Name: 스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 배우세요 항체 없이 SUMO 변성 단백질을 검출하는 kmUTAG 형광 단백질 포착 기법을 이용한 세포 생물학 연구 방법입니다. 이 기술은 암과 신경퇴행성 질환에서 SUMO의 역할을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구소의 모든 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다, 원고의 중요 한 독서에 대 한 나탈리 응 우 옌, 시퀀싱 Lidia Epp. 이 작품은 연방 연구 상용화 기금 MF16-LS에 의해 확인에 의해 지원 되었다. W & M 학생 들에 대 한 연구 지원은 베일리-휴스턴 연구 기금에 의해 제공 되었으며 찰스 센터는 리와 CH에 대 한 펠로 우 십을 존중 합니다.

1. 재조합 KmUTAG-FL 스모를 사용 하 여 고정 조직 배양 세포에서 스모 검출 단백질을 포착
<ol><li>6 웰 TC 플레이트에서 선택의 조직 배양 세포를 22 mm 원형 커버에서 70% ~ 80%까지 성장 6 웰 플레이트에서 1.2 ~ 1.8 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>DPBS (Dulbecco의 인산 완충 식 염 수가 1 mL)로 세포를 짧게 씻으십시오.</li>
	<li>고정용으로, DPBS에 희석 한 4% 파라 포름알데히드 (PFA) 용액의 신선한 용액을 준비 하십시오. 세포를 고정 하려면 DPBS에 2 mL의 4% PFA를 각 웰에 추가 하십시오. 실 온에서 20 분 동안 세포를 배양 합니다. 참고: PFA를 사용 하는 모든 단계는 실험실 안전 후드에서 수행 해야 하며 PFA를 올바르게 배치 해야 합니다.</li>
	<li>플레이트를 1 mL DPBS로 세척 하 고 5 분간 각 세척 하 여 고정 세포를 3 배 씻어 냅니다.</li>
	<li>세포 투과를 위해 DPBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용 하 여 15 분 동안 배양 합니다.</li>
	<li>플레이트를 변이 하는 동안 1 mL DPBS에서 3 배 셀을 세척 하 고, 5 분간 각 세척</li>
	<li>10s 0.1의 500 µ l 글리신 (ph 2.0)을 사용 하 여 세포를 배양 한 다음, µ의 10 배 스모 프로 테아 제 버퍼 (SPB) 500로 즉시 pH를 중화 시킵니다.</li>
	<li>1 mL DPBS에서 세포 세 배를 세척 하 고, 5 분간 각 세척</li>
	<li>우물에서 커버 슬립을 제거 하 고 습도 챔버에 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립의 인큐베이터를 다음과 같이 진행 합니다.<ol>
<li>UTAG-fl 염색만을 위해: 튜브에 5mm TCEP를 포함 하는 100 µ L와 함께 1 µ g의 UTAG-fl을 혼합 한 후 커버 슬립의 셀에 혼합 한 후, 습도 챔버에서 1 시간 동안 실 온에서 배양 합니다.</li>
		<li>선택적으로, UTAG-FL 및 안티 SUMO1 항 체 공동 염색을 위해, 다음을 진행:<ol>
<li>튜브 1 µ g UTAG-FL 및 0.5 µ L SUMO2/38A2 (개발 연구를 위해 얻어진 하이브 리도 마 뱅크9)를 차단 완충 액의 100 µ l로 혼합 하 고, 커버 슬립 상에 서 혼합을 피 펫 하 고 1 시간 동안 상 온에서 배양 한다.</li>
			<li>커버 슬립의 셀을 200 µ L DPBS로 3 회 세척 하 고 각각 5 분간 세척 합니다.</li>
			<li>튜브 0.5 µ L 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 488 공액 항 체와 100 µ L 차단 완충 액을 혼합 하 고 커버 슬립 위에 혼합 한 후 실 온에서 1 시간 동안 배양 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>커버 슬립을 세척 하기 위해, 피 펫 200 µ L DPBS를 각 커버 미 끄 러 짐에 넣고 10 분 동안 제자리에 둡니다. 2 회 이상 세탁을 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 세척에서 커버 슬립을 제거 하 고 장착 매체 한 방울로 사전 세척 된 현미경 슬라이드에 뒤집어 놓습니다 ( 재료 표참조).</li>
	<li>현미경으로 보기 전에-20°c 냉동 고에 하룻밤 보관 하십시오. DAPI에 대 한 적절 한 필터 세트를 사용 하 여 시각화, 텍사스 레드 (kmUTAG fl) 및 알 렉 사 Fluor 488 (옵션 SUMO2/3 공동 염색이 수행 되는 경우).</li>
</ol>2. 우 태그-fl을 사용 하 여 수정 된 오 마 충 생식의 스모 탐지
<ol><li>Μ를 폴 리 라이 신으로 코팅 된 더하기 충전 된 슬라이드에 8 개의 계란 버퍼 (14 )로 성인 암수를 양도 한다. 27.5 G 바늘을 사용 하 여 웜에서 생식 광고를 풀어. 항 체 라벨링 또는 UTAG-fl 라벨링 중 하나를 진행 합니다.</li>
	<li>항 체 라벨링 샘플의 경우, 다음과 같이 진행 하십시오.<ol>
<li>액체 질소에서 샘플을 동결 하 고 Coplin 항아리에-20°c 메탄올에서 밤새 고정 시킵니다.</li>
		<li>또한 Coplin 항아리에, 1 개 PBS에서 3 회 슬라이드를 세척 한 다음 0.5% BSA와 0.1% 트윈 20을 포함 하는 PBS에서 20 분 동안 차단 합니다.</li>
