Name: 힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 학습하세요 뮤린 후지 허혈 모델에서 혈관 신생 치료제의 기능적·조직학적·분자적 효과를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 임상 적용 가능성을 가진 혈관 신생 요법 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 호세 리노와 타니아 카르발호, 생물 이미징 시설의 머리와 인스티투토 드 메디치나 분자 주앙 로보 Antunes의 조직학 및 비교 병리학 연구소의 머리, 각각 감사합니다. 우리는 또한 노바 의과 대학 / Faculdade 드 Ciências 메디카스, 유니버시 다드 노바 드 리스보아의 해부학학과에서 Vyacheslav Sushchyk 감사합니다.
자금 지원 참조: UID/IC/0306/2016 Fundação 파라 a Ciência e a Tecnologia에 의해 투자된 프로젝트. 폴라 드 올리베이라는 Fundação 파라 아 시에엔시아 e 테크놀로지아에서 펠로우십(SFRH/BD/80483/2011)에 의해 지원됩니다.

모든 동물 절차는 지침 2010/63/EU에 따라 되며 기관 동물 복지 기구의 승인을 받았으며 포르투갈 동물 보호 당국인 DGAV의 허가를 받았습니다(면허 번호 023861/2013).
주의: 프로토콜에 사용된 몇몇 화학물질은 독성이 있고 유해합니다. 모든 적절한 안전 관행 및 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트, 전신 바지, 발가락 신발)를 사용하십시오.
1. 뒷다리 허혈의 뮤린 모델
참고: 모든 실험은 22주 된 C57BL/6 암컷 마우스에서 수행됩니다.
<ol><li>솔루션 준비
	<ol>
<li>
마취 액의 준비 참고 : 이 마취 제 조합 (메데토미딘과 케타민)은 최대 30 분 의 고정 및 15 분의 수술 기간을 제공합니다. 효과는 아티파메졸의 투여에 의해 되돌릴 수있다.<ol>
<li>깨끗한 1cc 주사기로 메데토미딘 1 mL (1 mg / Kg 체중)을 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.</li>
			<li>깨끗한 1 cc 주사기로 케타민 (75 mg / Kg 체중)의 0.75 mL를 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 메데토 미딘을 포함하는 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.</li>
			<li>마취 용액 10 mL을 얻기 위해 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)의 8.25 mL를 추가하십시오.</li>
			<li>화합물의 이름, 혼합 날짜 및 만료 날짜로 튜브를 식별합니다.</li>
			<li>4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
진정 제 용액의 준비
		<ol>
<li>깨끗한 1 cc 주사기로 아티파메졸 (5 mg / Kg 체중)의 1 mL을 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.</li>
			<li>10 mL의 회귀 용액을 얻기 위해 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)의 9 mL를 추가하십시오.</li>
			<li>화합물의 이름, 혼합 날짜 및 만료 날짜로 튜브를 식별합니다.</li>
			<li>4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
수술 후 진통 용액의 준비
		<ol>
<li>깨끗한 1 cc 주사기로 0.5 mL의 부프레노르핀 (100 μL / 15-30g 체중)을 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.</li>
			<li>진통 용액 10 mL을 얻기 위해 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)의 9.5 mL를 추가하십시오.</li>
			<li>화합물의 이름, 혼합 날짜 및 만료 날짜로 튜브를 식별합니다.</li>
			<li>4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>뒷다리 허혈의 외과 유도
	<ol>
<li>이 내정간섭을 위해 필요한 외과 공구: 뾰족한 집게, 봄 가위, 안과 바늘 홀더, 외과 가위 및 바늘 홀더. 사용하기 전에 오토클레이브의 모든 수술 도구를 소독하십시오. 피하 지방의 해부에 면봉을 사용하십시오.</li>
		<li>마우스를 잡기 전에 마취 용액으로 주사기를 로드하십시오.</li>
		<li>마우스가 움직이지 않도록 가능한 한 많은 피부를 잡고, 케이지의 격자에 대한 귀 뒤에 힘을 가하여 동물을 억제하십시오.</li>
		<li>머리를 내리면 동물을 기울이고 마취 용액의 복강 내 주사를 수행하여 주사기를 마우스 몸체와 45 ° 각도로 유지하십시오.</li>
		<li>마취의 깊이를 평가하기 위해 페달 철수 반사의 부재를 확인하십시오.</li>
		<li>전기 면도기로 오른쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거합니다. 피부 준비를 위해 클로르헨시딘 소독비누 스크럽을 사용하십시오. 깨끗한 종이 타월을 사용하여 비눗물제거합니다. 클로르헨시딘 수술 용 스크럽을 적용하고 수술 멸균 스위트로 마우스를 운반하기 전에 멸균 드레이프로 피부 영역을 보호합니다.</li>
		<li>등지 방수에 동물을 놓고 네 개의 사지가 떨어져 테이프로 고정으로 억제. 주의: 동물의 체온을 안정적으로 유지하기 위해 가열 된 패드에서 절차를 수행하십시오. 외과 적 절차는 10 배 또는 20 배율에서 해부 현미경을 사용하여 수행됩니다.</li>
		<li>멸균 거즈를 사용하여 클로르헨시딘 살균 용액을 적용하여 피부 준비를 마무리하십시오. 11번 수술을 이용한 메스블레이드는 오른쪽 뒷다리의 허벅지를 덮어도 1cm 피부 절개를 수행한다.</li>
		<li>무딘 해부 피하 지방은 신경 혈관 번들을 노출. 뾰족한 집게, 봄 가위 및 안과 바늘 홀더를 사용하여, 말단 외부 불퇴증 및 대퇴 혈관을 드러내기 위하여 membranous 일리오 대퇴 칼집을 엽니다.</li>
		<li>혈관 (동맥및 정맥)을 신경에서 해부하고 분리하십시오. 7.0 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 말단 외부 장골 동맥 및 정맥 및 말단 대퇴 동맥 및 정맥을 리게이트한다.</li>
		<li>봄 가위로 말단과 근위 매듭 사이의 일리오 대퇴 동맥과 정맥의 세그먼트를 변환합니다.</li>
		<li>흡수성 봉합사(예: 5.0 Vicryl 봉합사)로 절개를 닫습니다.</li>
		<li>주사기를 진정 방지 용액으로 적재하고 1.2.3 및 1.2.4에 자세히 설명된 동일한 방법을 사용하여 진정 방지 용액의 복강 내 주입을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 후 모니터링 참고 : 동물은 모든 동물이 진정 제에서 잘 회복되도록 하기 위해 15-20 분마다 주의 깊게 관찰됩니다. 마취 된 동물은 방치되지 않습니다.<ol>
<li>마취에서 회복을 평가 : 1) 호흡의 속도와 깊이를 모니터링; 2) 동물 반사 (페달 및 눈 위치) 평가</li>
		<li>수술 후 진통의 피하 주사를 8-12 시간마다 수행하십시오.</li>
