Name: 세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가 방법을 AF4 정제와 글루쿠로니다제 마커를 활용하여. 다양한 세포에서 유래한 소포체의 저장 특성을 비교 분석하고 물리화학적 매개변수 및 효소 활성을 평가합니다.

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독일 교육 연구 부 (보조금 번호 13XP5029A)의 나노 Matfutur 주니어 연구 프로그램은이 작업을 지원 했다. 막시밀리안 리히터는 박사 펠로 우 십을 통해 유스호스텔 Volkes (독일 학술 장학 재단)의 지원을 받았습니다.

1. 세포 배양 및 세포 컨디셔닝 배지 생산
<ol><li>일반적으로, 각 세포 줄에 필요한 개별적인 조건 하에서 세포를 육성 한다.</li>
	<li>무 혈 청 조건에서 또는 EV-고갈 된 태아 소 혈 청 (FBS)을 포함 하는 매체에서 24-72 h를 위한 세포를 경작 하십시오. 참고: EV-고갈 된 FBS 사용 되는 경우, 혈 청을 효율적으로 고갈 시키기 위해 입증 된 방법을 채택 하 여 소 세럼 파생 EVs26으로 오염을 방지 하십시오.</li>
	<li>플라스 크에서 배지를 수집 합니다. 원심 분리기를 300 x g 에서 10 분간 세포를 펠 렛 합니다. 모 깎기 된 세포를 방해 하지 않고 셀 컨디셔닝 배지 (CCM)를 조심 스럽게 수집 하십시오. 바람직하게는, CCM을 직접 사용 하거나 4°c에서 밤새 보관 한다. 참고: 항상 신선 하 게 생산 된 CCM을 사용 하는 것이 좋습니다. 더 긴 기간 동안 스토리지를 우회할 수 없는 경우, 모든 관련 매개 변수는 MISEV2018 가이드라인26에 따라 기록해 야 하며 획득 한 결과의 잠재적 편향이 고려 되어야 합니다.</li>
	<li>HUVECs에 대 한 프로토콜 예제<ol>
<li>FBS 및 기타 보조 제를 포함 하는 egm-2 배지에 huvec 120 세포 배양.</li>
		<li>추가 보충제를 무료로 EBM-2 기초 배지에서 48 h에 대 한 HUVEC 세포를 육성.</li>
		<li>플라스 크 로부터 배지를 수집 하 고 상기에 나타난 바와 같이 원심 분리 단계를 수행 한다 (단계 1.3). 일반적으로 1 EV-격리에 100 mL의 매체를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CCM의 초 원심 분리
<ol><li>초 원심 분리 직전에, 3000 x g 및 4°c에서 15 분 동안 CCM을 원심 분리 하 여 세포 파편과 큰 응집 체를 제거 한다.</li>
	<li>상층 액을 UC 튜브에 조심 스럽게 옮겨 준다. 고정 각도 회전자를 사용 하는 경우, UC 후 EV 펠 릿의 검색을 용이 하 게 하기 위해 원심 분리기에서 튜브의 방향을 표시 합니다. 12만 x g에서 2 시간 동안 원심 분리기로 259.4의 k-팩터를 사용 합니다.</li>
	<li>UC를 한 후에, 정 학 피 펫을 사용 하 여 상층 액을 조심 스럽게 버리고, 펠 릿 한 EVs의 교란을 피하십시오. 참고: 펠 릿이 보이지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>추가 200 µ L 0.2의 µm 여과 된 인산 완충 식 염 수 (PBS)를 제 1 튜브에 첨가 하 고 PBS 및 잔류 상층 액을 사용 하 여 피 펫 팅을 통해 펠 렛의 위/아래를 소생 시킵니다. 얻어진 EV 현 탁 액을 각각의 샘플의 다음 튜브로 옮겨 소생에 사용 하십시오. 이 방법을 진행 하 여 샘플의 모든 EVs를 약 300-350 µ L의 최종 볼륨으로 소생 시킵니다.</li>
	<li>소생 후에는 나노 입자 추적 분석 (NTA)에 의해 입자가 존재 하는지 확인 합니다. 아래 설정과 같이 지정 된 EV 유형에 최적화 된 설정을 사용 합니다 (단계 2.5.1). 참고:가 디너 & 알27 과 베 스타드 외28 의 논문에는 EVs 측정을 위한 매개 변수를 최적화 하는 방법에 대 한 유용한 정보가 들어 있습니다.<ol>
<li>아래에 설명 된 결과를 재현 하려면 녹색 레이저가 장착 된 계측기 (예: NanoSight LM14)를 사용 하십시오. 1.0의 화면 이득 및 카메라 레벨 13의 30 초 동영상 3 개를 녹화 합니다. 분석을 위해 1.0의 화면 이득과 감지 임계값 5를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가능한 경우 즉시 펠 렛을 사용 하십시오. 그렇지 않으면 밤새 4°c에 보관 하십시오.</li>
</ol>3. EVs에 캡슐화를 니드
<ol><li>재현 탁 펠 렛에 니드의 최종 농도로 1.5 mg/ml 및 사포닌 (10mg/ml)을 최종 농도의 0.1 mg/ml에 첨가 하 여 최종적으로 pml/ml을 추가 하였다. 3 초 동안 잘 섞어 줍니다.</li>
