Name: 음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: 배우세요 음향 나노 디스펜싱 기술을 활용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 포유류 세포 트랜스펙션 방법을. 나노 볼륨의 시약으로 비용을 절감하며 384개 조건을 동시에 테스트할 수 있는 사용자 친화적인 프로토콜입니다.

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저자는 이 문서의 연구, 저자 및/또는 출판에 대한 다음과 같은 재정적 지원의 영수증을 공개했다: Inserm, 릴 대학, 릴 파스퇴르 연구소, Conseil 레지오날 뒤 노르, PRIM-HCV1 과 2 (폴 드 레체 Interdisciplinaire sur le Médicament), 에이전시 내셔널 드 라 레체 (ANR-10-EQPX-04-01), 페더 (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) 및 유럽 공동체 (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). 저자는 원고의 비판적 검토와 수정에 대해 S. Moureu 박사, B. Villemagne 박사, R. 페루 클레멘트 박사, H. Groult 박사에게 감사를 표하고자 합니다.

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저자는 공개 할 것이 없다.

주어진 세포주에 대한 정확한 고처리량 형벌 방법의 확립 및 최적화는 과학자들이 이 섹션에서 설명하는 몇 가지 주요 매개 변수를 따라야 합니다. HeLa 세포에 최적화된 이러한 설정도 HEK 세포에 대해 효율적이라는 것이 입증됨에 따라 프로토콜 전반에 걸쳐 권장값으로 시작하는 것이 좋습니다. 그러나, 최상의 파라미터는 세포주 및 형질감염 시약에 의존할 수 있기 때문에, 최적의 조건은 세포 수, 희석제 부피, 총 DNA 양 및 형질전환 시약 성질, 농도 또는 짝수 부피를 변화시킴으로써 정의될 수 있다. HeLa 셀에 대한 이 프로토콜의 최적화 중에 사례1.
여기에 제시된 전반적인 프로토콜은 현장에서 초보자도 세포 형질 감염이 허용되도록 개발되고 더욱 최적화되었습니다. 이 목표를 달성하기 위해 프로토콜을 가능한 한 간단하게 렌더링하고 사람의 실수를 피할 수있는 주요 도구가 개발되었습니다 : 실험을 쉽게 디자인할 수있는 사용자 친화적 인 스프레...