		<li>수술 후 동물의 건강 상태와 수술 부위 외관에 대한 간략한 설명을 기록한 후 매일 동물을 모니터링하고 모든 봉합사가 닫혀 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>절개가 발생하면 절개를 다시 봉합하십시오. 성공하지 못하면 절개 부위에 피부 장벽 필름을 적용하여 소변, 배설물 배설물, 피부의 마찰 및 전단을 보호하고 치유 과정을 돕습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 혈관 신생 효과의 평가
참고 : 허혈 유도 후 연구에 치료제를 적용하고 다음과 같은 절차를 달성하십시오. 다른 시점에서 수행되는 단계는 해당 섹션에서 자세히 설명합니다.
<ol><li>레이저 도플러 관류 이미징
	<ol>
<li>전기 면도기와 제모 크림을 사용하여 분석하기 하루 전에 양쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거하십시오.</li>
		<li>마취 용액을 사용하여 마우스를 마취.</li>
		<li>동물을 37°C 가열 패드에 5분 동안 놓아 서 시술 중에 온도가 변하지 않도록 하십시오.</li>
		<li>다리를 확장된 위치에 고정하여 동물을 척추 위치에 놓습니다. 동물의 위치가 시간이 지남에 따라 뒷다리 관류의 변화를 따르기 위해 절차를 반복해야 할 때마다 유사해야하기 때문에 각 동물의 오른쪽 다리와 왼쪽 다리와 발 사이의 거리를 측정합니다.</li>
		<li>레이저 도플러 관류 이미저를 사용하여 데이터 수집을 시작합니다.</li>
		<li>취득이 완료되면, 반대로 진정제 해결책으로 마취를 되돌리.</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어를 열고 허혈성 뒷다리 주위의 관심 영역(ROI)과 비허혈 뒷다리 주위의 유사한 ROI를 그립니다.</li>
		<li>플럭스 값을 관찰하고 비 허혈성 사지에서의 관류의 비율로 관류를 결정한다. 관류 비율의 변화는 시간이 지남에 따라 측정됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>면역화학 및 모세관 밀도 분석
	<ol>
<li>마취 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생하십시오.</li>
		<li>두 다리의 위천혈을 수확하려면 먼저 양쪽 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.</li>
		<li>아킬레스 건을 식별하고 11 블레이드 메스를 사용하여 뼈에서 힘줄을 분리.</li>
		<li>아킬레스 건을 잡고 봄 가위로 무릎 관절까지 경골과 비골에서 근육을 분리.</li>
		<li>이두근 femoris위프근육과 분리하십시오.</li>
		<li>무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 잘라 봄 가위를 사용합니다.</li>
		<li>수확 한 위장 근육을 10 % 트라가 칸스의 도움으로 작은 코르크 디스크에 가로 방향으로 놓습니다.</li>
		<li>액체 질소 냉각 isopentane에 표본을 동결 하 고 절편 될 때까지 -80 °C에서 그들을 저장 합니다.</li>
		<li>저온 극저온에 근육 표본의 7 μm 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 마운트합니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
		<li>유리 슬라이드를 -20°C에서 10분 동안 냉각된 순수 아세톤(약 50mL)을 함유한 병에 고정합니다.</li>
		<li>메탄올(50 mL)에 희석된 수소 과산화효소를 실온에서 30분 동안 첨가합니다.</li>
		<li>총 10분 동안 인산완식염수(PBS)(50 mL)로 두 번 씻으소서.</li>
		<li>섹션 주위에 소수성 펜을 사용합니다. 참고: 소수성 펜을 사용하면 프로토콜 중에 소비되는 솔루션의 양을 줄일 수 있습니다. 모든 인큐베이션의 경우 섹션당 모든 용액의 100 μL을 사용하십시오.</li>
		<li>실온에서 30분 동안 PBS에 5% 토끼 혈청의 차단 용액을 적용합니다.</li>
		<li>PBS에서 1% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 1 :500에서 희석 된 항 CD31 래트 단일 클론 항체로 실온에서 1 시간 동안 표본을 배양합니다.</li>
		<li>총 30분 동안 PBS에서 세 번 씻으소서.</li>
		<li>PBS에서 1% BSA에서 1:200에 이차 생체생물 토끼 항-래트 IgG 항체를 추가하고 실온에서 30분 동안 5% 토끼 혈청을 첨가한다.</li>
		<li>이전과 같이 PBS에서 세척하고 실온에서 30 분 동안 라벨이 부착 된 아비딘 컨쥬게이드 퍼옥시다아제 복합체를 추가하십시오.</li>
		<li>PBS에서 3회 5분 간 헹구고 디아미노벤지딘(DAB) 과산화아제 기판 키트를 5분 더 추가합니다.</li>
		<li>장착하기 전에 10s동안 헤마톡슬린으로 섹션을 반염색합니다.</li>
		<li>각 시편에서 4개의 별개의 해부학 영역의 2개의 다른 단면도에서 수직 밝은 필드 현미경 (즉, 근세포 의 수 당 모세관의 수)를 사용하여 모세관 밀도를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조영제 관류
	<ol>
<li>마취 용액을 사용하여 마우스를 마취.</li>
		<li>숫자 15 메스 블레이드를 사용하여 중간 개복술을 수행합니다.</li>
		<li>복부 대원과 꼬리 정맥 카바를 측면으로 후퇴시키고 봄 가위를 사용한 후 노출하십시오.</li>
		<li>26-게이지 카테터를 복부 대강에 넣고 다른 카테터를 같은 방향으로 코그나 카바에 삽입합니다.</li>
		<li>5/0 실크 봉합사를 사용하여 카테터를 고정하여 체류 봉합사를 수행하십시오.</li>
		<li>헤파린을 함유한 37°C 식염수(500 단위/100 mL)로 혈관 시스템을 10 mL 주사기를 사용하여 복부 대동맥으로 밀어 넣습니다. 뚜렷한 용액이 카테터에서 나올 때까지 부드러운 관류를 계속하십시오. 참고: 일반적으로 30 받는 사람의 하혈 식염수용의 성인 쥐의 혈관 시스템을 헹구는 데 필요한.</li>
		<li>아데노신 (1 mg/L)과 파파베린 (4 mg/L)을 2 분 동안 혼합하여 투여하십시오.</li>
		<li>황산 바륨 과 5 % 젤라틴의 혼합물의 대동맥 카테터 10 mL에 주입. 참고: 용액은 두꺼워지지지기 위해 60°C로 보관해야 합니다.</li>
		<li>마우스를 적어도 4 시간 동안 4°C에서 방치하고, 혈관 캐스트가 고형화되도록 한다.</li>
		<li>각 마우스의 하체에서 피부를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다이아포화 - 스패테홀츠 기술
	<ol>
<li>적어도 72 시간 동안 10 % 포름알데히드 용액에 침지하여 마우스를 고정시.</li>
		<li>마우스를 30% 과산화수소 용액에 침지하여 24시간 동안 표백하였다.</li>
		<li>동결 치환 기술을 사용하여 마우스를 탈수한다. 이 방법론은 마우스를 각각 24 시간 동안 20 °C에서 순수한 아세톤의 연속적인 통로 (평균 4)에 제출하는 것으로 구성됩니다.</li>
		<li>100% 벤질 벤조에이트 및 100% 메틸 살리실산염을 3:5 비율로 함유하는 용액에 침지하여 마우스를 명확히 한다(이 혼합물은 또한 스패테홀즈 용액이라고도 함) 13.</li>
		<li>일반적으로 5~7일이 걸리는 다이어프란이 될 때까지 스페이톨즈 용액내부에 침지된 마우스를 진공 챔버에 두십시오.</li>