		<li>시 편을 덮고 있는 각 슬라이드에 30 µ L의 항 스모 6F2 항 체 (1:10)를 추가 한다. 4°c의 습도 챔버에서 밤새 배양 한다. 주의: 스모 6F2는 개발 연구에서 하이브 리도 마 은행 (15) 로부터 얻었다.</li>
		<li>Coplin 항아리에, 1 개 PBS에서 2 분 동안 슬라이드를 세척 한 후 30 µ L의 DyLight 488 염소 안티 마우스 2 차 항 체 (1:200)를 사용 하 여 실 온의 습도 챔버에서 1.5 시간 동안 시료를 처리 합니다.</li>
		<li>Coplin 항아리에 1 개의 PBS에서 2 분 동안 슬라이드를 씻고 dH20에서 빠른 딥을 수행한 다음 장착 매체가 있는 슬라이드를 장착 합니다 ( 재질 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>KmUTAG-fl 라벨링의 경우 다음을 진행 하십시오.<ol>
<li>셀을 고정 하려면 샘플에 1 부피의 8% PF를 추가 하 여 최종 농도가 4% PF가 되도록 하십시오. 습도 챔버에서 10 분 동안 수정 하 고 0.1 M 글리신을 가진 1x PBS를 포함 하는 Coplin 항아리에 슬라이드를 적어도 5 분 동안 전달 하 여 반응을 냉각 시킵니다.</li>
		<li>Coplin 항아리에서, 세포를 1x PBS에서 5 분 동안 세척 한 다음 샘플을 10 분 동안 0.1%의 트리톤-X를 포함 하는 1x PBS에 침투 시킵니다.</li>
		<li>Coplin 용기에 1x PBS에서 적어도 5 분 동안 세척 한 다음, 슬라이드의 샘플에 µ의 0.1 M 글리신 (ph=2.0)을 10 초간 200 추가 합니다. 즉시 200 µ L을 추가 하 여 pH를 무력화 합니다.</li>
		<li>Coplin 항아리에 1x PBS로 슬라이드를 5 분간 씻으십시오.</li>
		<li>슬라이드의 선 충 선 2 µ g를 포함 하는 µ의 1x SPB + 5mm tcep의 세척 및 피 100 펫에서 미 끄 러 지는 것을 제거 하 고, 흔들림 없이 1 시간 동안 습도 챔버에서 배양 합니다.</li>
		<li>Coplin 항아리에 슬라이드를 반환 하 고 1x PBS에서 15 분 동안 세척</li>
		<li>세척에서 슬라이드를 제거 하 고 실험실 와이프를 사용 하 여 샘플 주위를 말린 다음 5 µ의 장착 매체와 함께 슬라이드를 장착 하십시오 ( 재료 표참조). 슬라이드를 4°c에 보관 하십시오. DAPI (DNA), 텍사스 레드 (kmUTAG fl) 및 DyLight 488 (SUMO2에 대 한 적절 한 필터 집합을 사용 하 여 시각화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li>
<li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerscher%2C+O+%22SUMOylation%22">SUMOylation</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li>
<li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+%CE%B2-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li>
<li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2%2F3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+crisis%3A+Blame+it+on+the+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+News%22%5BJournal%5D)">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li>
<li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li>
<li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).</li>
<li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769(2014).</li>
<li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive%2C+real-time+assays+of+helicase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li>
<li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF165%29.+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li>
<li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2%2F3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+%28Adhiron%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).</li>
<li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affimer+proteins+for+F-actin%3A+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).</li>
<li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li>
</ol>

재조합 kmUTAG 시 약은 Kerafast.com를 통해 연구 공동체에 제공 된다.

