Name: 마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 학습하세요 마이크로RNA 함량 측정 및 세포 흡수율 평가를 위한 HDL 입자 재구성 방법을. 이 프로토콜은 리포단백질 입자의 농축과 정량 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 오스트리아 과학 기금 프로젝트 P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung 더 슈 타트 빈 주 르 푀 르 더 위 즈 센 뒤" 프로젝트 H-3065/2011, 지역 개발을 위한 유럽 기금 (EFRE, IWB2020), 어퍼의 연방 국가에 의해 지원 되었다 오스트리아, 그리고 "토지 오에 바 시 핀 안 쯔 렁".

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여기서, 인간 혈액 으로부터 지 단백질 입자 분 획의 분리 및 그들의 개별적인 miRNA 함량의 결정은 단계별로 설명 된다. 분리 되 고 합성 된 miRNA를 처리 하는 동안 RNase가 없는 환경에서 작업 하는 것이 중요 합니다-입자-임베디드 miRNA는 분명히 효소 분해 로부터 보호 됩니다. 네이티브 지 단백질 입자의 miRNA/입자 비율이 다소 낮기 때문에, miRNA를 사용한 인공 농축은 세포의 홀로 입자 흡수를 연구 하는 데 필요 합니다. 따라서, 앞서 설명한 바와 같이 HDL 입자의 재구성 은 miRNA 가닥을 통합 하도록 변형 된다. 추가적으로,이 절차 도중 지질과 단백질 분 율의 별거는 과학자가 지 단백질 입자19의 지질 및 단백질 관련 성분을 검사할 것을 허용 합니다. 유사한 방법으로, LDL 입자의 라벨링 절차가 적응 된다. 흥미롭게도, miRNA의 자연 안정제 인 spermine을 첨가 하면 입자 비율에 영향을 미치지 않습니다. 원칙적으로,이 방법은 단백질 입자 내에서 miRNA 보다 다른 물질의 인 폴딩을 허용 한다는 점에 유의 해야 합니다. 물론 전체 크기의 HDL (지름: 5-12 nm) 및 LDL 입자 (직경: 18-25 nm)에 기초한 물질의 물리적 크기에 대해서는 한계가 있다.
재구성/라벨링 된 지 단백질 입자의 품질 관리와 관련 하 여, HS-AFM은 단일 입자 수준에서 HDL/LDL 입자를 특성화 하는 적용 가능한 방법입니다. EM에 비해, 그것은 짧은 준비 시간 및 가까운 생리 적 조건 (습식, 실 온)을 허용 한다.
고유 한 감도와 증폭으로 인해 qPCR은 낮은 miRNA 농도를 감지 하는 방법입니다. 양자 택일로, 개별 분자 조차 검출할 수 있는 단 하나 분자 과민 한 형광 현미경 검사 법은, 예를 들면, 입자 당 형광 표지 된 miRNA 가닥의 낮은 사격 량 때문에 적당 하지 않을 것입니다. 따라서, 네이티브 지 단백질 입자 당 miRNA 가닥의 비율은 10-8이 되는 것으로 밝혀졌다. 인공 농축은 세포 단백 흡수 율의 추정을 용이 하 게 하는 1만의 비율로 비율을 증가 시킵니다 (네이티브 지 단백질 입자 19를 사용 하 여 유의 한 차이가 검출 되지 않음). QPCR의 높은 감도는 인큐베이션 시간 및 miRNA/입자 비율 후에 miRNA 가닥의 수를 측정 하 여이 흡수 율을 결정할 수 있게 합니다. 계산 된 값은 세포 분해 및 miRNA의 방출을 무시 하 고, 따라서, 지 단백질 입자 흡수 율에 대 한 적어도 낮은 제한을 나타낸다.
앞으로,이 방법은 세포에서 제약 물질 (특히 친 유성 것 들)을 전달 하 고 세포내 농도에 대 한 그들의 생물학적 효과를 상관 (지 단백질 입자의 흡수 율을 통해 결정) 하도록 조정 될 수 있다.