		<li>시편이 명확해지기 전에 어두워지면 용액을 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>부수적인 선박 정량화
	<ol>
<li>스테레오택시 현미경을 사용하여 트랜스일루미네이션 하에 Spalteholz 용액에 매달린 마우스를 관찰하십시오. 미세 수술 집게를 사용하여 부드럽게 잡고 이동하십시오.</li>
		<li>현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용하여 팔다리 전체를 촬영합니다.</li>
		<li>적절한 소프트웨어를 사용하여 전체 팔다리 사진을 가져옵니다.</li>
		<li>적절한 소프트웨어를 사용하여 부가 용기의 수동 세분화를 강조 표시합니다. 참고: 담보 용기는 대퇴, 사페누스 및 포퓰리터 동맥 및 모든 정맥 구조를 제외한 직경이 20~300 μm인 Longland의 정의, 정의된 줄기, 중간 지대 및 재진입에 따라 정의됩니다.</li>
		<li>수술 폐색을 둘러싸고 아래인 adductor의 동일한 해부학 영역에서 모든 마우스에서 ROI를 정의합니다.</li>
		<li>총 사지 면적의 20%에 해당하는 상응하는 ROI로 부수적 용기 밀도(CVD)를 정량화합니다. CVD는 혈관 영역과 ROIs 영역 간의 비율로 계산됩니다. 모든 밀도 측정은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 참고: 각 마우스에 대한 비 허혈성 사지의 CVD 값은 해부학, 관류 또는 대각선 화 절차의 변화를 배제하기 위해 100 %에 해당하는 것으로 가정됩니다. 허혈성 사지에서의 CVD 백분율은, 따라서, 비허혈성 하나에 대하여 계산되었다.</li>
		<li>허혈성 및 비허혈성 사지 사이의 CVD 백분율 간의 차이로 CVD 증가의 백분율을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모세 혈관의 레이저 캡처 미세 해부
	<ol>
<li>마취 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생하십시오.</li>
		<li>두 다리의 위천혈 근육을 수확하려면 쥐의 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.</li>
		<li>아킬레스 건을 식별하고 11 블레이드 메스를 사용하여 뼈에서 힘줄을 분리.</li>
		<li>아킬레스 건을 잡고 봄 가위로 무릎 관절까지 경골과 비골에서 근육을 분리.</li>
		<li>이두근 femoris위프근육과 분리하십시오.</li>
		<li>무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 잘라 봄 가위를 사용합니다.</li>
		<li>수확 된 위장 근육을 10 % tragacanth의 도움으로 작은 코르크 디스크에 가로 방향으로 놓습니다.</li>
		<li>액체 질소 냉각 isopentane에 표본을 동결 하 고 절편 될 때까지 -80 °C에서 그들을 저장 합니다.</li>
		<li>근육 시편의 저온 극저온 12 μm 섹션에 잘라 유리 슬라이드에 장착. 참고 : RNA 보호를 위해 미리 냉각 된 슬라이드를 가지고 손가락 (장갑)으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 섹션을 배치하기위한 영역만 따뜻하게하십시오. 저온 유지 법에서 절충된 부위를 접촉하여 저온 유지 를 2-3 분 동안 저온 유지 에서 -20°C에서 건조시. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.<ol>
<li>유리 슬라이드를 -20°C에서 5분간 냉각된 순수 아세톤(약 50mL)을 함유한 병에 고정하고 공기 건조시.</li>
			<li>섹션 주위에 소수성 펜을 사용합니다. 참고: 소수성 펜을 사용하면 프로토콜 중에 소비되는 솔루션의 양을 줄이는 데 도움이 됩니다. 모든 인큐베이션의 경우 섹션당 모든 용액의 100 μL을 사용하십시오.</li>
			<li>4°C에서 2M NaCl/PBS로 수분을 공급하고 2M NaCl/PBS에서 1:500에서 항 CD31 래트 모노클로날 항체로 4°C에서 밤새 시편을 배양합니다.</li>
			<li>총 6분 동안 2M NaCl/PBS에서 두 번 씻으소서.</li>
			<li>2M NaCl/PBS에서 1:200에서 이차 생체생물 토끼 항-래트 IgG 항체를 넣고 4°C에서 30분 동안 5% 토끼 혈청을 첨가합니다.</li>
			<li>이전과 같이 2 M NaCl/PBS로 세척하고 4°C에서 30분 동안 라벨이 부착된 아비딘 컨쥬게이트 퍼옥시다아제 복합체를 첨가합니다.</li>
			<li>DAB 퍼옥시다아제 기판 키트를 5분 동안 헹구고 추가합니다.</li>
			<li>얼음차가운 90 % 에탄올에 섹션을 탈수 한 다음 100 % 에탄올을 건조하게하십시오.</li>
			<li>펄스 고체 355 nm 레이저를 갖춘 레이저 미세 해부 시스템을 사용하여 마우스 당 10 000 모세 혈관을 해부하고 해부 된 모세 혈관을 마이크로 퍼지 튜브 접착제 캡으로 투석합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>RNA 추출, cDNA 합성, 사전 증폭 및 RT-PCR
	<ol>
<li>적절한 키트를 사용하여 미세 제해된 모세혈관으로부터 총 RNA를 분리하고, 얻어진 총 RNA는 1.5-3 ng/μL 사이이다.</li>
		<li>표1에 기재된 프라이머를 사용하여 합성 및 사전 증폭의 두 라운드를 위해 cDNA 합성 키트를 사용한다.</li>
		<li>이전 단계에서 설명한 것과 동일한 대상에 대해 RT-PCR을 수행합니다. 95°C에서 10분 동안 초기 변성 단계로 구성된 프로그램을 사용하고, 15s의 경우 95°C에서 50사이클, 1분 동안 60°C에서 사용한다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li>
<li>Brevetti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+hyperemia+unmasks+regional+blood+flow+deficit+in+experimental+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia.</a> Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).</li>
<li>Ministro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+ionizing+radiation+induces+therapeutic+neovascularization+in+a+pre-clinical+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia.</a> Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).</li>
<li>Pereira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+induced+by+human+umbilical+cord+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+a+murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia.</a> Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145(2016).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