	<li>Intermitted 혼합 하 여 실 온에서 10 분간 배양 한 후 튜브를 가볍게 쓸으 십시오. 인큐베이션 후에, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 직접 정화 한다 (제 5 항 참조). 참고: 동결로 인 한 효소 분해를 방지 하기 위해 한 번 해 동 한 후 니드 샘플을 리프레시 하지 마십시오.</li>
</ol>4. 리 포 좀 생산
<ol><li>EVs와 비교 하기 위해 리 포 좀을 준비 하려면 2:3에 클로로 폼의 1, 2-dimyristoyl-글 리세 리드 포스 포 콜린) 및 1, 2 dipalmitoylsn-글 리 세로 3 포스 포 콜린 (dmpc)를 용 해 시키고 최종 농도 5mm로 합니다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 바이 알에 1Ml의 분 취 액을 준비 하 고 밤새 건조 시켜 지질 막을 형성 합니다. 주의: 클로로 포 름은 독성이 있으며 cancerogenic 것으로 의심 됩니다. 취급 시에는 적절 한 주의를 기울여야 합니다.</li>
	<li>1.5 mg/mL 니드를 함유 하는 1 mL의 PBS로 지질 막을 재 수화물. 42 ° c로가 열 하 고 1 분 동안 소용돌이. 압출 기 어셈블리를 42 ° c로가 열 하 고 200 nm 폴 리카 보 네이트 멤브레인을 통해 지질 현 탁 액 11x를 돌출 시킵니다. SEC에 의해 직접 정화 (5 항 참조).</li>
</ol>5. SEC에의 한 정화
<ol><li>다음 프로토콜을 사용 하 여 SEC 열을 준비 합니다.<ol>
<li>신선한 정제 수와 갓 준비 된 완충만을 사용 하십시오. 0.2 µm 멤브레인 필터를 통해 모든 버퍼를 필터링 하 고 열에 기포의 형성을 방지 하기 위해 그들을 탈 가스.</li>
		<li>SEC 컬럼의 제조를 위해, 아가 로스 겔 여과 기반 매트릭스 (예: 세파 로즈 Cl-2b) 또는 단백질 불순물과 과잉 효소 로부터 EVs와 리 포 좀을 분리 하기에 적합 한 다른 SEC 배지를 사용 하십시오. 먼저, 배지에 저장 된 20%에 토 에이치 용액을 제거 하 고, 칼럼에서 기포 형성을 방지 한다. 이를 위해, SEC 배지를 10 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 고,에 토를 제거 하 고, 탈 기 된 물로 교체 한다.</li>
		<li>유리 기둥 (내부 지름 10mm)을 SEC 배지와 15ml 마크에 채웁니다. 참고: 차원이 다른 열에 대해서는 볼륨이 다릅니다. 젤이 완전히 가라앉을 수 있도록 하십시오.</li>
		<li>실행 하기 전에, PBS의 적어도 두 개의 컬럼 볼륨으로 컬럼을 평형 화 합니다. 컬럼을 저장 하려면 먼저 1 개의 컬럼 체적의 물로 세척 한 다음 적어도 두 열 체적의 20%에 토를가 합니다. 저장 후에는 PBS로 equilibrating 전에 1 열 부피의 물을 먼저 세척 하십시오.</li>
		<li>하나의 분리에서 최대 400 µ L의 EV 또는 리 포 좀 현 탁 액을 사용 하십시오. 1 mL의 분 획을 수집 합니다. SEC 이후 정제 된 Ev (섹션 7 참조)를 저장 하거나 니드 분석에 적용 하십시오 (6 항 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>EVs와 리 포 좀의 분리가 단백질과 자유 니드을 오염 시키는 것을 확인 합니다. 이를 위해, 수집 된 분 획의 입자 농도와 단백질 농도 및 니드 활성을 상관 한다.<ol>
<li>NTA에의 한 입자 농도 평가 (2.5 참조)</li>
		<li>비 인산 (BCA) 분석 법 또는 다른 적합 한 단백질 정량 분석에 의해 단백질 함량을 평가 한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행 합니다.</li>
		<li>니드 분석 법에 의해 니드 활성을 평가 한다 (제 6 항 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택적으로, 투과 전자 현미경 (TEM) 및 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 EV 형태학을 평가 한다.<ol>
<li>TEM 샘플의 제조를 위해, TEM 그리드에 10 µ L의 EV 현 탁 액을 추가 하 고 10 분 동안 배양 한 다음 여과 지를 사용 하 여 과잉 액체를 털어 냅니다. 10 µ의 4% 파라 포름알데히드를 사용 하 여 10 분 동안 고정을 수행 하 고 초과 하는 것을 닦아 냅니다. 3 배를 물로 씻으십시오. 1% 형광체-텅스텐 산 수화물을 30 µ의 인큐베이션로 소포를 얼룩. 과량으로 블 롯 한 후, 하룻밤 동안 소포를 건조 시키십시오. TEM으로 시각화 합니다. 주의: 포스 포 텅스텐 산은 높은 부식성; 따라서 피부와 눈을 보호 하십시오.</li>
		<li>SEM의 경우, 이전에 준비 된 TEM 샘플을 카본 디스크에 고정 하 고 50 nm 두께의 골드 레이어로 스퍼터 링 합니다. SEM으로 시각화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 니드 분석
