Name: 대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 배우세요 대장균에서 방사성 라벨링과 얇은 층 크로마토그래피를 이용하여 다양한 생리적 스트레스 조건에서 ppGpp 수준을 측정하는 고효율 분석 방법을. 이 기술은 세균의 뉴클레오타이드 조절 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 교내 연구 프로그램, 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소, NIH를 지원했다.

1. 미디어 준비
<ol><li>
MOPS (3-(N-morpholino) 프로판설포닉산) 배지25,10x MOPS 염의 1/10 부피, 100x 미량 영양소 용액의 1/100 부피, 하룻밤 배양용 3 mM 나트륨 인산나트륨 또는 32P로 균일한 라벨링을 위한 0.2 mM 인산나트륨을 사용하십시오. 0.2% 포도당과 1 μg/mL 티아민 (비타민 B1). 필요한 경우 아미노산을 40 μg/mL로 첨가하십시오.
	<ol>
<li>MOPS 소금의 경우 400 mM MOPS, 40 mM 트리신, 0.1 mM FeSO4,95 mM NH4Cl, 2.6 mM K2SO 4, 5 μM CaCl2,10.56 mM MgCl2,500 mM NaCl을 사용하십시오. 강수량을 피하기 위해 작성된 순서대로 다른 구성 요소를 추가합니다. KOH로 pH 7.4로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.</li>
		<li>100x 미량 영양소 용액의 경우3 μM (NH 4)6(MO7)24, 0.4 mM H3BO4,30 μM CoCl2,10 μM CuSO4,80 μM MnCl2및 10 μM ZnSO4를사용하십시오. 오토클레이브에 의한 살균.</li>
		<li>포도당용 (20%) 및 나트륨 인산염 (300 mM) 용액은 오토 클레이브에 의해 별도의 100x 주식으로 살균합니다. 여과에 의해 티아민과 아미노산 혼합물의 100x 주식을 살균. 각 실험에 대한 멸균 스톡 솔루션에서 신선한 매체를 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 32P로라벨링
<ol><li>MOPS 배지에서 3 mMM 인산나트륨으로 밤새 배양해 있습니다.</li>
	<li>24 웰 플레이트에 0.2 mM 나트륨 인산염 담체를 함유한 MOPS 매체 550 μL과 각 세균 접종균의 30 μL을 첨가합니다 (희석 1/20). 이것은 OD600nm 0.1의 초기 접종을 생성할 것이다. 멸균 제어로 신선한 매체와 함께 잘 사용하십시오.</li>
	<li>300 rpm에서 37°C에서 37°C에서 흔들리는 인큐베이터에 플레이트를 놓고 30분 동안 배양물을 가열하고 흔들림은 폭기를 제공한다. 기울어지거나 흘리지 않도록 테이프로 플레이트를 단단히 부착하십시오. 성장은 플레이트 리더를 사용하여 32P가 결여된 매체에서 병렬로 복제 플레이트로 모니터링하고 동일한 조건하에서 배양할 수 있다.</li>
	<li>32P 정형 외과 인산염의 각 우물에 100 μCi를 추가하십시오 (5 mCi / mL 스톡에서 20 μL). 참고: 방사능의 양은 또한 실험적인 필요를 충족시키기 위하여 조정될 수 있습니다. 0.2 mM 캐리어 인산염이 있는 낮은 기저 수준 100 μCi의 경우 잘 작동하지만 GTP 풀과 동등해질 것으로 예상되는 (p)ppGpp 수준을 측정하려면 라벨을 25 또는 50 μCi로 떨어뜨릴 수 있습니다. 담체 인산염을 0.2 mM 이하로 낮추는 것은 인산염 수치가 성장을 제한하는 것을 피하는 것이 좋습니다. 주의: 32P는 β 방출 동위원소이므로 안전을 위해 지정된 적절한 차폐를 사용합니다. 모든 방사성 물질은 가능한 모든 예방 조치를 취하여 적절하게 폐기되어야 합니다.</li>
	<li>1 -2 배 (1 시간 이상)에 대한 흔들리는 인큐베이터에서 성장하여 외부 라벨이 스트레스를 유발하기 전에 세포 내 뉴클레오티드 풀과 크게 균형을 이수할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 스트레스 또는 기아의 유도
<ol><li>