CLI의 뮤린 모델은 대부분 프로펀다 페모리스 4,5,6,7,8,9의 기원에 불과한 대퇴동맥의 결찰로 이루어져있다. 이것은 7 일 9안에 사지에 혈류량을 복구하는 부수적인 순환의 대부분을 그대로 두는 것을 보여주었습니다. 부수적 인 침대의 제거는 대퇴 동맥의 절제에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 원래 혈류량의 3 분의 1까지 는 대부분의 부수적인 혈관이 내부 장골 동맥 7에서 발생한다는 것을 감안할 때 시술 후 7 일 이내에 즉시 회복 될 수 있습니다. Lejay 외는 일반...

말초 동맥 질환 (PAD)은 주로 더 낮은 사지에 영향을 미칩니다. PAD는 동맥 경화증, 하반신의 혈류에 심각한 제한을 일으킬 수있는 동맥폐쇄에 의해 발생 1. 간헐적 파행은 PAD의 첫 번째 징후이며 걸을 때 근육 통을 말합니다. CLI는 PAD의 가장 가혹한 단계, 허혈성 나머지 통증, 궤양 또는 회지2를 보여주는 환자에서 진단되고. CLI를 가진 환자는 절단의 고위험이 있습니다, 치료되지 않는 경우에 특히3. 더 낮은 사지 revascularization (개천 수술 또는 혈관 내 절차에 의해) 현재 사지 회수를 달성하는 유일한 방법입니다. 그러나, CLI 환자의 약 30%는 병변의 위치, 동맥 폐색의 패턴 및 광범위한 동반변을 포함하는 이유로 이러한절차에 적합하지 않습니다 4,5. 그러므로, 혈관신생의 승진이 더 강렬한 조사에서 전략인 것과 더불어, 이 그렇지 않으면 치료할 수 없는 환자를 위해 새로운 치료가 필요합니다.
인간에서 테스트하기 전에 생체 내 새로운 치료법의 효과와 안전성을 동물 모델에서 고려해야 합니다. 몇몇 모형은 CLI의 연구 결과를 위해 개발되었습니다, 주로마우스6,7,8,9,10에있는 뒷다리 허혈 (HLI)를 유도하 여. 그러나, 이 모형은 결찰및/또는 절제되는 동맥의 본질 및 및 주위정맥 및 신경이 또한 6,7,8, 해부되는지 의 여부를 포함하여 몇몇 양상에서 다릅니다 9,10. 종합하면, 이러한 양상은 각 동물의 허혈 재관류 손상의 중증도에 영향을 미치므로 결과를 비교하기가 어렵습니다. 따라서, 허혈을 유도하는 절차와 다른 표적의 평가를 표준화하여 주어진 혈관신생 치료가 효과적일 지 여부를 평가하는 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 모든 측면을 커버하도록 설계된 실험 프로토콜은 혈관 신생 치료가 효과를 발휘하는 메커니즘과 각 결과에서 효능의 측정을 포괄적으로 이해할 수 있습니다. 우리 팀에 의해 최근에 간행된 2개의 명백한 일은 좋은 보기11,12,치료 혈관신생을 유도하기 위하여 다른 접근이 이것에 더 상세히 기술될 것이다 동일 프로토콜을 사용하여 평가되었다는 것을 프로토콜.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 CLI의 효과를 모방하고 가양성 혈관 신생의 기능적, 적학적 및 분자 적 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 실험 기반을 마련 할 수있는 재현 가능한 실험 모델을 설명하는 것입니다. 에이전트.