여기에 제시된 방법은 384웰 플레이트에서 음향 기반 액체 나노디스터를 사용하여 높은 처리량에서 포유류 세포에서 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션을 수행하는 방법을 자세히 설명하며, 심지어 현장의 비전문가를 위한 것입니다. 이 최근 발표된 방법 1은 한 실험에서 384개의 독립적인 플라스미드 DNA 다중화 및 형질전환 조건을 1시간 미만으로 수행할 수 있게 해주며, 단일 또는 배전 실험이 성공하여 거의 100%에 이르렀습니다. 형질 감염된 세포 집단 내의 환전. 이 프로토콜은 지루하고 시간이 많이 소요되며 오류가 발생하기 쉬운 대부분의 단계가 이제 소프트웨어 기반이기 때문에 더 쉽게 변환할 수 있습니다(일반적인 개요의 경우 그림 1 참조). 또한 전체 프로세스 중에 사람의 실수를 피하면서 사용 편의성을 높이고 현장의 비전문가에게도 성공적인 트랜스펙션을 촉진하기 위한 전용 도구를 개발하기 위해 더욱 노력했습니다. 설명된 프로토콜에는 384개의 독립적인 형질감염 조건을 관리하기 위해 개발한 "사용자 친화적인" 매크로 스프레드시트가 포함되어 있으며, 각 우물에서 최대 4개의 플라스미드의 다중화 가능성이 있습니다. 매크로는 소스 플레이트의 템플릿을 자동으로 생성하여 시작 스톡 솔루션에서 예상되는 DNA 플라스미드 볼륨을 로드하고 입력된 실험 설계에 나노 스테스터 소프트웨어를 구동하는 데 필요한 파일을 생성합니다. 384웰 소스 플레이트에서 DNA의 수동 분배는 지루하고 오류가 발생하기 쉽기 때문에 템플릿에 따라 DNA 솔루션을 분배하는 동안 사용자를 안내하는 전용 태블릿 기반 응용 프로그램을 개발했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> 그림 1: 실험 워크플로우. 최적의 자동화 된 고처리량 역형 변환 프로토콜 (실험 설계에서 맞춤형 생물학적 분석)의 회로도 표현. 수동 단계는 손 기호로 표시되고 각 단계의 대략적인 시간은 빨간색 상자에 기록됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
많은 세포 기반 실험은 플라스미드 DNA 형혈로 시작하며, 많은 전용 시약이 형질 감염 효율을 향상시키고 절차를 용이하게하기 위해 여전히 개발되고 있더라도많은것이 2,3을 수행해야합니다. , 4.DNA 플라스미드 세포 형질감염은 초기 복합적인 흡기, 내인성 탈출, 및 핵으로의 세포질 수송과 같은 고효율에 도달하기 위한 여러 단계를 수반한다 5,6. 칼슘 침전 또는 전용 장치를 사용하여 전기 천공 또는 미세주입과 같은 물리적 기술 이외에 7, 현대 화학 적 방법은 세포 독성을 낮추면서 DNA 세포 전달을 향상시키는 데 중점을 두어8, 9. 지질 또는 양이온 폴리머를 사용하여 리포솜과 같은 복합체를 형성하고, 최근에는 비리포솜 중합체 화학 시스템을 사용하여 형질전환을 쉽고 효율적으로10. 이러한 발달에도 불구하고, 세포 형질감염은 여전히 이러한 물리적 또는 화학적 형질감염 프로토콜의 대부분이 과학자들이 각 DNA 형질감염 반응 상태를 수동으로 준비하도록 요구하기 때문에 정확하게 수행되어야 하는 특정 기술을 필요로 합니다. 처리량을 손상시게 할 수 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해, 역형질 감염 프로토콜은 화학형질 감염 시약11,12,13을사용하여 개발되어 사용자가 더 빠른 방법으로 여러 플라스미드를 테스트하거나 결합할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서, 형질감염 시약을 가진 핵산 복합체는 복합체에 세포를 파종하기 전에 형성된다. 그러나, 이러한 역프로토콜은 DNA 솔루션의 수동 처리및 각각의 독립적인 조건의 조합에 의해 여전히 제한된다. 96 웰 플레이트 형식으로 수행하는 것이 가능하지만 DNA 준비 및 분배는 지루할 것이며 실수가 있을 것입니다. 여러 DNA 플라스미드의 다른 양이 필요하고 서로 다중화 될 때, 세포 형질전환은 달성하기 가 더욱 어려워지고 더 많은 시간이 소요되고, 인간의 오류는 매우 피할 수없게된다. 역형질 접근법에서 384 웰 플레이트 포맷까지 스케일링하면 다중화 된 DNA 형질 감염 조건에도 불구하고 다음과 같은 이유로 인해 불가능한 도전이됩니다. i) 관리해야 할 DNA 양, 형질감염 시약 또는 반응 혼합물 부피는 각각의 웰에 대해 1 μL 보다 낮다. ii) 384 개의 독립적 인 조건에 대한 플라스 미드의 멀티플렉싱은 매우 복잡해집니다. 각각의 384웰의 전달은 또한 iii) 매우 시간이 많이 소요되고 iv) 오류가 발생하기 쉽다. 실제로, 이미 분배된 낮은 볼륨은 빈 우물과 이미 채워진 웰 사이의 시각적 모니터링을 허용하지 않기 때문에 예상 웰에서 올바른 솔루션을 분배하는 것은 관리하기 가 어렵습니다. v) 마지막으로, 필요한 디스펜싱 단계를 수행하는 데 필요한 시간으로 인해 세포가 첨가되기 전에 증발에 의해 혼합물을 건조할 위험이 높다. 요약하면, 고처리량 DNA 플라스미드 형질감염 분석제를 설정하는 제한 요인은 더 이상 수동으로 처리할 수 없는 저용량 멀티플렉싱 및 관리를 의미하는 분석의 소형화로 보이지만, 고전적인 주압 액체 처리기에 의해 신뢰할 수있는 방법.