<ol><li>입자 수와 효소 활성을 상호 연관 시 킴으로써 상이한 샘플 및 저장 조건 간의 비교를 허용 하기 위해, 먼저 NTA에의 한 샘플의 입자 농도를 측정 한다 (2.5 단계 참조).</li>
	<li>PBS의 199 µ L에 화합물 10mg/ml)을 1 µ 첨가 하 여 형광 디 β-glucuronide의 작동 용액을 제조 하였다. 125 µ L의 정제 된 EVs에 25 µ L을 추가 하 여 8.3 µ의 최종 농도를 얻습니다. 샘플을 검은색 96 웰 플레이트에 넣습니다. 480 nm를 발광 파장으로 여기 및 516 nm로 사용 하 여 플레이트 리더기로 시간 포인트 0 h를 측정 합니다.</li>
	<li>플레이트를 단단히 덮고 (예: PCR 플레이트에 사용 되는 투명 한 플라스틱 호 일) 37 ° c에서 18 시간 동안 어둠 속에서 증발 및 배양을 최소화 합니다. 6.2 단계에 나열 된 플레이트 리더 파라미터를 사용 하 여 형광 생산을 측정 한다.</li>
</ol>7. Ev 및 리 포 좀의 보관
참고: 모든 저장 목적을 위해 저 결합 튜브를 사용 하 여 흡착으로 인 한 EV 손실을 줄이는 것이 좋습니다.
<ol><li>이 섹션의 매개 변수를 따라 아래에 제공 된 대표적인 결과를 재현 합니다. EV 서 스 펜 션의 400 µ L로 구성 된 샘플을 사용 하십시오.<ol>
<li>4°c 또는-80 ° c에서 보관 하거나 아래 나열 된 단계를 진행 하십시오.</li>
		<li>EVs를 동결 건조 합니다.<ol>
<li>정제 된 EVs에 최종 농도 4mg/ml까지trehalose (40)를 첨가 하십시오. 적어도 1 시간 동안-80 ° c에서 샘플을 동결.</li>
			<li>다음 매개 변수를 사용 하 여 샘플을 동결 건조 합니다. 메인 건조의 경우, 선반 온도를 15°c로 설정 하 고 압력을 0.180 mbar로 설정한 후 샘플을 46 h의 건조 상태로 둡니다. 최종 건조의 경우, 선반 온도를 25°c로 설정 하 고 압력을 0.0035 mbar로 설정한 후 샘플을 2 시간 동안 건조 시켜 둡니다. 동결 건조 된 샘플을 4°c에서 보관 한다.</li>
			<li>샘플을 다시 하이드레이션 하려면 시작 부분에있는 EV 서 스 펜 션의 양과 동일 하 게 h2o를 추가 합니다 (일반적으로 400 µ l). 재 수 화를 위해 어떤 완충 제를 사용 하지 마십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 저장 후 분석
<ol><li>효소 활성을 평가 하기 위해, 먼저 저장 중에 EVs에서 유출 되었을 수 있는 무료 니드를 제거 합니다. 이를 위해 SEC에 의해 수행 되는 정제의 추가 단계 (5 단계 참조) 또는 비대칭 유동 장 유동 분별 (AF4 단계 참조)에 의해이를 달성 한다. 참고: 두 방법 모두 EV 샘플의 희석으로 이어질 수 있음을 알려드립니다. 따라서, NTA 정량 한계 이하로 이동 하는 것을 피하기 위해 저장 전에 충분 한 EV 농도를 사용 한다. SEC 또는 AF4에의 한 입자의 1:10 희석을 기대할 수 있습니다.<ol>
<li>SEC 정제의 경우 위에 설명 된 프로토콜을 따르십시오 (5 항 참조).</li>
		<li>AF4 정화를 수행 합니다.<ol>
<li>350 µm 스페이서와 30kd 분자량 컷오프 셀 룰로 오 스 멤브레인이 있는 작은 채널을 사용 하 여 계측기를 설정 합니다. 0.1 µm 기 공 크기 필터를 HPLC 펌프와 AF4 채널 사이에 배치 합니다. 신선 하 게 준비 된 0.1 µm-여과 된 PBS를 이동 상으로 사용 하 여 광산 산란 검출기의 입자 하중과 소음을 줄입니다.</li>
			<li>280 nm로 설정 된 UV 검출기를 사용 하 여 단백질을 검출 합니다. 입자를 감지 하려면 레이저를 658 nm로 설정 하 여 다중 각도 광 산란을 사용 합니다.</li>
			<li>다음 run 메서드를 사용 합니다. 1 분의 초점 흐름으로 1 분간 사전 초점; 그런 다음 샘플의 300 µ L을 0.2 mL/min의 비율로 주입 하 고 초점 흐름을 10 분 동안 유지 합니다. 주입 후, 시료를 1ml/min에서 용 해 하 고 크로스 플로우를 사용 하지 않고 다른 10 분 동안 2 분에서 0.1 mL/min으로 감소 하는 교차 흐름을 적용 합니다. 12.5 분 후부터 시작 하 여 1 mL의 분 획을 수집 하 고 27 분까지 계속 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>전술한 바와 같이 니드 분석을 수행 한다 (제 6 항 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>크기 및 농도를 평가 하기 위해, 전술한 바와 같이 NTA를 사용 한다 (2.5 단계 참조).</li>
	<li>필요에 따라 TEM 및 SEM을 수행 하 여 저장 후 EVs의 형태를 평가할 수 있습니다 (5.3 참조).</li>
</ol>