<table><tbody><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR</td><td>응용 바이오시스템</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>머크</td><td>1000141000</td><td>시약; 주의 - 고인화성</td></tr><tr><td>아데노신</td><td>발데팜</td><td></td><td>시약</td></tr><tr><td>아티파메졸</td><td>오리온제약</td><td></td><td>시약</td></tr><tr><td>황산바륨(마이크로불페이크)</td><td>Guebert</td><td>8671404(ref. Infarmed)</td><td>시약</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>리히터제약</td><td></td><td>시약</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Opmi-1 FC 수술 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경, 독일</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>cDNA RT2 PreAMP cDNA 합성 키트</td><td>Qiagen</td><td>7335730</td><td>시약</td></tr><tr><td>저온 유지 장치 Leica CM Leica</td><td>Microsystems</td><td>3050S</td><td>기기</td></tr><tr><td>DAB peroxidase 기판 키트</td><td>DAKO; Vector Laboratories</td><td>K3468</td><td>시약</td></tr><tr><td>, 수소 과산화효소</td>, <td>Merk</td><td>1072090250</td><td>시약; 주의 - nocif</td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>Dako</td><td>411121</td><td>시약; 주의 - 독성</td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>Richterpharma</td><td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td><td>시약</td></tr><tr><td>레이저 도플러 관류 이미저 moorLDI2-HIR</td><td>MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td><td>5710</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Leica DM2500 정립 명시야 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Medetor</td><td>Virbac</td><td>037/01/07RFVPT</td><td>시약</td></tr><tr><td>메탄올</td><td></td><td>VWR UN1230</td><td>시약; 주의 - 독성 및 인화성이 높은</td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Labesfal</td><td></td><td>시약</td></tr><tr><td>Pentano Isso</td><td>Merk</td><td>1060561000</td><td>시약; 주의 - 고인화성</td></tr><tr><td>Power SYBR&reg; Green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>시약</td></tr><tr><td>정제 쥐 안티 마우스 CD31</td><td>Pharmingen</td><td>550274</td><td>시약</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>시약</td></tr><tr><td>Surgic-Pro 6.0</td><td>Medtronic (Coviden)</td> <td>VP733X</td><td>봉합사</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG)</td> <td>Vectastain ABC 키트; Vector Laboratories</td><td>PK-4004</td><td>시약</td></tr><tr><td>Vicryl5.0 / Vicryl 6.0</td><td>Medtronic (Covidien)</td> <td>UL202 / UL101</td><td>봉합</td></tr>사 <tr><td>Zeiss PALM MicroBeam 레이저 미세 해부 시스템</td><td>Carl Zeiss 현미경, 독일</td><td>1023290916</td><td>기기</td></tr><tr><td>입체 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경, 독일</td><td></td><td>기기</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Linux</td><td></td><td>악기</td></tr></tbody></table>