여기에서 우리는 고정 포유류 세포에서 스모의 기능적 연구를 위한 재조합 단백질 인 kmutag-fl의 사용을 소개 하 고, 선 충 생식 기를 해 부 한다. KmUTAG-fl은 기본 스모 컨 쥬 게이 터 단백질과 스모 체인을 인식 하 고 트래핑 하는 스트레스를 견 디는 팬 스모 특정 시 약입니다. 스모의 3 차 구조는 고도로 보존 되어 있기 때문에 추가 모델과 비 모델 시스템에서 스모 변형이 kmUTAG-fl 시 약으로 분석 될 수 있는 가능성이 매우 높습니다. 이와 같이, KmUTAG-fl은 전통적인 항 체 염색 프로토콜을 위한 유용한 대안적인 또는 이차 시 약을 나타낼 수 있다.
탄수화물 검출을 위한 렉 틴 뿐만 아니라 단백질의 생체 내 라벨링을 위한이 머 티 드의 뉴클레오티드 및 아핀 펩타이드를 포함 한 비 항 체 대안의 사용에 대 한 충분 한 선례가 있다 16,17<su...

이 방법의 목적은 재조합 스모-포착 UTAG (ULp 도메인 태그) 단백질을 사용 하 여 스모 컨 쥬 게이 터 단백질의 연구 및 분석을 용이 하 게 하기 위한 것 이다. 아래에 설명 된 바와 같이, UTAG는 스모 변성 단백질을 정화, 검출 및 시각화 하기 위한 다른 시 약과 접근법을 대신 하 여 사용할 수 있습니다. 성장 조건에 따라 세포는 스모 또는 스모 사슬로 수정 된 수백 또는 수천 개의 단백질을 함유 할 수 있습니다 (검토를 위해 커 셔 외 20061 과 케르 셔 20162). 이것은 특정 스모 변성 단백질의 기능적 분석에 대 한 상당한 어려움을 나타내며, 특히 특정 수 모 닐 화 대상의 분 획만이 실제로3개 수정 되기 때문 이다. 전사 조절, 단백질 항상성, 세포 스트레스에 대 한 반응, 유사 분열 증 및 감수 분열 시 염색 질 리 모델링이 같은 필수적인 세포 과정에서의 역할에 더하여; 이제는 스모, 스모 변성 단백질, 스모 통로 성분이 암 및 퇴행 성 신경 장애 등의 병리학에 대 한 바이오 마커로 서 잠재력을가지고 있다는 것이 충분히 명백 해지고 있다4,5,6 ,7. 이는 다양 한 세포 및 샘플에서 스모 변성 단백질의 검출 및 기능적 분석을 위한 견고 하 고 안정적 이며 쉽게 사용할 수 있는 도구와 혁신적인 접근법의 필요성을 강조 합니다.
많은 시스템에서, 스모 특이 적 항 체는 스모 변성 단백질의 검출, 분리 및 기능적 분석을 위한 선택의 시 약 이다8,9. 그러나, 일부 상업적으로 입수 가능한 스모 특이 적 항 체는 비싸고, 수량 또는 가용성이 제한적 이며, 격렬 한 가변 친화도 및 교차 반응성을 나타내는 경향이 있으며, 일부 경우에는 재현성10이 결여 된다. 하나의 대안적 접근법은 형질 전환 된 세포 및 유기 체에서에 피토 프 태그 스모의 발현 이지만, 스모에 피토 프 태그를 연결 하는 것은 인위적으로 단백질 표적11에 대 한 그의 컨 쥬 게이 션을 낮출 수 있다. 추가적으로,에 피토 프는 형질 전환 되지 않은 세포 또는 조직이 평가 될 때 유용 하지 않다.
Ulp1는 스모 접합 단백질12를 모두 처리 하 고 모 전 구체를 공정 하 게 하는 s. 세레 비시 로부터 보존 된 스모 프로 테아 제 이다. 뜻밖 관찰에 기초한 UTAG 시 약을 개발 하 여 Ulp1's 스모 가공에 있어서의 촉매 시스테인 (C580S)의 돌연변이가 스모의 분열을 예방할 뿐만 아니라, 스모 접합 단백질을 높은 것으로 함정에도 조류 패12. 편의상이 카 르 복 시-말단 스모-트래핑 Ulp1 (C580S) 단편을 UTAG (UD 태그에 대 한 짧은) 라고 합니다. UTAG는 스모 변성 단백질의 분리 및 검출에 사용 되는 항 스모 항 체에 대 한 유용한 대안을 나타내는 재조합 범 스모 포획 단백질 이다. 특히 스모에는 하나 또는 여러 개의에 피토 프만이 아니라, 기본적으로 접힌, 공액 스모를 인식 하는 것이 중요 합니다. UTAG의 단백질 안정성과 스모 결합 강도를 모두 개선 하기 위해, 스트레스에 강한 효 모 근 종 균 (Km)에서 utag의 변형을 생성 했습니다. KmUTAG는 스모 컨 쥬 게이트를 나노 몰 친화도13으로 단단히 묶습니다. 또한, kmUTAG는 높은 온도 (42 ° c), 환 원제 (5mm carboxyethyl) 포스 핀 히드로 클로 라 이드 (변성 제), 산화 제 (0.6% 과산화 수소) 및 비 이온 성 세제에 내성이 있습니다. 이 응력 허용 오차는 가혹한 정화 조건 및 장기간의 인큐베이션 시간 동안에 유익 하 여 안정성과 스모 포착 활동을 보장 합니다. 그러나 놀랍게도 KmUTAG의 스모 포획 활동은 시스테인 변성 시 약, 이온 성 세제 및 완전히 변성 된 단백질 추출 물과 호환 되지 않습니다. KmUTAG의 현저한 친화도 및 특성은이 시 약이 여러 종의 수 모 화 단백질의 연구를 위한 표준 레 퍼 토리의 일부가 될 수 있음을 나타낸다.