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이 원고에서는 다양 한 보관 조건에서 EVs의 안정성을 연구 하기 위한 종합적인 프로토콜을 제시 합니다. 캡슐화 된 니드을 기능적 판독 및 EVs의 물리 화학적 파라미터의 평가와 결합 하 여,이 프로토콜은 EVs의 간단한 저장 안정성 평가와 다른 셀의 EVs 비교를 허용 합니다. 라인. SEM 및 TEM을 보완 방법으로 사용 하면 단일 입자 수준에서 EVs의 변화에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에 제시 된 결과는 냉동 보호 제 없이 동결 건조로 인해 EVs와 리 포 좀이 응집 되는 경향을 보였다 (도 6). 그러나, 이것은 SEM 실험 에서만 관찰 되었다. EM 이미징은 trehalose로 보존 된 샘플로 진행 되지 않았지만,이 문헌에서는이 냉동 보호 제가 실제로 EVs29의 응집을 감소 시킬 수 있음을 시사 합니다. 주어진 저장 조건이 EV 크기, 회복 속도 및 캡슐화 된 분자에 차별적으로 영향을 미치는 경우에도 평가할 수 있습니다. 이러한 효...

EVs는 거의 모든 세포 유형에 의해 생성 된 멤브레인 결합 나노 입자입니다. 포유류 세포의 경우, EVs는 별개의 생산 경로1,2로 두 개의 주요 그룹으로 세분 될 수 있습니다. 대략 100-1000 nm에서 크기 범위를 가진 막 소포는, 세포 막에서 직접 신진에 의해 생성 됩니다. 크기 30-200 nm의 엑 소 솜은 내 면으로 형성 되 고, 이어서 세포 막과 융합 하 여 여러 개의 엑 소 좀을 한 번에 방출 하는 다발 골 조직 으로부터 유래한 다. 이 소포의 주요 기능은 세포3사이의 정보 전송입니다. 이 목적을 위해, RNA, DNA 및 단백질과 같은 화물는 활발히 그들로 분류 됩니다. EVs는 건강과 질병 상태 모두에 영향을 미치는 다양 한 효과를 대상에 게 전달할 수 있습니다. 한쪽에는 조직 재생, 항 원 제시 또는 항생제 효과와 같은 긍정적 인 효과를 매개 하 여 치료제4,5로 서의 발달에 대 한 길 조 표적을 만듭니다. 다른 측면에서, Ev는 종양 혈관 신생을 촉진할 수있고, 스트레스 반응7에서 바이 스탠 스 효과를 유도 하 고, 자가 면역 질환8 및 염증 성 질환9에서 역할을 할 수도 있다. 따라서, 그들은 많은 병리학 적 효과의 더 나은 이해에 핵심 구성 요소가 될 수 있습니다. 그러나 암10,11,12 및 심혈 관 질환과 같은 매니 폴드 질환에서 변경 된 EVs가 존재하 고 혈액과 소변에서의 손쉬운 접근이 이상적입니다. 바이오 마커. 마지막으로, 그들의 좋은 생체 적합성14 그리고 그들의 내재 된 표적 능력은 ev도 마약 배달에 대 한 흥미로운 만들기15. 이 원고에서, 우리는 포유류 세포 로부터 유래 된 EVs의 저장 안정성을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 하며, 여전히 거의 조사 되지 않는 중요 한 성질 이다.
EVs의 임상 발달을 위해, 그들의 치료 효과, 생산, 정제 및 저장17의 평가를 포함 하 여 극복16에 많은 장애물이 아직도 있습니다. -80 ° c는 EV 저장 장치 (18)의 표준으로 널리 볼 수 있는 반면, 필요한 냉동 고는 비용이 많이 들며, 생산에서 요구 되는 콜드 체인을 환자에 게 유지 하는 것은 쉽지 않은 일입니다. 또한 일부 보고서는-80 ° c에서 스토리지가 EVs를 최적으로 유지 하지 못하고 ev 기능19,20에서 손실을 유발 한다고 표시 합니다. 동결 건조 (21),22 또는 분무 건조 (23)와 같은 다른 방법은 EVs의 냉동 저장에 대 한 잠재적인 대체물로 제안 되었다.
저장 안정성을 평가 하는 최적의 방법은 기능적 분석에서 EVs를 테스트 하거나 특정 마커의 평가 (예를 들어, 항균 활성19)를 검사 하는 것입니다. 이것은 소포에 대 한 원하는 효과가 알려져 있을 때 그리고 하나의 별개의 EVs 그룹이 연구 될 때 가능 합니다. 상이한 세포 공급원 으로부터의 EVs가 비교 될 경우 (예를 들어, 약물 캡슐화) 또는 알려진 기능적 판독 기능이 없는 경우, 저장에의 한 변화를 직접적으로 평가할 수 없게 된다.
한편, 최근 특허20에 나타난 바와 같이, 크기, 입자 회수 및 단백질 농도와 같은 물리 화학적 파라미터의 변화를 평가 하는 것 만으로도 EV 활성의 변화를 항상 예측 하는 것은 아니다.
여기에서, 우리는 EVs의 화물을 위한 대리로 캡슐화 된 베타-니드 효소의 활동과 결합 된 물리 화학적 매개 변수를 평가 함으로써 EVs의 저장 안정성을 측정 하는 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제공 합니다. 효소의 로딩은 상이한 공급원21,24,25로부터의 EVs와 함께 확립 된 온화한 방법으로 사포닌 배양에 의해 이루어진다. 사포닌은 EV 막에 과도 기공을 형성 하 여 소포에 효소 흡수를 허용 합니다. 효소는 불리 한 저장 조건을 복종 하는 경우에 그들의 활동을 분실 하는 경향이 있기 때문에, 그들은 EVs의 기능적인 화물의 보전의 평가를 위한 이상적인 대리입니다.
우리는 인간 간 엽 줄기 세포 (MSCs), 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 및 인간 선 암 폐 포 상피 세포 (A549) 로부터 유도 된 EVs에이 프로토콜을 적용 하는 것이 실제로 큰 차이를 초래 한다는 것을 입증 했습니다 EV 소스 (21)를 선택할 때 고려해 야 할 다른 셀 라인 사이의 저장 안정성.