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

중요한 사지 허혈은 (CLI) 더 낮은 사지 절단의 고위험을 수반하는 심각한 상태입니다. 금 표준 치료인 재혈관화에도 불구하고, 상당수의 CLI 환자는 외과적 또는 혈관내 혈관 혈관 혈관 혈관 화에 적합하지 않습니다. 혈관 신생 치료는 이 환자를 위한 선택권으로 나오고 있습니다 그러나 현재 조사되고 있습니다. 인간에 있는 신청의 앞에, 그 치료는 동물 모형에서 시험되어야 하고 그것의 기계장치는 명확하게 이해되어야 합니다. 뒷다리 허혈 (HLI)의 동물 모델은 쥐에서 말단 외부 불역및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제에 의해 개발되었습니다. 기능, 기능학 및 분자 수준에서 허혈 및 가용 혈관 신생 요법의 효과를 평가하기 위해 포괄적 인 테스트 패널이 모였습니다. 레이저 도플러는 관류의 유량 측정 및 기능적 평가에 사용되었다. 조직 반응은 위장근육의 조직학적 섹션상에서 항 CD31 항체로 염색한 후 모세관 밀도를 분석하고 대각선 화 후 부수적인 혈관 밀도를 측정하여 평가하였다. 혈관신생 유전자의 발현은 쥐 위장관 근육으로부터 레이저 포획 미세내부를 포착한 후 내피 세포(ECs)에서만 선택된 혈관신생 인자를 대상으로 RT-PCR 표적화에 의해 정량화되었다. 이 방법은 허혈성 및 비 허혈성 사지 사이 그리고 처리되고 처리되지 않은 사지 사이 다름을 확인하는 에서 민감했습니다. 이 프로토콜은 CLI의 재현 가능한 모델과 혈관 신생 요법을 테스트하기위한 프레임 워크를 제공합니다.

기재된 프로토콜을 사용하여, 탯줄 중간엽 줄기 세포 및 저용량 이온화 방사선(LDIR)을 가설 혈관신생 요법으로 시험하였다 11,12. 레이저 도플러 관류 판독값은 허혈 유도 전과 허혈 유도 직후부터 허혈 후 45일까지 미리 지정된 시점에서 수득하였다. 레이저 도플러에 의한 조직 관류 수치는 색으로 구분된 이미지로 기록되었으며, 관류는 진한 파란색으로 표시되지 않고 가장 높은 관류 수준은 빨간색으로 표시되었습니다.  도 2A 및 3A에 도시된 바와 같이, 도 2B 및 3B에서정량화하고, 뒷다리 허혈의 유도 직후 모든 마우스에서 힌달보 관류의 완전한 손실이 관찰되었고, 뒷다리 허혈을 유도하기위한 기술의...