이러한 분석을 자동화하고 높은 처리량을 얻는 데 어려움을 입증하기 위해, 형혈을 자동화하는 몇 가지 시도만이 지금까지 발표되었습니다 : 상업용 액체 처리 장치 및 칼슘 인산염 침전물을 사용하는 96 웰 플레이트 형식14 그리고, 최근에는 리포플렉스 시약, 및 280개의 독립적인 형질전환15를 가능하게 하는 미세유체 칩이지만 이 분야에서 는 전문기술이 요구되고 있다. 또 다른 방법, acoustophoresis, 액체 부양을 허용하고 유체 조작 및 혼합으로 이어지는, 24- 96 웰 플레이트 포맷16에서DNA 형질 변환을 수행하는 데 사용되었다. 가능하지만, 이 접근법은 DNA 형질전환 혼합물과 세포의 혼합이 파종되기 전에 모든 단일 지점에 대해 60 초의 배양을 필요로 하기 때문에 매우 낮은 처리량을 겪습니다. 이것은 완전한 96 웰 플레이트에 대해 적어도 96 분의 지속 시간을 의미합니다. 또한,이 프로토콜은 이 작업이 현재 시장에서 사용할 수없는 사내 설계 및 제조 장치로 수행되었기 때문에 전체 생물학자의 청중에게 허용되지 않습니다. 반대로, 지난 몇 년 동안, 사용하기 쉬운 소프트웨어 기반 음향 기반 디스펜싱 기술은 나노 볼륨 디스펜서 장치와 함께 등장했다. 집중된 음향 에너지를 사용하여 이러한 장치는 소스 플레이트에서 목적지17까지2.5 nL ~ 500 nL의 작은 액체 볼륨을 엄격하게 제어할 수 있습니다. 음향 액적 배출 (ADE)이라고 불리는이 기술은 많은 장점을 가지고 있습니다 : 그것은 완전히 자동화되고, 비접촉식, 팁리스, 정확하고, 매우 재현 가능하며, 높은 처리량18을가지고 있습니다. 먼저 디메틸 설폭사이드(DMSO) 솔루션을 제공하는 데 전념하여 수성버퍼(19)를분배하도록 설정이 향상되었습니다. 그런 다음 음향 나노 에스터는 역세포 형질 감염 프로토콜에 적합한 것처럼 보이며 위에서 언급 한 대부분의 수동 제한 사항을 우회 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 플라스미드 형질 전환 시도가 이전에 설명되지 않았던 것처럼, 우리는 최근에 역세포 형질변환을 수행하기 위한 음향 기반 디스펜싱 시스템의 적합성을 평가했습니다.
나노 에스터디스터 처리량과 사용 편의성을 활용하여 384 웰, 단일 플레이트, 즉 총 DNA 양에 대한 DNA 형질감염에 영향을 줄 수 있는 여러 매개 변수를 교차 테스트하여 HeLa 세포에 대한 역형질 감염 프로토콜을 최적화하고 소스 DNA 시작 농도, 희석제 볼륨, 형질 전환 시약, 및 확산 세포의 수. 개발된 프로토콜은 전술한 세포 형질감염의 수동 한계를 우회하고 다른 자동화된 형질감염 시도에 비해 몇 가지 이점을 제시한다. 첫째, 그것은 소형화되어 DNA 플라스미드 제제 및 형질감염 시약을 저장하여 비용 효율적인 형질 감염 시약을 허용합니다. 둘째, 전체 384 웰 플레이트의 트랜스펙션이 1시간 미만으로 달성될 수 있기 때문에 수동 프로토콜(초보자도 마찬가지)보다 훨씬 높은 처리량과 재현력이 있습니다. 마지막으로, 그것은 소프트웨어 구동, 디스펜싱 된 DNA 양의 제어 및 여러 플라스미드의 멀티플렉싱을 허용. 실제로, 나노에스터 소프트웨어(TableofMaterials)를 통해 사용자는 정의된 소스 웰 플레이트로부터 대상플레이트로 분배되는 부피를 제어하는 연구 계획을 정교하게 할 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜은 주로 나노 에이체에 액세스 할 수 있고 높은 처리량에서 형질 감염 실험을 설정하고자하는 사람들을 위한 것입니다, 뿐만 아니라 신속하게 주어진 세포 유형에 대한 자신의 형질 감염 매개 변수를 최적화하고자하는 사람들을 위해 처리량이 높은 여러 매개 변수를 교차 테스트하기 위해 이 프로토콜을 적용합니다. 실제로, 우리는 이 나노 스케일 프로토콜로 확인된 최적화된 파라미터가 더 큰 규모와 수동 형질전환 실험으로 전치될 수 있음을 보여주었습니다. 마지막으로, 본 프로토콜에 사용되는 형질감염 시약은 제조사에 따라 DNA 또는 siRNA 형질변환을 허용함에 따라, 프로토콜은 유전자 과발현 또는 녹다운에 대한 어레이 접근법을 수행하는 것을 목표로 하는 사람들에게도 관심이 있다. DNA로 미리 채워진 대상 플레이트는 효능의 손실 없이 형질전환 분석에서 사용하기 7일까지 보존될 수 있으며, 이는 이러한 종류의 적용에 대한 다음 프로토콜의 또 다른 장점이다.