신진 대사 경로 억제제 추가, 온도 변화, 필요한 영양소 소모, 삼투압 변화, 산화 스트레스 유도, 독소 추가 등과 같은 연구된 스트레스의 종류에 따라 선택한 방법으로 스트레스를 유도합니다.
	<ol>
<li>예를 들어, 대장균 K-12 균주에서 이솔루신 기아를 유도하기 위해 100 μg/mL L-valine을 추가합니다. ppGpp의 증가 된 수준은 유도 5 분 후에 관찰됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 샘플링 및 ppGpp 추출
<ol><li>얼음 차가운 6 M Formic 산의 20 μL을 포함하는 0.2 mL PCR 튜브에 각 표지 된 세포 샘플의 20 μL을 추가합니다.</li>
	<li>즉시 샘플을 드라이 아이스에 놓습니다.</li>
	<li>동결 및 해동 3주기로 세포 추출 효율을 향상시킵니다.</li>
	<li>PEI 셀룰로오스 얇은 층 크로마토그램을 발견하기 직전에, 크로마토그램에서 이를 발견하지 않도록 펠릿 세포 파편에 최대 속도로 1 분 동안 원심 분리기 샘플을 채우십시오.</li>
</ol>5. 얇은 층 크로마토그래피
<ol><li>부드러운 연필로, 가위로 위에서 5cm 를 제거 한 20cm x 20cm PEI-셀룰로오스 TLC 플레이트의 가장자리에서 원점 선을 표시합니다. 각 시료에 대해 PEI 표면에 5 μL을 액적으로 적용합니다. 이 지점이 마르지 않고 오름차순 개발을 시작하여 줄무늬를 최소화하여 해상도를 향상시킵니다.</li>
	<li>액체가 원점 샘플 스팟에 닿지 않도록1.5 M KH2 PO4 (pH 3.4) 용액의 층을 가진 탱크에서 오름차순 개발을 수행하십시오. 탱크를 밀폐 된 밀봉으로 덮고 15cm의 트림 시트 상단으로 액체상승을 허용하십시오. 1.5 M KH2PO4 용액에 대한 pH 3.4를 달성하려면H3 PO4를첨가하여 pH를 조절할 필요가 있다.</li>
	<li>완전히 개발된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 공기 건조.</li>
	<li>자유 32P를 함유하는 크로마토그램의 상부(pH 프런트) 부분을 방사성 폐기물로 자르고 버린다. 이 부분은 그림 2에서 노란색으로 표시되며 UV 광 하에서 쉽게 시각화됩니다. GTP보다 느리게 이동하는 (p)ppGpp 뉴클레오티드만 측정하는 경우 UV 가시 GTP 표준을 실행한 다음 더 큰 상부를 절단하고 폐기하는 것이 좋습니다(그림 2와같이 GTP 위의 모든 것).</li>
	<li>인광체 스크린으로 밤새 자가 방사선 필름을 노출합니다.</li>
	<li>필름을 개발합니다. 인광화체로 인광체 스크린 신호를 캡처하고 정량화합니다.</li>
</ol>6. (p)ppGpp의 정량화
<ol><li>이미지 J26,27로방사성 반점 의 양을 정량화합니다. 참고: (p)ppGpp의 양은 각 샘플에서 관찰되는 G 뉴클레오티드의총량으로 정규화될 수 있다(도 2). 배경의 양이 균일한 경우 배경에 대해 수정하기 위해 단일 공백(그림 2의 상자 4)을 뺄 수 있습니다. 총 G는 GTP + ppGpp + pppGpp 검출의 합계입니다. 이 정규화는 GMP와 GDP 수준이 무시할 수 있다고 가정합니다. 주어진 뉴클레오티드와 총 G의 비율은 적용된 샘플 체적의 변이를 교정하는 중요한 방법을 제공한다.</li>
</ol>7. ppGpp 붕괴속도 측정
참고: 이 프로토콜을 수정하면 ppGpp 붕괴 율을 측정할 수 있습니다.
<ol><li>ppGpp 축적을 허용하기에 충분한 시간 동안 스트레스 또는 기아를 유발한 후(단계 3), 지속적인 ppGpp 합성을 차단하기 위해 응력역전, 이는 가수분해 속도의 검출을 가능하게 한다. 반전 절차는 스트레스에 따라 달라집니다. 예를 들어, 200 μg/mL의 클로람페니콜을 추가하여 아미노산 결분의 경우를 반대로 합니다.</li>
	<li>부패율은 일반적으로 빠르지만 다양할 수 있으므로 20-30s마다 최대 2분마다 샘플을 채취하십시오. 4 단계에서와 같이 샘플을 처리합니다.</li>
	<li>TLC가 개발되면 (5 단계에서와 같이) 시간 과정 동안 얻은 ppGpp의 수준, 반 로그 플롯 대 시간에 잔류 ppGpp 함량을 플롯하여 부패의 제로 오더 레이트의 시각화를 허용하고, 직선으로, ppGpp 반감기의 추정.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