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>25 ml의 중간 30</td></tr><tr><td>kDa 재생 셀룰로오스 막</td>과 함께 사용됩니다. <td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 &마이크로; m 스페이서</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 분획 수집기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>베타-글루쿠로니다아제</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>컬럼 오븐</td><td>히타치 하이테크 유럽</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-트레할로스 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, 다각도 광 산란 검출기</td><td>&nbsp; Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore 멤브레인 필터, PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp; &마이크로; 남, 47&nbsp; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td> AF4 <td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td>의 버퍼 준비에 사용됩니다.<td>CC-3156</td><td>내피 세포 성장 기저 배지, HUVEC 세포의 무혈청 배양에 사용</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>내피 세포 성장 배지, HUVEC 세포의 정상 배양에 사용</td></tr><tr><td>ELISA 플레이트 실러</td><td>R & 글루</td><td>쿠로니다아제 분석을 위한 96웰 플레이트의 밀봉에 사용되는</td>D Systems <td>DY992</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>E/0665DF/17</td><td></td></tr><tr><td>압출기 세트(홀더/가열 블록 포함</td>) <td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>필터 지원</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>리포좀 제제에 사용</td></tr><tr><td>Fluorescein di-&beta;-D-glucoronide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>300 g</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>3000 g HUVEC 셀에서 더 큰 파편을 펠릿화하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Lonza Verviers, S.P.R.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>킴블&nbsp; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기 ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>모든 EV 핸들링에 사용되는 튜브는 입자 회수와 관련하여 다른 공급업체의 동급 제품보다 유리한 것으로 밝혀졌습니다</td></tr>. 녹색 <tr><td>레이저가 장착된 Nanosight LM14</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-software version 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>리포좀 제제에 사용됨</td></tr><tr><td>PEEK 인라인 필터 홀더</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포스포텅스텐 산 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리용 폴리카보네이트 병</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA 분석 키트</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr>, <tr><td>Saponin,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr>, <tr><td>주사 전자 현미경, Zeiss EVO HD 15</td>, <td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Sepharose Cl-2b</td>, <td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM 구리 탄소 필름이 있는 그리드</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>소형 AF4 채널</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스퍼터 코팅기 Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경 JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti 초원심분리 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex 자동시료주입기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex 등용매 펌프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex 온라인 진공 탈기 장치</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 검출기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &마이크로; m 기공 크기 혼합 셀룰로오스 필터</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>EV와 SEC에 사용되는 모든 버퍼의 여과에 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