<table><tbody><tr><td>384LDV 마이크로플레이트</td><td>랩사이트</td><td>LP-0200</td><td></td></tr><tr><td>384-웰 마이크로플레이트 &mu; 클리어 블랙</td><td>Greiner</td><td>781906</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td>선택 암피실린 발현 벡터로 변형 된 박테리아에 대한 항생제</td></tr><tr><td>안드로이드 태블릿</td><td>삼성</td><td>갤럭시 노트 8</td><td>소스 플레이트 수동 분배</td></tr><tr><td>Aniospray Surf 29</td><td>Anios</td><td>2421073</td><td>소독제 MicroFlo 헤드</td></tr><tr><td>콜럼버스 청소 소프트웨어</td>, <td>Perkin Elmer</td><td></td>, <td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>, 10566032</td>세포 <td>배양 배지</td></tr>, <tr><td>Echo Cherry Pick 1.5.3 소프트웨어</td>, <td>Labcyte</td><td></td>, <td>*.csv 파일로부터 Echo550 장치에 의한 ADE 기반 디스펜싱을 가능하게 하는 소프트웨어, 나노 디스펜서 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>Echo550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>ADE 기반 디스펜서</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>세포 배양 배지</td></tr>에 <tr><td>포르말린 용액, 중성 완충액, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>을 추가하여 세포</td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>HeLa(ATCC&reg; CCL-2&무역;)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>10 mg/mL 용액</td></tr><tr><td>INCell 분석기 6000</td><td>GE Healthcare</td><td>29043323</td><td>자동 레이저 기반 컨포칼 이미징 플랫폼</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&reg;, 박테리아</td><td></td><td>성장을</td></tr> <tr><td>위한 분말 12780052 배양 배지용해 완충액 (A2)&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740912.1</td> 박테리아 배양 MicroFlo 10&micro<td>에서 플라스미드를 준비하는 데 사용되는 NucleoSpin Plasmid 키트의 버퍼</td></tr><tr><td>; L 카세트</td><td>Biotek Instruments Inc</td><td>7170013</td><td>Microflo 디스펜서</td></tr><tr><td>MicroFlo 1&mu와 함께 사용하기 위해; L 카세트</td><td>Biotek Instruments Inc</td><td>7170012</td><td>Microflo 디스펜서와 함께 사용</td></tr><tr><td>MicroFlo 디스펜서</td><td>Biotek Instruments Inc</td><td>7171000</td><td>연동 펌프 기반 액체 처리기 장치</td></tr><tr><td>Microvolume 분광 광도계</td><td>Denovix</td><td>DS-11 분광 광도계</td><td>샘플의 DNA 농도</td></tr><tr><td>측정 mVenus 플라스미드</td><td>mVenus cDNA는 tdTomato-N1 플라스미드의 Age1/BsrG1 부위에서 효소 제한 분해 및 결찰에 의해 클로닝되었습니다</td><td>. 벡터 유형: 포유류 발현, 융합 단백질: mVenus</td>Neutralization Buffer (A3)&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel</td><td>740913.1</td><td>박테리아 배양에서 플라스미드를 제조하는 데 사용되는 NucleoSpin Plasmid 키트의 버퍼</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>박테리아 배양에서 플라스미드를 제조하는 데 사용</td></tr><tr><td>Optimal-Modified Eagle Medium (Optimal-MEM) Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>옵션 세척 버퍼세척 버퍼 (A4)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740914.1</td><td>NucleoSpin Plasmid 키트의 버퍼는 세균 배양</td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td>에서 플라스미드를 준비하는 데 사용됩니다.<td>배양 대용량 쉐이커</td><td>444-7084</td><td>부드러운 교반 및 37°C에서 박테리아를 성장시키는 데 사용됩니다. C</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>15140122 10,000 U/mL</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mini-columns</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740499.250</td><td>Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial</td></tr><tr><td>culture Resuspension buffer (A1)&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740911.1</td><td>NucleoSpin Plasmid 키트에서 사용한 버퍼 세균 배양</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740505</td><td>Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td></tr><tr><td>tdTomato-N1 plasmid</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54642</td><td>Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&nbsp;</td></tr><tr><td>TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 6000</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (AW)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740916.1</td><td>NucleoSpin Plasmid 키트의 버퍼 세균 배양</td></tr><tr><td>3D 프린터</td><td>Creality</td><td>CR10S</td>에서 플라스미드<td>를 준비하는 데 사용 플레이트 어댑터 인쇄에 사용</td></tr><tr><td>블렌더 소프트웨어&nbsp;</td><td>&nbsp; https://www.blender.org/ GNU General Public License(GPL)에 따른 무료 소프트웨어.</td><td>플레이트 어댑터를 설계하는 데 사용되는</td> <td>버전 2.79b</td></tr></tbody></table>