세포의 거의 균일 한 라벨링을 달성하는 것은이 프로토콜에 대한 중요한 단계입니다. 따라서 MOPS 또는 Tris 매체와 같은 정의된 매체의 사용은 담체 인산염 농도 및 특정 활성의 변이를 허용하는 데 매우 중요합니다. M9 또는 미디어 A와 같은 인산염 버퍼링 된 미디어는 사용할 수 없습니다. 대부분의 정의되지 않은 매체는 LB, 트립톤 및 카자미노산과 같은 가변적인 양의 인산염을 함유하고 있습니다. 인산동위원소 33P는32P로 대체될 수 있는 약한 방출기이며, 대체의 장점은 32P에 대해 14일 대신 25일의 반감기를 갖는다는 것이다. 그러나, 32P의 더 많은 에너지 방출은 검출 감도를 상당히 향상시킵니다. 동위원소 작업의 위험과 적절한 차폐 보호 및 폐기사용의 중요성을 강조하는 것이 중요합니다. 특히 ppGpp28을 검출할 수 있는 리보스위치의 최근 발견은 언젠가 시험관내 및 생체내에서 ppGpp를 검출...

(p)ppGpp 제2 메신저는 리보솜 및 아미노산을 합성하기 위한 유전자를 포함하는 다수의 유전자의 발현을 조절하는 글로벌 레귤레이터1,2. 처음에 대장균3에서 발견되었지만 , (p)ppGpp는 식물 엽록체4,5뿐만아니라 그람 양성 및 그램 음성 박테리아 모두에서 발견 될 수 있습니다. 대장균 및 기타 그람 음성 박테리아의 경우,(p)ppGpp는 두 개의 서로다른 부위6,7,8에서RNA 폴리머라제와 직접 상호 작용합니다. 그람 양성에서, (p)ppGpp는 조절9,10으로이어지는 유전자 특이적 DNA 인식 모티프를 가진 GTP 결합 단백질인 CodY에 의해 감지되는 GTP 풍부를 억제한다. (p)ppGpp는 다른 영양소 및 스트레스 조건에 대한 기아에 대한 응답으로 축적되어, 스트레스11,12에적응할 수 있도록 유전자 발현의 느린 성장 및 조정을 초래한다.
축적된 ppGpp의 순량은 합성체와 하이드라아제 활동 사이의 균형을 반영한다. 대장균RelA는 강한 합성이고 SpoT는 강한 하이드로 라제와 약한 합성으로, 각각스트레스 의존적 방식으로 다르게 조절될 수 있는 이중기능성이다. 강한 RelA 합성은 단백질 합성의 요구를 따라가지 못할 때 리보소말 A 부위에 결합된 코돈 지정 충전 tRNA의 가용성이 활성화되는 경우13,14,15. 약한 SpoT (p)ppGpp 합성효소는 강한 (p)ppGpp 하이드로라제는 다른 스트레스 조건 및 다른 메커니즘에 반응하여 억제되는 동안 활성화된다. 몇몇 조건하에서, ACP 또는 Rsd와 같은 단백질은 또한 가수분해와 합성16,17사이 균형을 바꾸는 SpoT에 묶일 수 있습니다. 그람 양성에서, 합성 및 가수 분해는 강한 합성 및 가수 분해 활동뿐만 아니라 작은 하이드로 라제 및 / 또는 합성 12와 단일 RelASpoT 상동체 (RSH) 단백질 사이의 더 복잡한 균형을 반영한다.
(p)ppGpp 뉴클레오티드는 아미노산 기아에 의해 유도된 엄격한 반응 동안 얇은 층 크로마토그램(TLC)의 자가 방사성도에 나타난특이한 32P표지 반점으로 처음 발견되었다 3. 더 자세한 라벨링 프로토콜은 18. 여기서 설명된프로토콜(도 1)은 마이크로티터 플레이트상에서 다중 샘플의 성장을 모니터링할 수 있는 이러한 프로토콜의 수정이다. 이는 (p)ppGpp 풍부도 변화의 여러 생물학적 및 기술적 추정치를 용이하게 하고처음에 19의 디오틱 시프트연구를 위해 개발되었다. (p)ppGpp의 라벨링(p)ppGpp와 32P및 TLC에 의한 검출은 또한 (p)ppGpp 저하율의 측정을 허용한다. (p)ppGpp 수준을 결정하기 위한 대체 방법이 개발되었으며, 이러한 질량 분석법, HPLC20,형광 화학센서21,22,및 GFP 유전자 융합ppPp23에의해 영향을 받는 프로모터에대한, 24. 형광 화학 센서는 현재 ppGpp 를 바인딩 한 후 작은 스펙트럼 이동뿐만 아니라 ppGpp와 pppGpp21을구별하는 문제로 인해 제한된 사용이 있습니다. 이 방법은 시험관 내에서 (p)ppGpp를 검출하는 데 효율적이지만 세포 추출물에서는 검출하지 않는다. HPLC와 관련된 방법은20개 개선되었지만 고가의 장비가 필요하며 높은 스루풋에 잘 적응되지 않았습니다. 마지막으로, GFP 융합은 ppGpp 의존적 활성화 또는 억제의 추정치를 제공할 수 있지만, ppGpp 자체를 측정하지는 않는다. 이러한 대체 방법 각각은 가치가 있지만 값비싼 장비 나 실질적인 실습 시간이 필요하거나 여러 역학 샘플링 및 후속 처리를 수행할 수 없습니다. 여기에 설명된 방법을 통해 96개의 샘플을 약 20분(플레이트당 18개 샘플)에 6개의 TLC 플레이트에 적용할 수 있으며, TLC 개발에 의해 2시간 이내에 해결되며, 라벨링에 따라 몇 시간 또는 하룻밤 후에 얻은 정량적 데이터로 해결됩니다. 강도.