여기에서 우리는 재조합 형광 mCherry-KmUTAG 융합 단백질 (kmUTAG fl)을 이용 하 여 포유류 세포 및 선 충에서 스모 변성 단백질을 검출 하는 간단한 방법을 제공 한다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003</td><td>마우스 단클론 항체 DPBS의 2차 항체로 사용</td></tr><tr><td>, 칼슘 없음, 없음 magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-485-146</td><td>마우스 단클론 항체의 2차 항체로 사용</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td><td>Fisherbrand</td><td>12545101</td><td></td></tr><tr><td>FLUORO-GEL II with DAPI</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50-246-93)</td><td></td></tr><tr>DABCO <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-02</td><td>를 사용한 1.11 FLUORO-GEL</td> 단계에서 매체 장착 <td>DAPI가 1 &micro에 추가됨; g/mL; 2.2.5 단계</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3815</td><td></td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>ACROS Organics</td><td>6000-43-7</td><td></td></tr><tr><td>KmUTAG-fl</td><td>Kerafast</td><td></td><td>KmUTAG 시약은</td></tr><tr><td>Kerafast.com Oneblock Western-CL 차단 완충액</td><td>Prometheus</td><td>20-313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 인산염 완충 식염수, 10X 용액</td><td>Fisher에서 사용할 수 있습니다. BioReagents</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>PNT2 세포주</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613</td><td>SV40으로 불멸화된 정상 전립선 상피.</td></tr><tr><td>pSPOT1</td><td>(ChromoTek GmbH)</td><td>ev-1</td><td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td></tr><tr><td>SUMO 6F2</td><td>DSHB</td><td>SUMO 6F2</td><td>SUMO 6F2는 Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td></tr><tr><td>SUMO 프로테아제 완충액 [10x]</td><td></td><td></td><td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>SUMO-2 항체 8A2</td><td>DSHB</td><td>SUMO-2 8A2</td><td>SUMO-2 8A2는 Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td></tr><tr><td>TCEP-HCL</td><td>GoldBio</td><td>51805-45-9</td><td>5mM Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>9002-93-1</td><td>DPBS/PBS(웜용)에서 0.1%에서 투과에 사용됨</td></tr></tbody></table>