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 dna 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

많은 생물학적 연구에 필수적인 세포 형질감염은 정확하고 성공적인 성취를 위해 많은 매개 변수를 제어해야 합니다. 대부분의 경우 낮은 처리량에서 수행, 그것은 또한 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운, 더 많은 그래서 여러 플라스미드를 다중화 할 때. 우리는 음향 액적 배출 (ADE) 기술을 사용하여 384 웰 플레이트 레이아웃에서 세포 변환을 수행하는 쉽고 빠르며 정확한 방법을 개발했습니다. 본 연구에 사용되는 나노 디스펜서 장치는 이 기술을 기반으로 하며 소스 웰 플레이트에서 대상 플레이트까지 고속으로 정밀한 나노부피 전달을 허용합니다. 미리 디자인된 스프레드시트에 따라 DNA 및 트랜스펙트 시약을 분배하고 분배할 수 있습니다. 여기에서 우리는 최대 90%의 효율과 cotransfection 실험에서 거의 100%의 연전율에 도달할 수 있게 하는 ADE 기반고처리량 플라스미드 형혈을 수행하기 위한 최적의 프로토콜을 제시합니다. 사용자 친화적인 스프레드시트 기반 매크로를 제안하여 최대 1,536개의 플라스미드를 포함하는 라이브러리에서 최대 4개의 플라스미드/웰을 관리할 수 있으며 태블릿 기반 파이펫팅 가이드 응용 프로그램을 제안하여 초기 작업을 확장합니다. 매크로는 소스 플레이트의 필요한 템플릿을 설계하고 나노 디스펜서 및 태블릿 기반 응용 프로그램에 대한 즉시 사용 파일을 생성합니다. 4단계 형질전환 프로토콜은 i) 고전적인 액체 처리기를 가진 희석제 디스펜스, ii) 플라스미드 분포 및 멀티플렉싱, iii) 나노디스펜서에 의한 트랜스펙션 시약 디스펜스, 및 iv) 미리 채워진 웰상에서의 세포 도금과 관련이 있다. ADE 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션의 기술된 소프트웨어 기반 제어를 통해 현장의 비전문가조차도 빠르고 안전한 방법으로 신뢰할 수 있는 세포 형질변환을 수행할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 지정된 셀 유형에 대한 최적의 설정을 신속하게 식별할 수 있으며 더 높은 규모및 수동 접근법으로 전환할 수 있습니다. 이 프로토콜은 비풀스닝 전략에서 인간 ORFeome 단백질(게놈에서 열린 판독 프레임 [ORFs] 세트) 발현 또는 CRISPR-Cas9 기반 유전자 기능 유효성 검사와 같은 응용을 용이하게 합니다.

fADE 기술이 자동 역형질 감염 프로토콜에 사용될 수 있는지 확인하기 위해 적색 형광 tdTomato 발현 플라스미드를 사용하여 형광 현미경으로 세포 형질 전환 효율을 모니터링했습니다. 먼저 최고의 형질 감염 파라미터를 결정하는 것을 목표로, 다른 희석제 부피 및 DNA의 총 양은 교차 시험되었다. 희석제 부피는 DNA 방울이 일단 분배되면, 예비 실험에서 관찰된 불균일성 형란을 회피하기 위해 우물 전체에 퍼지도록 하는 데 사용되었다(즉, 우물의 중앙에만). 도 6A에도시된 바와 같이, 리포폴리플렉스 시약(20)을 이용한 헬라 세포의 형질전환이 성공적이었다. 흥미롭게도, 1 μL 희석제 부피를 사용하여, 5~30 ng에 이르는 DNA 양은 50 및 100 ng와 같은 더 높은 양에 비해 동일한 효율 및 최대 90%의 세포 형질변환을 보였으며, 이는 갑작스러운 감소가 관찰되었...

이 프로토콜은 음향 액적 배출 기술을 사용하여 384 웰 플레이트에서 포유류 세포의 고처리량 플라스미드 형질 감염을 설명합니다. 시간이 많이 소요되고 오류가 발생하기 쉬운 DNA 디스펜싱과 트랜스펙션 시약 디스펜싱은 나노 에스터디터 장치에 의해 소프트웨어 구동 및 수행됩니다. 세포는 다음 이 미리 채워진 우물에서 파종됩니다.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