<table><tbody><tr><td>(NH4)6(MO7)24</td><td>Fisher Scientifics</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography film</td><td>Denville scientific inc.</td><td>E3218</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T.Baker</td><td>1-1309</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>RPI</td><td>C61000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Fisher Scientifics</td><td>C-371</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>J.T.Baker</td><td>1843</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4</td><td>Fisher Scientifics</td><td>I-146</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP1215-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>마크롱</td><td>4912-12</td><td></td></tr><tr><td>H3BO4</td><td>Macron</td><td>2549-04</td><td></td></tr><tr><td>H3PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>0260-02</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Sigma</td><td>P9458-250G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma</td><td>V-6504</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientifics</td><td>FL-06-0303</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더 Synergy HT</td><td>Biotek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>시그마</td><td>M-9522</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마</td><td>M1254-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</</td><td>sub>Mallinckrodt</td><td>7892</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T.Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171-500G</td><td></td></tr><tr><td>P-32 방사성 핵종, 1 mL 물(5 mCi)에 있는 오르토인산</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX053005MC</td><td></td></tr><tr><td>저장 형광체 스크린</td><td>Kodak</td><td>So230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thiamine Sigma</td><td>T-4625</td><td></td></tr><tr><td>TLC PEI Cellulose F</td><td>Merk-Millipore</td><td>1.05579.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>RPI</td><td>T2400-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400 이미저</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Fisher Scientifics</td><td>Z-68</td><td></td></tr></tbody></table>

