마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

지단백질 입자는 토착 운송 수단입니다. 이물질의 농축은 트랙 캐리어로 의 사용을 용이하게합니다. 분자 또는 전체 입자의 특정 라벨은 세포 섭취를 측정하는 것이 가능합니다.

농축을 위한 두 가지 방법은 빠르고 사용하기 쉬우며 광범위한 물질에 맞게 조정할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 마르쿠스 악스만과 안드레아스 카너, 내 실험실에서 두 포스트 독이 될 것입니다. 연기 후드에서 탈지하기 시작하려면, 정량적 원심 분리 튜브에 에탄올 디틸 에테르의 50 밀리리터와 HDL 입자의 5 밀리그램을 포함하는 준비 된 HDL 용액의 1 ~ 2 밀리리터를 혼합.

음의 섭씨 20도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 10°C에서 10분간 2500배 g의 원심분리기. 상체를 버리고, 미리 냉각된 에탄올 디틸 에테르 혼합물의 50 밀리리터에 펠릿을 재차 리펜셜, 및 소용돌이를 간략하게 놓습니다.

음수 섭씨 20도에서 2시간 동안 두 번째로 배양합니다. 원심분리기는 다시 2500g에서 10분간 음수 10도에서 다시 원심분리기를 사용한다. 그런 다음 질소 가스 흐름을 공급하는 튜브를 삽입하여 펠릿을 건조시합니다.

그리고 버퍼 A.의 250 마이크로 리터에서 그것을 다시 중단합니다.브래드포드 단백질 분석 또는 다른 적절한 하나를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 이러한 용매가 아폴리포프로틴의 침을 억제할 것이기 때문에 에탄올 디틸 에테르 혼합물의 잔해를 제거하는 것이 중요합니다. 다음으로, 완충액 A.Insert의 250 마이크로리터 당 단백질 1밀리그램의 최종 농도로 희석하여 관내 용액 부품에 불활성 가스를 공급하는 튜브를 삽입한다.

필요한 경우 불활성 가스 대기 하에서 밤새 솔루션을 섭씨 4도에 보관하십시오. 재구성을 시작하려면 깨끗한 유리 튜브에서 CO 100 마이크로리터, C 13.5 마이크로리터 및 PC 500 마이크로리터를 혼합합니다. 그런 다음 유리 튜브를 회전시키면서 튜브 내부의 질소 가스를 세척하여 균일한 표면 층을 산출하기 위해 혼합물을 건조시합니다. 0.5 밀리리터 반응 튜브에서 완충 A.Then 10 마이크로몰러 합성 마이크로RNA 100 마이크로리터를 2밀리리터 반응 튜브에 100 마이크로리터의 마이크로리터를 혼합하여 완충 A.에 신선한 30 밀리머 스퍼민 용액을 준비합니다.

그리고 섭씨 30도에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 인큐베이션된 200 마이크로리터 용액을 유리 튜브로 이송하여 준비된 PC-CO-C 마스터믹스 표면 층을 재수화한다. 그런 다음 밀리리터 디옥시콜린트 용액당 30밀리그램의 마이크로리터 50기를 추가합니다.

섭씨 4도에서 2시간 동안 저어줍니다. 그 후, 유리 튜브에 디피질 HDL 용액의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 그리고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 저어줍니다.

투석을 시작하려면 먼저 50그램의 흡착 구슬을 800밀리리터의 이중 증류수에 추가합니다. 그리고 자기 교반기를 사용하여 1 분 동안 저어줍니다. 구슬이 정착하고 상체를 장식할 때까지 15분 간 기다립니다.

미리 냉각된 PBS로 절차를 반복합니다. PBS에서 미리 젖은 투석 카세트. 주사기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 이전에 준비된 혼합물을 카세트에 추가합니다.

PBS 처리 된 흡착 구슬을 PBS 의 3 리터에 추가하고 카세트를 PBS에 넣고 섭씨 4도에서 투석합니다. 구슬은 투석 막을 따라 밀도 그라데이션을 일정하게 유지합니다. 버퍼와 구슬을 1시간 2시간 후에 변경합니다.

24시간 후 주사기를 사용하여 카세트에서 1.5밀리리터 반응 튜브로 용액을 추출하여 재구성된 HDL 입자 용액을 회수합니다. 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 반응 튜브에 불활성 가스를 공급하고 밀봉하고, 불활성 가스 대기 하에서 재구성된 HDL 입자 용액을 섭씨 4도에 저장합니다.