이 비디오에서 설명하기 위해 개발된 Nano 없어서스터 기반 의정서는 현장에서 초보자도 성공할 수 있도록 하는 최초의 사용자 친화적이고 높은 처리량 트랜스페션 방법을 나타냅니다. 이것은 384 개의 독립적 인 조건으로 셀의 전이를 전환 할 수있는 높은 처리량 기법에 쉽습니다. 현재, 이 방법은 필요한 시약의 나노 부피로 인해 비용이 낮다.모든 세포 유형에 대한 최상의 경질 파라미터를 정의하기 위해 소스 DNA 농도를 일정하게 유지하고 다양한 양의 전이 DNA, 트랜스페션 시약 및 세포 수를 사용하는 것이 좋습니다. 40 마이크로리터 셀 서스펜션을 분배하기 위해 연동 액체 처리기 장치에 10 마이크로리터 카세트를 장착하고 적절한 프로그램을 준비합니다. 첫째, 유량 파라미터를 낮은 속도로 조정하여 낮은 속도로 세포를 분배하여 순수한 응력과 우물 바닥에 높은 충격으로 세포에 대한 잠재적 손상을 촉진하지 않도록 한다.그런 다음 경륜경 높이를 11.43밀리미터로 조정합니다. 신장은 분배 과정에서 우물 바닥에 세포 충격을 낮출 만큼 충분히 높어야하지만, 디스펜싱 헤드에 액적의 보존을 피하기에 충분히 낮습니다. 다음으로, 플레이트 클리어 높이를 16mm로 조정하여 각 행을 분배한 후 디스펜싱 헤드의 자유로운 변위를 플레이트 위로 자유롭게 변위를 할 수 있도록 합니다.연동 액체 처리기 헤드 높이의 적절한 설정을 시각적으로 제어합니다. 디스펜싱 하는 동안 디스펜싱 팁에 드롭이 유지되지 않았는지 확인하십시오. 또한 각 행을 분배한 후 헤드의 변위를 허용할 만큼 머리가 충분히 높은지 확인합니다.ADE 경륜을 구동하기 위해 선택 목록을 생성하기 위해 사용자 친화적 인 스프레드 시트 매크로가 개발되어 DNA 양을 관리하고 384 개의 웰 플레이트 형식으로 최대 4 개의 플라스미드를 혼합했습니다. 최적의 볼륨은 스프레드시트의 일부 셀에서 미리 채워지지만 변경할 수 있습니다. 분홍색 분야에서, 경질 시약, 또는 TR 혼합물 값은 500 나노리터로 설정된다.소스 플레이트 웰의 최소 부피 값은 4개의 마이크로리터로 설정되며 소스 플레이트의 최대 부피는 11.25 마이크로리터로 잘 설정됩니다. 기본 DNA에 대응하는 파란색 필드에 있는 마이크로리터 DNA 시작 농도당 100 나노그램을 입력합니다. 이어서, 플레이트의 384웰에 대응하는 회색 및 녹색 필드에 원하는 DNA 양을 입력한다.양과 플라스미드 이름을 입력하고 동일한 플라스미드가 여러 우물에서 전염되어야 하는 경우 동일한 철자가 사용되는지 확인합니다. 입력된 값을 확인하기 위해 선택 목록을 생성하려면 클릭하고 요청하면 Nano 없어서더러가 처리할 수 없는 오류 또는 볼륨을 나타내는 주황색 으로 채워진 셀을 수정합니다. 아무 것도 감지되지 않으면 매크로는 해당 시트에 수집된 데이터에서 384 웰 디스펜싱 가이드, DNA 선택 목록 파일 및 TR 픽리스트 파일을 생성합니다.소스 플레이트 시트에서 템플릿을 인쇄하여 분배하기 전에 채워질 우물을 시각화합니다. 플라스미드 이름과 최소 채우기 볼륨이 표시됩니다. 다음 우물에서 채워질 경질 시약 혼합물 부피는 TR으로 표시되고 녹색으로 강조 표시됩니다.DNA 소스 플레이트를 준비하려면 증류수를 사용하여 마이크로리터 당 저장된 DNA 플라스미드를 100 나노그램으로 희석합니다. 이제 384 웰 그리드를 플레이트 치수로 보정합니다. 태블릿에서 384 웰 파이펫팅 가이드 응용 프로그램을 엽니다.소스 위치를 아래쪽 화면의 그리드에 배치합니다. 왼쪽 상단 교정 메뉴에서 플러스 또는 마이너스를 클릭하여 그리드와 우물의 크기를 향상하거나 줄여 녹색 우물을 플레이트의 4개의 모서리 우물로 조정합니다. 양면 테이프를 사용하여 디스펜싱 하는 동안 소스 플레이트 움직임을 피하기 위해 화면에 3D 인쇄 플레이트 어댑터를 장착합니다.필요한 경우 회전 화살표를 사용하여 보정된 그리드를 위, 아래, 오른쪽, 왼쪽 버튼을 이동하여 그리드를 플레이트 위치로 조정합니다. 그리드와 웰 사이즈가 제대로 보정되고 위치하면 잠금 보정 상자를 선택합니다. 파일을 클릭하고 384-웰스-파이펫팅 가이드를 엽니다.csv 파일입니다. 화면 지침을 따라 지정된 농도에서 플라스미드의 표시된 볼륨을 예상 플레이트의 적절한 대상에 해당하는 흰색 강조 표시 우물에 수동으로 분배합니다. DNA 분배 과정에서 마이너스 또는 플러스 화살표를 사용하여 돌아가거나 더 멀리 이동하십시오.로드할 첫 번째 경질 시약 솔루션에 도달하면 디스펜싱을 중지합니다. DNA 경륜의 시대가 끝나면 어댑터에서 소스 플레이트를 제거합니다. 여러 소스 플레이트를 채우려면 어댑터에 새 소스 플레이트를 배치하고 디스펜싱 지침을 따릅니다.DNA 채워진 소스 플레이트를 원심분리하여 적절한 액체 수평을 보장하고 ADE 베이스 전송의 부정확성으로 이어지는 거품을 제거합니다. 이제 설문조사를 실행하여 수동으로 분배된 볼륨을 제어합니다. 나노 디스펜더 PC에서 나노 디스펜더 프로그램을 실행합니다.진단 탭으로 이동, 소스 플레이트 아웃박스를 체크, 플레이트 홀더에 소스 플레이트를로드하고 접시를 입력에 진드기. 메시지가 표시되면 384LDV_AQ_B2 선택하여 Nano Dispenser를 수성 버퍼 디스펜싱 모드로 설정하고 확인을 누릅니다. 기타 메뉴에서 설문조사를 선택합니다. 그리고 출시를 클릭합니다.미리 채워진 우물을 선택하여 이동 버튼을 분석하고 클릭합니다. 측정된 볼륨이 예상 볼륨과 일치하는지 확인하고 12개 이상의 마이크로리터의 부피가 적재되지 않았는지 확인합니다. 사전 데워진 세럼 프리 배지10밀리리터로 새로운 멸균 용기와 튜브 를 장착하여 튜브를 프리 배지로 준비하십시오.