세포 밖 소포 (EVs)는 약물, 약물 운반체 및 바이오 마커로 서 사용 되는 현재 연구에서 유망한 표적 이다. 그들의 임상 발달을 위해, 그들의 약 제 활동은 중요 합니다 뿐만 아니라 그들의 생산은 평가 될 필요가 있습니다. 이 맥락에서 연구는 EVs, 특성 및 저장소의 격리에 중점을 둡니다. 본 원고는 유전 조작 또는 특정 기능 분석 없이 EVs에 대 한 다양 한 저장 조건의 효과를 평가 하기 위한 간편한 절차를 제공 하는 것을 목표로 합니다. 이를 통해 주어진 보관 조건 하에서 EVs의 안정성에 대 한 첫 인상을 신속 하 게 얻을 수 있으며, 다른 셀 소스에서 추출한 EVs는 쉽게 비교 가능 합니다. 안정성 측정은 EVs의 물리 화학적 매개 변수 (크기, 입자 농도 및 형태) 및 화물의 활동 보존에 기반 합니다. 후자는 베타-니드 효소의 사포닌 매개 캡슐화에 의해 Ev로 평가 된다. 니드는 대리로 서 작용 하 고 형광 성 리포터 분자의 절단을 통해 쉬운 정량화를 허용 합니다. 본 프로토콜은 임상 적용에 대 한 EV 연구를 진행 하기 위해 EV 특성을 최적으로 유지 하는 저장 조건 검색에서 연구자를 위한 도구가 될 수 있습니다.