단백 입자는 콜레스테롤 에스테 르 및 트리 글리세라이드 지방의 코어를 둘러싸는 양친 매 성 지질과 콜레스테롤의 단층으로 구성 됩니다. 입자의 생물학적 기능을 정의 하는 멤브레인 임베디드 apolipoproteins 전체 입자가 안정화 됩니다. 지 단백질 입자는 그들의 각각 증가 하는 조밀도에 따라 구별 될 수 있고, 따라서, 아주 저밀도 지 단백질 (IDL), LDL 및 HDL 입자와 같은 크기를 감소 시킵니다. 혈 류에서 불용 성 성분의 수송에도 불구 하 고, HDL 입자가 miRNA1,2의 비 코딩 가닥을 수행 하는 것이 입증 되었습니다. 마이크로-rnas는 매우 짧은 (일반적으로 2 다스 뉴클레오티드) RNA 가닥으로 서,이로 인해 내 식 상보성 mRNA 가닥을 분해 하 고 특정 단백질의 발현 프로필을변경 합니다. 6. 더욱이, miRNA 프로 파일의 변경은 다양 한 질병에서 발견 되었으며, 따라서, 프로 파일은 진단과 예 후에 대 한 바이오 마커로 서 적용 가능 하다. 단백질 입자를 통해 세포 사이의 miRNAs의 세포 외 수송은 세포 간 mRNA 레벨 변조를 위한 추가 메커니즘으로 작용할 수 있다. 생물학적 효과를 정량적으로 추정 하기 위해, 지 단백질 입자의 절대적 및 상대적인 miRNA 함량에 관한 지식이 필요 하다.
정량적 실시간 PCR은 이러한 정보를 얻기에 적합 하 고 비교적 빠른 방법 이다. 따라서, 상대 정량 (RQ) 값은 계산 될 수 있고, 상이한 샘플과 지 단백질 분 획 간의 상대적인 차이는 추정 가능 합니다. 다 웰 미세 유체 어레이 카드는 샘플에서 miRNAs의 상대적인 존재 (RQ 값과 동일)를 결정 하는 빠르고 사용 하기 쉬운 방법입니다. 다 웰 미세 유체 어레이 카드는 미세 유체 장치에 내장 된 개별 qPCR 반응에 대해 96 또는 384 개별 반응 챔버로 구성 됩니다. 각 챔버에는 하나의 개별 miRNA에 필요한 가수분해 프로브 및 특정 qPCR 프라이 머가 포함 되어 있습니다. 표준화, 간단한 워크플로우 및 피 펫 팅 단계 수 감소로 인 한 짧은 처리 시간입니다. 또한 필요한 샘플 볼륨이 최소화 됩니다. 상대적인 정량화와는 대조적으로, 절대 miRNA 함량은 miRNA 가닥의 알려진 절대 수의 표준 곡선과 qPCR 샘플 결과의 비교를 필요로 한다. 상대적으로 낮은 miRNA 함량으로 인해 표준 및 또한 단일 분자 민감성 이미징 기술이 실현 가능 하지 않기 때문에 miRNA을 가진 지 단백질 입자의 인공 농축은 세포를 연구 하는 데 불가피 합니다. 단백 입자 상호 작용 및 miRNA 전송. 이와 관련 하 여, HDL 입자의 delipidation는 후속 성물 함7 의 통합을 허용 하 고, 따라서, miRNA 가닥으로 농축. MiRNA를 가진 LDL 입자의 유사한 농축은 LDL 입자의 주요 성분 인 apoB-100 단백질의 소수 성으로 인해 실현 가능 하지 않습니다. 그러나, 지질 막에 침투할 수 있는 극성 용 매 디 메 틸 설 폭 사이드 (DMSO)를 첨가 함으로써, LDL 입자는 miRNA 가닥과 함께 인위적으로 로딩 될 수 있다.
고속 원자 힘 현미경 검사 법 (HS-AFM)은 서브 나노미터 공간 및 2 초 시간 분해능을 제공 하는 생물학적 표본의 특성화를 위한 강력한 도구입니다8. 따라서, 천연/재구성/라벨링 된 지 단백질 입자가 근 생리 적 환경 하에서 이미징 될 수 있으므로 변형 된 단백질 입자의 품질 관리를 위한 잘 적합 한 기술입니다.
여기서, qPCR 기반 프로토콜은 지 단백질 입자 및 세포 샘플의 절대적/상대적인 miRNA 함량을 결정 하기 위해 단계별로 제시 되며,이는 세포 단백질 입자 흡수 율의 추정을 가능 하 게 한다. 더욱이, miRNA와 함께 지 단백질 입자의 농축을 위한 방법이 입증 된다. 이 방법은 단백 콘텐츠의 일반적인 조작을 위해 적응 될 수 있고, 따라서, 약물 전달을 위한 표적으로 서 지 단백질 입자의 적용을 입증 한다.