연동 액체 처리기의 주요 버튼을 약 10초 간 누릅니다. 디스펜싱 헤드의 흐름을 시각적으로 검사하여 팁이 막히지 않았는지 확인합니다. 연동 액체 처리기 플레이트 캐리어에 멸균 384 웰 배양 플레이트를 놓고 뚜껑을 제거합니다.미리 보정된 프로그램을 실행하여 384 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 마이크로리터를 분배합니다. 분배 시간은 약 8초입니다. 그런 다음 384 웰 플레이트의 뚜껑을 교체하십시오.ADE 구동 DNA 디스펜싱을 설정하려면 선택 목록 소프트웨어를 실행합니다. 384LDV로 공급되는 384개의 우물을 설정합니다. 384LDV_AQ_B2 선택하여 장치를 수성 버퍼 디스펜싱 모드로 설정합니다.그리고 대상 플레이트 유형은 Greiner_384PS_781096. 언틱 최적화 된 전송 처리량. 목록 선택 탭을 선택합니다.가져오기를 클릭합니다. 그리고 DNA_Picklist_CSV 파일을 선택합니다. 그런 다음 재생을 클릭하고 프로토콜을 저장합니다.시뮬레이션을 클릭하여 프로그램 경륜의 시뮬레이션을 수행하여 선택 목록이 예상실험 설계와 일치하는지 확인합니다. 실행 버튼을 클릭하고 디스펜싱 프로그램을 시작합니다. 요청된 소스 플레이트를 삽입합니다.그리고 나노 디스펜더의 대상 플레이트. 경질 시약 경륜경을 설정하려면 생물 안전 캐비닛에서 작업하여 혈청 프리 배지에서 리포폴리플렉스 트랜스펙트 시약을 1x 최종 농도로 희석하고 튜브를 소용돌이시다. 매크로에 의해 품위를 매여 미리 보정된 384웰 파이펫팅 가이드 응용을 사용하여 미리 정의된 소스 플레이트에 따라 TR 믹스를 즉시 분배한다.TR 디스펜싱 후, 로드된 DNA에 대해 이전과 마찬가지로 TR로드 볼륨을 제어하는 설문 조사를 수행합니다. 분석하기 위해 미리 채워진 우물을 선택합니다. 그리고 이동 버튼을 클릭합니다.측정된 볼륨이 예상 볼륨과 일치하는지 확인합니다. 또한 12개 이상의 마이크로리터의 부피가 적재되지 않았는지 확인합니다. 이제 선택 목록 소프트웨어에서 DNA 선택 목록의 리셋을 수행합니다.장치 매개 변수가 여전히 수중 버퍼로 설정되어 있는지 확인합니다. 올바른 소스 및 대상 플레이트 유형을 입력합니다. 선택 목록 탭에서 재설정을 클릭하여 샘플 목록을 지웁웁다.그런 다음 가져오기를 클릭하고 TR_Picklist 선택합니다. CSV 파일입니다. 재생을 클릭합니다.프로토콜을 묻는 메시지가 표시되고 프로그램 트랜스페션 시약 혼합물 경륜의 시뮬레이션을 수행하면 프로토콜을 저장하여 시뮬레이션 버튼을 클릭하여 적절한 설계를 보장합니다. 앞서 수행한 것처럼 실행 버튼을 클릭하고 디스펜싱 프로그램을 시작한 후 소스 플레이트와 요청대로 NanoDipsenser의 대상 플레이트를 배치합니다. 세포를 분배하려면, 준비된 세포 현탁액으로 새로운 멸균 용기를 채우고 침전을 피하기 위해 교반하여 부정확성과 세포 밀도로 이어집니다.솔루션에 튜브 오거나이저를 삽입합니다. 그런 다음 셀 서스펜션이 디스펜싱 헤드에서 플러시되기 시작할 때까지 프라임 버튼을 누릅니다. 홍조하는 동안 디스펜싱 헤드의 흐름을 시각적으로 검사하여 팁이 막히지 않았는지 확인하고 각 튜브에 셀 서스펜션이 로드되었는지 확인합니다.이제, 연동 액체 처리기 플레이트 캐리어에 DNA와 TR 충전 384 잘 대상 플레이트를로드하고 뚜껑을 제거합니다. 사전 보정된 프로그램을 실행하여 전체 384 웰 플레이트에서 셀 서스펜션의 40 마이크로리터를 분배합니다. 분배 시간은 약 45초입니다.마지막으로, 384 웰 플레이트의 뚜껑을 교체하십시오. 리포폴리플렉스 시약을 사용하여 HeLa 세포의 질피는 성공적이었습니다. 5~30나노그램에 이르는 DNA 양은 하나의 마이크로리터 희석제부에서 동일한 효율과 최대 90%의 세포 형광을 보였다.대조적으로, 더 높은 양은 전감염된 세포의 비율에 있는 급격한 감소 귀착되었습니다. 15 나노리터에서 4개의 마이크로리터에 이르는 다양한 희석제 부피가 테스트되었고 1개의 마이크로리터가 최상의 조건으로 확인되었다. 이 프로토콜의 처리량을 더욱 향상시키기 위해 두 가지 효율적인 DNA 저장 방법은 플레이트 또는 냉동 저장을 건조하게 저장하는 것을 테스트했습니다.두 저장 방법 모두 최대 7일 동안 저장된 갓 분배된 DNA 용액과는 크게 다른 결과를 초래하지 않았다. 혈장 이식은 일반적으로 적어도 2개의 다른 플라스미드를 채택하기 때문에, 이 프로토콜의 DNA 멀티플렉싱 능력은 가장 잘 확인된 조건을 사용하여 검토되었다. 이전에 사용 된 tdTomato 적색 형광 단백질 플라스미드를 발현하는 것은 mVenus 밝은 노란색 형광 단백질을 표현하도록 변형되었으며 둘 다 응고 시도에서 사용되었습니다.적색 또는 녹색 형광 양성 세포 분석은 약 80%가 되는 경전 효율을 보였지만, 적혈구의 거의 100%는 대표적인 소프트웨어 기반 이미지 분석에서 볼 수 있는 바와 같이 플라스미드를 발현하는 mVenus와 도금처리되어 있었다. 일단 DNA가 소스 플레이트에 분배되었습니다. 예상 볼륨이 로드되고 12마이크로리터를 초과하지 않도록 설문조사를 수행합니다.소스 플레이트에서 경전 시약을 분배하는 동안 원심 분리 서브 플레이트가 완전한 트랜스페션 효능을 상실할 수 있기 때문에 거품을 피하십시오. 이 방법은 생물학적 실험, 범죄 및 경질에 적용될 수 있으며 대부분 384웰 플레이트 형식으로 수행될 수 있는 데 적합합니다. 완전한 교정 형질은 현재 가난한 전략으로 정렬 할 수없는 간헐적 인 영향을 모니터링 할 수 있도록 선명한 캐스트 비 스크리닝 접근 법으로 알려진 플라스미드 기반과 같은 새로운 응용 프로그램에 대한 길을 열어줍니다.