여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

이 실험의 전반적인 목표, 우리의 뒷다리 허혈 모델은 실험이 putative 혈관 유발 제의 기능, 히스토아제 및 분자 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 기초를 조명하는 것입니다. 이 프로토콜은 임상 맥락에서 향후 적용 가능성을 가진 작은 동물 모델에서 가능한 혈관 신생 요법의 시험을 위한 표준을 필드. 재혈관화는 중요한 허혈 환자의 20~30%에 적합하지 않기 때문에 치료 혈관신생은 허혈성 부위의 혈액 풍부를 개선하기 위한 새로운 전략으로 부상하고 있다.이 실험 프로토콜은 혈관 신생 요법이 각 결과에 대한 효능의 척도에서 효과를 발휘하는 메커니즘에 대한 포괄적 인 이해를 제공 할 수 있습니다. 22주 된 C57 블랙 6 여성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 오른쪽 뒷다리에서 머리를 면도하고 가열 패드에 큐비투스 위치에 등쪽의 동물을 고정. 동물을 해부 현미경 으로 놓습니다.그리고 오른쪽 뒷다리의 허벅지 에 1 센티미터 피부 절개를 만들기 위해 숫자 11 수술 메스 블레이드를 사용합니다. 무딘 신경 혈관 번들을 노출 피하 지방을 해부. 그리고 뾰족한 집게, 스프링 가위 및 안과 바늘 홀더를 사용하여 막막 에로피모페랄 칼집을 열어 말단 외부 장심 및 대퇴혈관을 노출시킵니다.동맥과 정맥을 신경에서 해부하고 분리한 후 7O 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 해골 대퇴동맥과 정맥 및 말단 외부 장모 동맥 및 정맥을 리칭하십시오. 말단 외부 장악 동맥의 식별과 결찰 및 절단 은 단상 외부 장악 및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제는 절차의 성공에 매우 중요합니다. 스프링 가위를 사용하여 실피성 동맥과 정맥의 부분을 탈구와 근위 매듭 사이에 분리합니다.그리고 흡수 성 봉합사로 절개를 닫습니다. 그런 다음 복상 간 항용액을 동물에 전달하고 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 홈 케이지로 반환합니다. 위장관 근육을 수확하려면 두 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.그리고 면봉을 사용하여 피부와 근육을 분리합니다. 아킬레스 건을 들고, 스프링 가위를 사용하여 경골과 비골에서 무릎 관절까지 근육을 분리하십시오. 그리고 이두근 페모리스를 위트롬혈근육과 분리한다.스프링 가위를 사용하여 무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 자른다. 그리고 10%트리가산을 사용하여 수확한 근육을 작은 코르크 디스크의 횡방향에 배치합니다. 이어서, 액체 질소 냉각에 표본을 동결 하 고 영하 80도 저장에 대 한 opentane.모세관 미세 절 레이저 캡처의 경우 근육 표본의 12 마이크로 미터 섹션을 얻은 후, 영하 20도에서 5 분 동안 냉각 된 순수 아세톤의 50 밀리리터에서 슬라이드에 조직을 고정합니다. 공기 건조 후 소수성 펜으로 각 시편을 동그라미. 그리고 PBS에서 염화 나트륨 2개를 섭씨 4도에서 재수화합니다.재수분의 끝에서, 하룻밤 섭씨 4도에서 관심의 적절한 1 차 항체와 샘플을 라벨. 그 다음에 는 세척당 PBS에서 신선한 2개의 어금니 나트륨 염화나트륨으로 23분간 세척합니다. 두 번째 세척 후, 4섭씨에서 30분 동안 적절한 이차 항체로 섹션을 표시한 다음 PBS의 염화나트륨에 2개의 세척을 시연한다.다음으로, 4섭씨에서 30분 동안 아비딘 컨쥬게이드 페록시다제 복합체로 샘플을 라벨로 붙인다. DAB peroxidase 기판으로 세척 및 5 분 라벨링이 뒤따릅니다. 인큐베이션이 끝나면 순차적 얼음 에서 조직을 탈수하여 90%에탄올과 100% 에탄올 에머지에서 탈수합니다.이어서, 마우스당 10, 000개의 모세혈관을 해부하고 투석기당 10, 000개의 모세혈관을 마이크로후지 튜브 접착제 캡으로 해부하기 위해 355나노미터 레이저를 솔리드 상태로 펄스가 장착한 후 마이크로절시스템을 사용한다. 그림과 같이, 뒷다리 관류의 완전한 손실은 뒤다리 허혈 유도 후에 즉시 관찰됩니다. ISC와 NISC 사지의 비율로 표현된 혈류의 정량적 평가는 HLI 이후 15일과 45일에 친 혈관신생 자극에 노출된 마우스의 사지 혈액 관류가 현저하게 향상된 것으로 나타났다.위장혈증 근육 조직 섹션의 조직학적 섹션에서 CD31 양성 모세혈관의 정량화는 모세관 밀도가 허혈성 대 비 허혈성 사지에서 더 크다는 것을 보여줍니다. 예상대로. 그러나 이 효력은 프로 혈관신생 에이전트를 가진 처리 후에 추가 증폭됩니다.부수적인 혈관 밀도는 또한 허혈성 사지에 있는 일관되게 증가하고 이 증가는 친 혈관신생 자극을 가진 노출 후에 상당히 높습니다. CD31 양성 내피 세포에서 프로 혈관신생 유전자 발현의 역전사 중합체 연쇄 반응 분석은 프로 혈관신생 제에게 노출되거나 그렇지 않은 마우스 간의 유전자 발현의 명확한 변화를 보여준다. 혈관 해부 동안 동맥과 정맥의 찢어방지막 일리오페모랄 칼집을 열기 위해 더 오래된 안과 바늘을 사용하는 것이 중요합니다.이 선박은 레이저 도플러 기반 의 관류 측정 및 모세관 혈관 밀도의 조직학적 정량화에 의해 용이하게 평가된 뒷다리 허혈에 반응하여 혈관 신생을 평가할 수 있게 한다.