<table><tbody><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>초원심분리기 로터</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>Vacutainer (EDTA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman</td><td>342414</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>초원심분리 튜브 실러</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>Sodiumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>투석관, MWCO 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>지단백질 분리</td></tr><tr><td>합성 miRNA</td><td>microSynth</td><td>-</td><td>합성 miRNA</td></tr><tr><td>TRIS 완충액 pH 7</td><td>Ambion</td><td>AM9850G</td><td>합성 miRNA</td></tr><tr><td>TRIS 완충액 pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>합성 miRNA</td></tr><tr><td>멸균 튜브</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>합성 miRNA</td></tr><tr><td>광도계</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Biophotometer</td><td>Bradford assay</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Bradford 분석</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Stain</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Bradford 분석</td></tr><tr><td>나트륨</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>탈립</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analytical</td><td>03690-100ML</td><td>탈립</td></tr><tr><td>TRIS 완충액 pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>탈립</td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td>AustrAlco</td><td>에탄올 앱솔루트 99.9%</td><td>탈립</td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td><td>탈립</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>탈립</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>재구성</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>재구성</td></tr><tr><td>포스파티딜콜린</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>재구성</td></tr><tr><td>콜레스테롤 올레이트</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td></td></tr><tr><td>재구성 콜레스테롤</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td><td>재구성</td></tr><tr><td>유리관</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>재구성</td></tr><tr><td>정자</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>재구성</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td></td></tr><tr><td>재구성 마그네틱 교반 막대</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>재구성</td></tr><tr><td>100&micro; L 마이크로피펫</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td><td>투</td></tr>석 <tr><td>Amberlite XAD-2 비드</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td><td>투</td></tr>석 <tr><td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td><td>Thermo Scientific</td><td>66003</td><td>투석</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>투석</td></tr><tr><td>주사기 needle</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>Dialysis</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>LDL 입자 라벨링</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>life technologies</td><td>D12345</td><td>LDL 입자 라벨링</td></tr><tr><td>원자력 현미경</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>재구성/라벨링된 지단백질 입자의 품질 관리</td></tr><tr><td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td><td>Christine Gr&ouml; pl</td><td>G250-1/V1</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>AFM 캔틸레버</td><td>Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>Czech Metrology Institute</td><td>http://gwyddion.net</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드, Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td>miRNA 추출</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>miRNA 추출</td></tr><tr><td>20G 바늘</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miRNA 추출</td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>miRNA 추출</td></tr><tr><td>PCR 캐비닛</td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>역전사</td></tr><tr><td>TaqMan 역전사 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>역전사</td></tr><tr><td>Rnase-free water</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>역전사</td></tr><tr><td>0.2ml 튜브</td><td>브랜드</td><td>781305</td><td>역전사</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>마이크로 원심분리기 AL</td><td>역전사</td></tr><tr><td>열순환기</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>역전사</td></tr><tr><td>TaqMan Primer</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-qPCR</td><td></td></tr> <tr><td>iTaq 범용 프로브 슈퍼믹스</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Corbett</td><td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트</td><td>적용 Biosystems</td><td>4366596</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex RT 프라이머, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399966</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Array TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems Biosystems</td><td>4399933</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td><td>Applied Biosystems</td><td>A31805</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>MgCl2 (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan 어레이</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>TaqMan 어레이</td></tr><tr><td>7900HT 고속 Real-Time PCR 시스템</td><td>응용 바이오시스템</td><td></td><td>4351405 TaqMan 어레이 TaqMan</td></tr><tr><td>어레이 카드 실러</td><td>응용 바이오시스템</td><td>-</td><td>TaqMan 어레이</td></tr></tbody></table>

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

단백 입자 주로 지질과 혈 류에서 콜레스테롤의 전송기. 또한, 그들은 소량의 비 부호화 마이크로 로르 (miRNA) 가닥을 포함 합니다. 일반적으로, miRNA는 메신저 RNA (mRNA)와의 상호작용으로 인해 단백질 발현 프로필을 변경 한다. 따라서, 지 단백질 입자의 상대적이 고 절대적인 miRNA 함량의 지식은 세포 입자 흡수의 생물학적 효과를 추정 하는데 필수적 이다. 여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qPCR) 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 절대적 miRNA 함량을 결정 하기 위해 제시 되 고-천연 및 miRNA 농축 된 단백질 입자에 대 한 것으로 예시 된다. 상대 miRNA 함량은 다 웰 미세 유체 어레이 카드를 사용 하 여 정량화 됩니다. 더욱이,이 프로토콜은 과학자 들이 세포 miRNA을 추정 하 고, 따라서, 지 단백질 입자 흡수 율을 추정할 수 있게 합니다. MiRNA와 인위적으로 로드 된 고밀도 지 단백질 (HDL) 입자를 사용할 때, 네이티브 HDL 입자와의 인큐베이션이 오히려 낮은 miRNA 콘텐츠로 인해 큰 영향을 미치지 않는 반면, 세포 miRNA 수준의 현저한 증가가 관찰 됩니다. 대조적으로, 저밀도 지 단백질 (LDL) 입자의 세포 흡수는 네이티브 miRNA도 인위적으로 로드 되지 않으며, 셀룰러 miRNA 수준을 변경 하지 않았습니다.