high-throughput-dna-plasmid-multiplexing-transfection-using-acoustic

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

이 비디오는 게놈 편집을 위해 표적 세포 내에서 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 나노블레이드 기반으로 전달하는 기술을 보여줍니다. 나노블레이드는 바이러스와 유사한 입자로 증식하여 주변 세포를 감염시킬 수 있는 능력이 없기 때문에 바이오 및 나노 물질의 신속한 용량 의존적 수송에 매우 유용합니다.

핵산 화물의 나노블레이드 기반 전달: 바이러스 유사 입자를 통해 Cas9-sgRNA 복합체를 표적 세포에 전달하는 기술

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움.

마이크로 소용돌이를 이용한 순차 분자 전달을위한 Electroporator을

전통적인 팁 기반 연속 희석 중 플라스틱 용기에 펩타이드 흡착은 효능 결정에 상당한 영향을 미치고 약물 발견의 선도 물질 식별 및 선도 물질 최적화 단계에 사용되는 구조-활성 관계의 이해를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 샘플의 자동화된 음향 비접촉 연속 희석 방법에 대해 설명합니다.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

단일 셀 시퀀싱 생물 학적 시스템, genotypic이 보여 하지만 현재 기술 커뮤니티 구성 및 기능의 깊은 프로 파일링에 필요한 처리량 부족. 여기, 우리는 미세 워크플로 시퀀싱에 대 한 설명 &gt; 다양 한에서 50000 단일 셀 게놈 세포 인구.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

이 프로토콜은 초음파 조영제에 의해 유도된 초음파 조영제에 의해 유도된 초음파 포기화를 통해 세포에 급속한 분자 전달을 위한 저비용 acoustofluidic 장치의 조립 및 작동을 설명합니다.

세포에 분자 화합물의 향상된 전달을 위한 부동 유체 장치의 조립 및 작동

배우세요 음향 나노 디스펜싱 기술을 활용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 포유류 세포 트랜스펙션 방법을. 나노 볼륨의 시약으로 비용을 절감하며 384개 조건을 동시에 테스트할 수 있는 사용자 친화적인 프로토콜입니다.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

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