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

여기에서 우리는 포유류 세포 및 네 마 테 ode 난 모에 있어서의 단백질의 수 모 화 및 그들의 하위 세포 국 소화를 연구 하는 신규 한 방법을 제시 하 고 있다. 이 방법은 변형 된 스모-포착 단백질 단편, kmUTAG, Ulp1 스모 프로 테아 제 로부터 유래 된, 스트레스 내성 신진 효 모 클 루 근 균을 활용 한다. 우리는 항 체를 사용 하지 않고 다양 한 모델 시스템에서 수 모 닐 화를 연구 하기 위한 목적으로 kmUTAG의 특성을 적용 했습니다. 스모의 연구에 대 한, KmUTAG 항 체 기반 접근 방식에 비해 몇 가지 이점이 있다. 이 스트레스에 강한 스모-포착 시 약은 재조합 적으로 생산 되며, 많은 종에서 자생 하는 스모이 소 양식을 인식 하 고, 시판 되는 항 체와는 달리 무료, 비 접합 스모에 대 한 친화도를 감소 보여줍니다. 여기에 표시 된 대표적인 결과는 포유류 조직 배양 세포 및 네 마 테 오드 모 난 모에 있어서의 스모 컨 쥬 게이트의 국 소화를 포함 한다.

KmUTAG-fl은 재조합, mCherry 태그 스모 포획 단백질. KmUTAG-fl을 생산 하기 위해, 코 돈에 최적화 된 mCherry-kmUTAG를 pSPOT1 세균과 발현 플라스 미드에 클로닝 하였다 (도 1). 유도 후, kmUTAG-fl 단백질을 스팟 트랩에 정제 하 고, 용 출 하 고, 추후 사용 될 때까지 냉동 시켰다. KmUTAG fl의 스모 포획 활동을 보장 하기 위해, SUMO1 융합 단백질의 침전 및 강 우에 대 한 결합을 확인 했습니다 (데이터는 표시 되지 않았지만 이전 작업13참조).
고정 된 PNT2 세포로 배양 한 KmUTAG-fl-자이 스 Axioplan 현미경에 대 한 적절 한 필터 세트 (크로마) 및 100 배 유 액 침 목표를 사용 ...

