이블로 셀을 표시합니다. 첫 번째 이미지 내의 모든 셀과 배경에 레이블이 지정된 경우 현재 보기에서 다음 이미지를 선택하여 이미지의 10%가 표시될 때까지 셀과 배경을 계속 표시합니다.그런 다음 라이브 업데이트를 선택하여 모든 이미지를 분석합니다. 교육이 완료되고 ilastik이 모든 이미지를 분석한 경우 예측 내보내기를 클릭하고 소스에서 간단한 세분화를 선택합니다. 그런 다음 이미지 설정 내보내기에서 원하는 출력 파일 형식을 선택하고 모두 내보내기를 클릭하여 레이블 결과를 내보냅니다.파일은 원본 이미지와 동일한 폴더로 내보내집니다. 영역 분석을 위해 먼저 피지 ImageJ의 스케일 막대로 원본 이미지를 열어 분석된 이미지와 동일한 크기와 치수를 가지고 있음을 주의하십시오. 선 선택 도구를 사용하여 알려진 길이의 선을 그리고 분석 및 설정 배율의 선을 클릭합니다.그런 다음 알려진 거리 필드에서 알려진 거리를 설정합니다. 적절한 단위를 설정하고 전역을 클릭합니다. ilastik 플러그인을 설치하려면 도움말 및 업데이트를 클릭하고 ImageJ 업데이트 창에서 업데이트 사이트 관리를 클릭합니다.ilastik 옆을 클릭, 닫기, 변경 사항을 적용합니다. 몇 분 후에 정보 창이 성공적으로 업데이트된 것으로 표시됩니다. 확인을 클릭하고 ImageJ를 다시 시작합니다.다음으로 플러그인, 매크로를 클릭하고 카운터를 선택합니다. ijm 파일. 그런 다음 열기를 클릭합니다.지역 분석을 완료하려면 플러그인을 클릭하고 스크롤하여 ilastik을 선택합니다. HDF5 가져오기를 선택하고 h5 형식으로 파일을 선택합니다. 열기 및 로드를 클릭하고 조회 테이블을 적용합니다.그런 다음 키보드의 A 버튼을 클릭하면 영역이 요약 창에 전체 영역으로 표시됩니다. 본 대표적인 실험에서, 전이성 후두 편평세포세포주 종자 후 4일 후, 매트릭스를 형성된 스페로이드에 첨가하고 반전된 현미경으로 매일 모니터링하였다. 일단 내장되면, 인간 근종 유래 피브린 매트릭스에 있는 세포는 1 일 후에 급속하게 침략하기 시작하고 다음 이틀 동안 매트릭스로 확장하기 시작했습니다.마우스 육종 유래 매트릭스내의 세포는 주변 행렬로 침입하지 않고 비대칭 구조를 형성하였다. 콜라겐내의 세포는 약간 침략했지만 매트릭스 수축으로 인해 분석이 어려워졌습니다. 일부 우물에서는 3일 후에도 스페로이드가 사라졌습니다.여기서, 인간 근종 유래 피브린 매트릭스에서 1차 및 전이성 후두 편평세포 암종의 침전을 정량화하는 것이 나타난다. 인간 근종 유래 피브린 매트릭스 스페로이드 침략의 살아있는 세포 분석은 시간이 지남에 따라 다른 세포에 선행되는 매트릭스 전체에 걸쳐 가닥에서 세포 움직임을 드러낸다. 매트릭스를 우물에 추가할 때 스페로이드를 중앙 위치에서 이동하지 않도록 주의해야 합니다.이 절차는 암 약과 같은 특정 분자가 침략에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 세포는 후속 연구를 위해 고정되고 얼룩질 수 있습니다. 고전적인 마우스 육종 모델에서, 세포는 주로 증식하고 침략 측면은 최소화된다.이 인간 종양 계의 매트릭스는 침략을 유도하여 억제 연구를 보다 효율적으로 만듭니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

이 비디오는 종양 세포 침입을 연구하기 위해 네이티브 매트릭스를 활용하는 기술을 설명합니다. 이 분석에 사용된 기술은 합성 또는 외부 매트릭스 없이 3D 환경에서 상피-중간엽 세포 상호 작용을 평가할 수 있는 기능을 제공합니다.

종양 세포 침입 분석: 상피-중간엽 세포 상호 작용을 평가하기 위한 3D 체외 네이티브 매트릭스 기반 방법

출처: Guyon, J., et al. 교모세포종에 대한 3D 스페로이드 모델. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 종양 세포 침입의 3차원 스페로이드 모델의 생성을 보여줍니다. 스페로이드는 인간의 뇌종양 세포에서 형성되며 콜라겐 매트릭스에 내장되어 있습니다. 스페로이드 말초의 종양 세포는 침습적 표현형을 채택하여 프로테아제를 분비하여 콜라겐을 분해하고 전진하여 주변 기질을 침범합니다.

종양세포 침입의 3차원 스페로이드 모델 생성

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

학습하세요 인간 근종 유래 매트릭스를 활용한 3차원 스페로이드 침입 분석법으로 암 미세환경에서 종양 세포 침입을 연구하는 방법을. 이 기법은 환자 유래 고형암 샘플에 적용 가능하며 고처리량 약물 테스트와 실시간 세포 분석을 지원합니다.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

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