먼저, 신선한 30 밀리마일러 스퍼민 용액을 RNAe 가 없는 물로 준비합니다. 합성 마이크로RNA 10 마이크로리터 100마이크로리터를 2밀리리터 반응 튜브에 100마이크로리터의 스퍼민 용액과 혼합합니다. 그리고 섭씨 30도에서 30 분 동안 배양하십시오.

그런 다음 DMSO 100 마이크로리터와 1X LDL 버퍼1.2 밀리리터를 준비된 microRNA spermine 솔루션에 추가합니다. 이전에 준비된 LDL 입자 용액을 PBS로 희석하여 밀리리터당 약 4밀리그램의 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석 된 용액의 450 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 반응 튜브에 넣고 10X LDL 버퍼의 50 마이크로 리터와 혼합합니다.

얼음 위에 10분 동안 배양하세요. 인큐베이션 후 500 마이크로리터 LDL 입자 용액과 1.5밀리리터 마이크로RNA-스퍼민-DMSO 용액을 결합하고 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다. 이전에 설명된 것과 유사한 투석을 수행하고, 불활성 가스 대기 아래에 표기된 LDL 입자 용액을 섭씨 4도에 저장한다.

시작하려면 PBS에서 1대 100에서 일대일, 000 사이에 HDL 또는 LDL 입자 용액을 희석합니다. 마이크가 있는 미수기판에 접착제 테이프를 누르고 테이프를 당겨 상부 미카 층을 제거하여 마이크를 제거합니다. 파이펫을 사용하여 갓 갈라진 운수에 마이크로리터 2개를 증정하여 5분간 배양합니다.

지단백질 입자는 표면에 연속 결합 막을 형성하는 경향이 있다. 따라서, 개별 적인 것을 얻기 위하여 mica 표면에 입자 농도를 조정하는 것이 중요합니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 헹구는 다.

고속 AFM 액체 셀을 PBS로 채우고, 운하 운반 스캐너를 고속 AFM 단계에 장착합니다. 제어 소프트웨어에서 칸틸레버의 접근 과정을 마이카 표면에 시작합니다. 1평방 마이크로미터 미만의 스캔 크기를 사용하고 이미징 힘을 가능한 한 낮게 유지합니다.

탭 모드에서 샘플을 이미지합니다. 데이터를 Gwyddion에 로드하고 임계값 함수별로 마크 입자를 통해 입자를 감지합니다. 높이 임계값값을 조정하여 개별 파티클을 마스크합니다.

보통 50%정도의 레벨은 좋은 출발점입니다. 다항적 배경을 제거하여 이미지를 평평하게 하고 마스크된 영역 제외 옵션을 활성화합니다. 다양한 입자 특성 함수의 분포를 사용하여 검출된 파티클의 최대 높이 값을 내보내고 기록된 모든 이미지에 대해 이러한 단계를 반복합니다.

이 실험에서는 HDL 입자의 분해를 통해 HDL 입자의 재구성이 수행되었고, 이어서 리립화와 투석이 뒤따랐다. 재구성된 HDL 입자의 50%의 수율을 달성할 수 있습니다. 그러나, microRNA를 가진 동일 라벨링은 아포포프로틴 B100 단백질의 소수성 때문에 LDL 입자의 라벨링에 가능하지 않았다.

따라서, DMSO는 LDL 입자의 지질 단층의 침투를 위해 사용되었고, 품질 관리 중에 100%에 가까운 수율을 가지며, 희석은 분석에 매우 중요하다. 위쪽 이미지는 너무 높은 파티클 밀도를 보여줍니다. 하단 이미지는 분석에 적합합니다.

입자 높이의 확률 밀도 함수는 네이티브, 표지 및 표지된 제어 지단백 입자의 크기 분포를 비교하기 위해 계산되었습니다. 라벨링 절차 전후의 상대적 변경은 무시됩니다. RNA 올리고뉴클레오티드를 취급할 때, RNAse 프리작동.

신선한 일회용 플라스틱 소모품을 사용하고 항상 장갑을 착용하십시오. 핵이 없는 용액만 사용하십시오. 고속 AFM은 지단백질의 일반적인 모양을 결정하는 단 하나의 방법입니다.

다른 방법은 전자 현미경 검사법일 것입니다. 디틸 에테르를 취급하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 연기 후드에서 작업하십시오.