assessing-therapeutic-angiogenesis-murine-model-hindlimb

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

일방적 hindlimb의 국소 빈혈의 유도에 대한 수술은 레이저 도플러 재관류 이미징에 의해 국소 빈혈의 확인과 증명합니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

physiologic angiogenesis 그 부족 일반 성인 vascularized 포유류의 조직은 학습하는 데 사용됩니다 수술 개입에 노출되지 않았습니다 (I) 개시 및 시험 요원의 intraperitoneal 관리 다음 angiogenesis의 개발, 그리고 체계적인 관리 아래와 angiogenesis의 (2) 수정 테스트 에이전트를 선택했습니다.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

뇌 조직으로의 혈류를 일시적으로 차단하는 수술인 중대뇌동맥 폐색을 받은 쥐부터 시작하십시오.이것은 허혈성 뇌졸중을 유발하여 뇌 조직 손상을 초래합니다.다음으로 막힌 부분을 제거하여 혈류를 회복합니다.연구 관련성을 보장하기 위해 신경학적 결손을 보이는 쥐를 선택합니다.그런 다음 실험군에는 시험약을 투여하고 다른 그룹에는 식염수를 주입합니다.약물과 식염수 투여를 반복합니다.시험 약물은 혈관신생을 촉진하여 새로운 혈관을 형성합니다.이는 손상된 뇌 조직으로의 혈액 공급을 향상시키고 뇌졸중 영향을 줄입니다.다음으로 쥐를 마취하고 온열 담요를 사용하여 체온을 유지합니다.며칠 후 두 그룹 모두에 대해 MRI 스캔을 수행합니다.MRI 이미지에서 식염수 주입 그룹의 더 밝은 영역은 뇌졸중 영향 부위를 나타냅니다.한편, 실험군의 밝기 감소는 약물 유발 혈관신생을 시사한다.

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 시험약의 혈관신생 효과 평가

우리는 단계별 절차와 필요한 장비에 대한 설명을 포함 손쥐 spinotrapezius 근육의 소설 동맥 결합 모델을 보여줍니다. 우리는 수술과 intravital 및 공 촛점 현미경을 사용하여 혈관 네트워크 리모델링 및 기능 vasodilation에 관한 관련 결과 측정을 설명합니다.

Microvascular 기능 및 리모델링에 Arteriolar 결합의 영향을 평가하기 위해 손쥐 Spinotrapezius 모델

마이크로 컴퓨터 단층 촬영 영상에 대한 Microfil와 허혈성 뒷발과 혈관의 관류에 삼투의 약물 전달 (Drug Delivery)

우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 혈관 신생을위한 치료 인자를 과발현 프로그래밍 줄기 세포의 제조 방법을 설명한다. 설명 과정은 체외에서 지방 유래 줄기 세포를 형질 전환하고, 쥐의 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진하기 위해 프로그램 된 줄기 세포의 효능을 검증 고분자 합성 (가) 있습니다.

생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

마우스에서 뒷다리 허혈의 외과적 유도는 혈관 신생을 검사하는 데 유용하지만, 현저한 허혈 유발 조직 괴사를 나타내는 특정 근친 마우스 균주에서는 손상됩니다. 점진적인 동맥 폐색의 유도를 통해 이 문제를 회피하기 위해 아메로이드 수축기를 사용하여 아급성 사지 허혈을 유도하는 방법이 설명되어 있습니다.

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 가진 토끼에 있는 말 초 허 혈을 유도 하기 위하여 이용 된 외과 절차를 기술 합니다. 이 수술은 환자의 말 초 동맥 질환에서 경험 하는 조건에 대 한 전 임상 모델 역할. 혈관 조 영 법은 또한 관류의 도입 된 허 혈 및 회수의 정도를 측정 하는 수단으로 서 기술 된다.

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

이 문서는 작은 절개를 가진 마우스에 있는 심각한 허혈을 확립하기 위하여 능률적인 외과 접근을 보여줍니다. 이 방법은 실험실 업그레이드없이 대부분의 연구 그룹에 의해 적용 될 수있다.

ApoE에서 뒷다리 허혈의 변형 된 수술 모델-/- 소형 절개를 사용하여 마우스

본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

학습하세요 뮤린 후지 허혈 모델에서 혈관 신생 치료제의 기능적·조직학적·분자적 효과를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 임상 적용 가능성을 가진 혈관 신생 요법 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

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