그림 1 은 HUVECs에서 격리 된 EVs의 저장소 특성을 표시 합니다. EVs는 UC에 의해 분리 되었고, 니드 캡슐화 되었고, SEC 후에, 정제 된 EVs는 NTA에 의해 그들의 물리 화학적 성질을 평가 하였다. 샘플을 이어서 AF4 정제를 실시 하 고 니드 활성을 측정 하였다.
소포는 4°c 또는-80 ° c에서 7 d, 그리고 4°c에서 동결 건조 된 형태로 저장 하였으며, 후자의 경우 4% trehalose를 첨가 하였다. 저장 후, 소포는 NTA에 의해 다시 측정 되 고, AF4 후에, 입자 당 나머지 니드 활성이 평가 되었다.
AF4의 작동 원리는 AF4 채널의 바닥에 있는 다공성 멤브레인을 통해 층 류 흐름과 직교 교차 흐름의 조합을 기반으로 하며,이는 그 크기에 따라 입자에 차별적으로 영향을 미칩니다 (그림 2). 더 큰 입자는...

여기서 우리는 세포 밖 소포체의 저장 안정성을 평가 하기 위해 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제시 하 고, 세포내에서 생성 되는 자연적으로 발생 하는 나노 입자의 그룹 이다. 소포는 모형 효소로 니드로 적재 되 고 다른 조건 하에서 저장 됩니다. 저장 후,이의 물리 화학적 매개 변수와 캡슐화 된 효소의 활성이 평가 됩니다.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