여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

지단백질 입자는 토착 운송 수단입니다. 이물질의 농축은 트랙 캐리어로 의 사용을 용이하게합니다. 분자 또는 전체 입자의 특정 라벨은 세포 섭취를 측정하는 것이 가능합니다.농축을 위한 두 가지 방법은 빠르고 사용하기 쉬우며 광범위한 물질에 맞게 조정할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 마르쿠스 악스만과 안드레아스 카너, 내 실험실에서 두 포스트 독이 될 것입니다. 연기 후드에서 탈지하기 시작하려면, 정량적 원심 분리 튜브에 에탄올 디틸 에테르의 50 밀리리터와 HDL 입자의 5 밀리그램을 포함하는 준비 된 HDL 용액의 1 ~ 2 밀리리터를 혼합.음의 섭씨 20도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 10°C에서 10분간 2500배 g의 원심분리기. 상체를 버리고, 미리 냉각된 에탄올 디틸 에테르 혼합물의 50 밀리리터에 펠릿을 재차 리펜셜, 및 소용돌이를 간략하게 놓습니다.음수 섭씨 20도에서 2시간 동안 두 번째로 배양합니다. 원심분리기는 다시 2500g에서 10분간 음수 10도에서 다시 원심분리기를 사용한다. 그런 다음 질소 가스 흐름을 공급하는 튜브를 삽입하여 펠릿을 건조시합니다.그리고 버퍼 A.의 250 마이크로 리터에서 그것을 다시 중단합니다.브래드포드 단백질 분석 또는 다른 적절한 하나를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 이러한 용매가 아폴리포프로틴의 침을 억제할 것이기 때문에 에탄올 디틸 에테르 혼합물의 잔해를 제거하는 것이 중요합니다. 다음으로, 완충액 A.Insert의 250 마이크로리터 당 단백질 1밀리그램의 최종 농도로 희석하여 관내 용액 부품에 불활성 가스를 공급하는 튜브를 삽입한다.필요한 경우 불활성 가스 대기 하에서 밤새 솔루션을 섭씨 4도에 보관하십시오. 재구성을 시작하려면 깨끗한 유리 튜브에서 CO 100 마이크로리터, C 13.5 마이크로리터 및 PC 500 마이크로리터를 혼합합니다. 그런 다음 유리 튜브를 회전시키면서 튜브 내부의 질소 가스를 세척하여 균일한 표면 층을 산출하기 위해 혼합물을 건조시합니다. 0.5 밀리리터 반응 튜브에서 완충 A.Then 10 마이크로몰러 합성 마이크로RNA 100 마이크로리터를 2밀리리터 반응 튜브에 100 마이크로리터의 마이크로리터를 혼합하여 완충 A.에 신선한 30 밀리머 스퍼민 용액을 준비합니다.그리고 섭씨 30도에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 인큐베이션된 200 마이크로리터 용액을 유리 튜브로 이송하여 준비된 PC-CO-C 마스터믹스 표면 층을 재수화한다. 그런 다음 밀리리터 디옥시콜린트 용액당 30밀리그램의 마이크로리터 50기를 추가합니다.섭씨 4도에서 2시간 동안 저어줍니다. 그 후, 유리 튜브에 디피질 HDL 용액의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 그리고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 저어줍니다.투석을 시작하려면 먼저 50그램의 흡착 구슬을 800밀리리터의 이중 증류수에 추가합니다. 그리고 자기 교반기를 사용하여 1 분 동안 저어줍니다. 구슬이 정착하고 상체를 장식할 때까지 15분 간 기다립니다.미리 냉각된 PBS로 절차를 반복합니다. PBS에서 미리 젖은 투석 카세트. 주사기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 이전에 준비된 혼합물을 카세트에 추가합니다.PBS 처리 된 흡착 구슬을 PBS 의 3 리터에 추가하고 카세트를 PBS에 넣고 섭씨 4도에서 투석합니다. 구슬은 투석 막을 따라 밀도 그라데이션을 일정하게 유지합니다. 버퍼와 구슬을 1시간 2시간 후에 변경합니다.24시간 후 주사기를 사용하여 카세트에서 1.5밀리리터 반응 튜브로 용액을 추출하여 재구성된 HDL 입자 용액을 회수합니다. 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 반응 튜브에 불활성 가스를 공급하고 밀봉하고, 불활성 가스 대기 하에서 재구성된 HDL 입자 용액을 섭씨 4도에 저장합니다.먼저, 신선한 30 밀리마일러 스퍼민 용액을 RNAe 가 없는 물로 준비합니다. 합성 마이크로RNA 10 마이크로리터 100마이크로리터를 2밀리리터 반응 튜브에 100마이크로리터의 스퍼민 용액과 혼합합니다. 그리고 섭씨 30도에서 30 분 동안 배양하십시오.그런 다음 DMSO 100 마이크로리터와 1X LDL 버퍼1.2 밀리리터를 준비된 microRNA spermine 솔루션에 추가합니다. 