스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

이 프로토콜의 중요성은 다양한 진핵 세포에서 단백질 수정자 SUMO의 검출을 위한 새로운 형광 SUMO-트래핑 UTAG 단백질의 사용이다. 이 기술의 주요 장점은 포유류 조직 배양 및 선충 고나드를 포함한 다양한 세포에서 SUMO의 항체 없는 검출을 위한 간단한 프로토콜이다. SUMO는 암 과 신경 퇴행성 질환에서 중요한 역할을하며, 이것은 SUMO 변형 단백질의 검출 및 기능 분석을위한 견고하고 신뢰할 수있는 도구의 필요성을 강조합니다.SUMO는 매우 보존되기 때문에 형광 수모 트래핑 UTAG 단백질을 사용하여 다양한 유기체에서 공액 수모를 라벨로 지정할 수 있습니다. 이 비디오는 포유류 세포에서의 사용을 보여줍니다. 또한 전체 텍스트에서는 선충 난모세포에서의 사용을 설명합니다.이 기술의 시각적 데모는 염색 및 SUMO 검출 전에 세포의 치료에 대한 중요한 힌트를 제공합니다. 시작하려면, 70 ~ 80 %의 컨할 때까지 6 웰 TC 플레이트에서 22 밀리미터 둥근 커버 슬립에 선택의 조직 배양 세포를 성장. DPBS의 1 밀리리터로 세포를 간략하게 씻으시면 됩니다.세포를 고치려면 각각 4%의 PFA와 DPBS의 2밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 세포를 배양하십시오. 플레이트를 누두하는 동안 DPBS의 1 밀리리터에서 5 분 동안 고정 된 세포를 세 번 씻으면 하십시오.세포를 과소화하려면 DPBS에서 1%트리톤 X-100으로 15분 동안 배양합니다. 이전과 같이 세포를 다시 씻으십시오. 10 초 동안 1 어금니 글리신 HCL pH 2의 500 마이크로 리터로 세포를 배양합니다.그런 다음 10X SUMO 프로테제 버퍼 또는 SPB의 500 마이크로리터로 pH를 즉시 중화시합니다. 이전과 같이 세포를 세척 한 후, 우물에서 덮개 전표를 제거하고 습도 챔버에 배치합니다. UTAG-FL 염색 전용의 경우 UTAG-FL 의 마이크로그램 1개에 튜브에 5밀리머 TCEP를 함유한 1X SPB 100마이크로리터를 혼합합니다.그런 다음, 피펫커버 슬립의 셀에 혼합하고 습도 챔버에서 1 시간 동안 실온에서 배양한다. 커버 슬립을 세척하려면 각 커버 슬립에 DPBS 의 파이펫 200 마이크로 리터를 놓고 10 분 동안 제자리에 둡니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다.마지막 세척에서 커버 슬립을 제거하고 장착 매체의 드롭과 미리 청소 현미경 슬라이드에 반전. 현미경으로 보기 전에 하룻밤 동안 섭씨 20도 냉동고에 샘플을 저장합니다. DAPI 및 텍사스 레드에 적합한 필터 세트를 사용하여 셀을 시각화합니다.SUMO 및 고정 선충 고라드에 라벨을 붙이는 방법에 대한 프로토콜에 대한 전체 텍스트를 참조하십시오. 포유류 세포를 표시하는 것은 아주 간단합니다, 선충 난모세포를 표시하는 것은 gonad 해부에서 사전 훈련이 필요합니다. 고정 PMT2 세포로 인큐베이션된 KmUTAG-FL은 뚜렷한 핵 염색을 보였다.확산 핵 염색과 뚜렷한 핵 포시가 모두 눈에 띄어졌다. 원자력 국산화는 DAPI와 공동 염색을 사용하여 확인되었다. KmUTAG-FL의 SUMO 트래핑 활동과 일치하여 핵 국소화 패턴은 SUMO23 염색을 연상시킵니다.항 SUMO23 8A2 항체와 공동 염색하면 SUMO23 신호와 KmUTAG-FL의 공동 국소화를 확인했습니다. 이것은 포유류 세포에서 SUMO23을 검출하기 위하여 KmUTAG-FL의 효험을 검증합니다. 난구를 생산하는 성인 헤르마플로디테 c에서 분리 된 고나드.아레간 선충은 항 SUMO 항체로 표지되었다. 이전 보고서와 일치, 항 SUMO 항체는 처음에 후기 근막 성 프자상 난모세포의 핵 플라스엠에 국한. 그런 다음 핵 봉투가 고장나면서 쌍이 있는 동종로의 중앙 고리 단지로 재분배되고 염색체가 메타위상 판을 향해 모았다.병렬 준비에서 KmUTAG-FL으로 표시된 생식선은 비슷한 패턴을 드러냈습니다. KmUTAG-FL은 핵봉투 분해 과정을 시작하고 완료함에 따라 핵표지에서 링 컴플렉스에 집중하는 것으로 전환했습니다. 이러한 결과는 KmUTAG-FL을 c에서 근시 및 SUMO 관련 프로세스의 분석을 위한 유용한 도구로 검증합니다.예인대와 아마도 다른 선충. 고정을 수행하는 동안, 신선한 파라포름알데히드와 짧은 고정 시간을 사용하여 KmUTAG에서 인식할 수 있도록 SUMO를 기본적으로 접지하는 것이 중요합니다. SUMO의 고등 구조는 매우 보존되어 있기 때문에 KmUTAG-FL 시약으로 추가 모델 및 비모델 시스템의 SUMO 변형을 분석할 수 있습니다.현재, 우리는 이 새로운 형광 수모 트래핑 UTAG 단백질을 사용하여 세포 스트레스 시 SUMO의 기능을 연구하고 있습니다. 마지막으로, 고정 파라포름알데히드를 사용하는 모든 단계는 실험실 안전 후드에서 수행되어야하며이 시약은 올바르게 폐기해야합니다.

localization-sumo-modified-proteins-using-fluorescent-sumo-trapping

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.

SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기서, 우리는 스모 결합 엔티티(SUBEs)를 사용하여 인간 간종 세포및 간 종양으로부터 수득된 인간 간종 세포 및 간 종양모두에서 SUMO에 의해 변형된 단백질을 풍부하게 하고, 분리하고, 식별하고, 특성화하는 프로토콜을 제시한다.

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

배우세요 항체 없이 SUMO 변성 단백질을 검출하는 kmUTAG 형광 단백질 포착 기법을 이용한 세포 생물학 연구 방법입니다. 이 기술은 암과 신경퇴행성 질환에서 SUMO의 역할을 이해하는 데 활용됩니다.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

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