여분의 세포 소포의 저장 안정성은 그들의 미래 치료 사용에 대 한 중요 한 매개 변수. 당사의 프로토콜은 스토리지가 소포에 미치는 영향을 평가하기 위한 쉽게 적용할 수 있는 도구를 제공합니다. 우리의 기술의 주요 장점은 외인성 마커로 글루쿠로니다아제를 도입함으로써, 다른 부모 세포에서 파생된 세포외 소포는 그들의 질성에 관하여 쉽게 비교될 수 있다는 것입니다.비대칭 유동장 유량 분획 또는 AF4는 매우 민감한 화합물에 대한 크기 배제 크로마토그래피 정제에 대한 가벼운 대안입니다. 화합물채널에서 덜 순수한 스트레스를 발생하기 때문입니다. 글루쿠로니다제는 민감한 효소이기 때문에, 상주하는 것의 질은 철저한 계획과 다시 다시 정제 및 분석을 위한 단계를 수행하여 유익합니다.그 세포에 대한 표준 조건에 따라 관심의 세포주를 배양 한 후, 혈청 무료 또는 여분의 세포 소포 고갈 매체로 상체를 교체하고 추가 24 ~ 72 시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 플라스크에서 슈퍼 나탄을 수집하고 세포를 퇴적시시 샘플을 원심 분리. 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 세포 조절 배지를 수집합니다.그리고 매체를 원심분리하여 세포 이물질과 큰 골재를 제거합니다. 그런 다음 슈퍼네티를 조심스럽게 초원심분리기 튜브로 옮기습니다. 고정 각도 로터를 사용하는 경우 원심분리기의 튜브 방향을 표시하여 원심분리 후 세포외 소포 펠릿의 검색을 용이하게 합니다.초원심분리가 끝나면 세포외 소포 펠릿을 방해하지 않고 상체 피펫을 조심스럽게 폐기하십시오. 0.2 마이크로미터 의 200 마이크로리터에서 PBS를 최초의 초원심분리기 튜브의 잔류 상류체로 여과하였다. 펠릿을 다시 중단한 후, 세포외 소포 펠릿의 모든 재중단될 때까지 후속 펠릿의 재서스펜션을 위해 결과 세포외 소포 현탁액을 다음 튜브로 옮기다.최종 재중단 펠릿 용액에 베타 글루쿠로니다아제를 첨가하여 밀리리터당 1.5밀리그램의 최종 농도를 제공합니다. 그리고 수타포닌의 최종 농도0.1 밀리 리터 당 밀리 그램. 그런 다음 3 초 동안 소용돌이에 의해 잘 섞고 간헐적으로 부드러운 플릭으로 10 분 동안 실온에서 반응을 놓습니다.글루쿠로니다아제가 캡슐화되면, 편견없는 저장 안정성 결과를 얻기 위해 같은 날 에 모든 후속 정화 소포 평가 단계를 수행해야합니다. 사포닌 인큐베이션 직후 펠릿을 정화할 준비가 된 PBS의 적어도 두 개의 컬럼 볼륨으로 평형된 크기 배

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이것은 간에서 조직 세포 외 소포 (EV)를 격리하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 콜라게나아제 관류와 관련된 2단계 과정을 설명하고 간 조직 EV를 분리하기 위한 차동 초원심분리를 설명합니다.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

우리는 암성 비뇨생식기 세포로부터 기원되는 세포밖 소포(EVs)의 분리 및 동결 파쇄를 위한 프로토콜을 제시한다. 동결 파괴 기술은 EV의 직경과 모양, 그리고 EV 멤브레인의 내부 조직을 독특한 특징으로 드러냈다. 이는 EV가 수신자 멤브레인과 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 데 매우 중요합니다.

세포 밖 소포 분석을 위한 동결-골절 전자 현미경 검사

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

배우세요 세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가 방법을 AF4 정제와 글루쿠로니다제 마커를 활용하여. 다양한 세포에서 유래한 소포체의 저장 특성을 비교 분석하고 물리화학적 매개변수 및 효소 활성을 평가합니다.

세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가

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