이전에 준비된 LDL 입자 용액을 PBS로 희석하여 밀리리터당 약 4밀리그램의 최종 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석 된 용액의 450 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 반응 튜브에 넣고 10X LDL 버퍼의 50 마이크로 리터와 혼합합니다.얼음 위에 10분 동안 배양하세요. 인큐베이션 후 500 마이크로리터 LDL 입자 용액과 1.5밀리리터 마이크로RNA-스퍼민-DMSO 용액을 결합하고 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다. 이전에 설명된 것과 유사한 투석을 수행하고, 불활성 가스 대기 아래에 표기된 LDL 입자 용액을 섭씨 4도에 저장한다.시작하려면 PBS에서 1대 100에서 일대일, 000 사이에 HDL 또는 LDL 입자 용액을 희석합니다. 마이크가 있는 미수기판에 접착제 테이프를 누르고 테이프를 당겨 상부 미카 층을 제거하여 마이크를 제거합니다. 파이펫을 사용하여 갓 갈라진 운수에 마이크로리터 2개를 증정하여 5분간 배양합니다.지단백질 입자는 표면에 연속 결합 막을 형성하는 경향이 있다. 따라서, 개별 적인 것을 얻기 위하여 mica 표면에 입자 농도를 조정하는 것이 중요합니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 헹구는 다.고속 AFM 액체 셀을 PBS로 채우고, 운하 운반 스캐너를 고속 AFM 단계에 장착합니다. 제어 소프트웨어에서 칸틸레버의 접근 과정을 마이카 표면에 시작합니다. 1평방 마이크로미터 미만의 스캔 크기를 사용하고 이미징 힘을 가능한 한 낮게 유지합니다.탭 모드에서 샘플을 이미지합니다. 데이터를 Gwyddion에 로드하고 임계값 함수별로 마크 입자를 통해 입자를 감지합니다. 높이 임계값값을 조정하여 개별 파티클을 마스크합니다.보통 50%정도의 레벨은 좋은 출발점입니다. 다항적 배경을 제거하여 이미지를 평평하게 하고 마스크된 영역 제외 옵션을 활성화합니다. 다양한 입자 특성 함수의 분포를 사용하여 검출된 파티클의 최대 높이 값을 내보내고 기록된 모든 이미지에 대해 이러한 단계를 반복합니다.이 실험에서는 HDL 입자의 분해를 통해 HDL 입자의 재구성이 수행되었고, 이어서 리립화와 투석이 뒤따랐다. 재구성된 HDL 입자의 50%의 수율을 달성할 수 있습니다. 그러나, microRNA를 가진 동일 라벨링은 아포포프로틴 B100 단백질의 소수성 때문에 LDL 입자의 라벨링에 가능하지 않았다.따라서, DMSO는 LDL 입자의 지질 단층의 침투를 위해 사용되었고, 품질 관리 중에 100%에 가까운 수율을 가지며, 희석은 분석에 매우 중요하다. 위쪽 이미지는 너무 높은 파티클 밀도를 보여줍니다. 하단 이미지는 분석에 적합합니다.입자 높이의 확률 밀도 함수는 네이티브, 표지 및 표지된 제어 지단백 입자의 크기 분포를 비교하기 위해 계산되었습니다. 라벨링 절차 전후의 상대적 변경은 무시됩니다. RNA 올리고뉴클레오티드를 취급할 때, RNAse 프리작동.신선한 일회용 플라스틱 소모품을 사용하고 항상 장갑을 착용하십시오. 핵이 없는 용액만 사용하십시오. 고속 AFM은 지단백질의 일반적인 모양을 결정하는 단 하나의 방법입니다.다른 방법은 전자 현미경 검사법일 것입니다. 디틸 에테르를 취급하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 연기 후드에서 작업하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

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지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

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이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

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미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

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학습하세요 마이크로RNA 함량 측정 및 세포 흡수율 평가를 위한 HDL 입자 재구성 방법을. 이 프로토콜은 리포단백질 입자의 농축과 정량 분석에 활용됩니다.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

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