대장균 (p)ppgpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

(p)pppp 뉴클레오티드는 다양한 신체적 및 영양적 스트레스에 반응하여 박테리아에서 글로벌 조절제로서 기능한다. 그것은 GTP 풀의 접근 또는 초과 수준의 축적에 이르게 초, 빠른 발병이있다. 스트레스 반전은 (p)ppGpp의 급속한 실종을 발생, 종종 1 분 미만의 반감기와. (p)ppGpp의 존재는 스트레스의 해로운 영향에 대응하는 세포 유전자 발현 및 신진 대사의 변경으로 이됩니다. 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 서로 다른 반응 메커니즘을 가지고 있지만 둘 다 (p)ppGpp 농도에 의존한다. 어쨌든, 중요한 스트레스 전환 기간 동안 10 초에서 시간까지 다를 수있는 시간 간격으로 많은 방사성 표지 된 박테리아 배양을 동시에 모니터링 할 필요가 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 기술적 문제를 해결합니다. 이 방법은 온도 및 셰이커 제어 마이크로 티터 접시 인큐베이터를 활용하여 성장 (흡광도)의 병렬 모니터링및 균일한 인산염 방사성 표지 배양물의 신속한 샘플링을 통해 뉴클레오티드 풀을 해결하고 정량화합니다. PEI 셀룰로오스에 얇은 층 크로마토그래피. 분석의 여러 기술적 및 생물학적 복제에 소량의 샘플이 필요합니다. 이러한 복잡한 성장 전환, 예컨대 급속한 성장 및 급속한 (p)ppGpp 이직률은 이 방법에 의해 정량적으로 평가될 수 있다.

대장균 K-12 균주에서 발린을 첨가하면 isoleucine의 내인성 기아가 유발되어 5 분3후 ppGpp 수치가 증가합니다. ILV를 제외한 모든 아미노산을 함유하는 MOPS에서 성장한 세포는 도1에 도시된 바와 같이 32P로표지되었다. 일단 라벨이 붙으면, 10 mg/mL L-발린(100 μg/mL 최종 농도)의 6 μL이 첨가되어 이솔루신 기아를 일으킵니다. 샘플을 발린을 첨가한 후 0 및 5분 후에 채취하였다. 5분 후(도3A),ppGpp 및 pppGpp의 수준에서 2 및 2.5배 증가가 발생했다. 음성 대조군으로서, 무세포 표지된 샘플은 32P소스에서 정형외과가 아닌 가능한 화합물을 검출하는데 사용되었다. 또한, 음의 대조군으로서 ppGpp 결핍 균주(ΔrelA Δ스poT)를포함하면 반점의 더 나...

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

이 방법은 다른 성장 조건 과 스트레스 상황에서 글로벌 레귤레이터 ppGpp의 수준을 측정합니다. PpGpp는 엽록소에서뿐만 아니라 그램 양성 및 부정적인 박테리아에서 찾을 수 있습니다. PpGpp는 몇 초 만에 빠른 발병을 가지고 있으며, 스트레스가 생성되면 빠른 두 번째 관계로 이어집니다.동시에, 그것은 짧은 반감기, 최대 30 초있다. 따라서 응력 전환을 포함하여 10초에서 시간까지 다를 수 있는 시간 간격으로 많은 배양을 모니터링할 필요가 있습니다. 우리는 또한 마이크로 티터 접시에 있는 방사선 라벨 세균 성 배양은 다중 기술및 생물학 복제를 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다.방사성 물질로 작업할 때 적절한 안전 조치를 따라야 합니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어를 준비합니다. 3 밀리머 나트륨 인산염으로 MOPS 미디어에서 하룻밤 문화를 성장.MOPS 매체의 550 마이크로리터를 추가하여 0.2 마이크로몰라 나트륨 인산염 캐리어와 24웰 플레이트의 우물에 각 세균 성 무접종30 마이크로리터를 연속합니다. 이렇게 하면 OD600이 0.1의 초기 접종을 받게 됩니다. 멸균 제어뿐만 아니라 신선한 미디어를 하나에 추가합니다.흔들리는 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도에 놓고 900 RPM에서 30 분 동안 흔들어 놓습니다. 동일한 조건에서 배양하는 동안 플레이트 리더기를 사용하여 p32가 부족한 미디어에서 복제 플레이트를 병렬로 복제한 플레이트 판독기를 사용하여 성장을 모니터링할 수 있습니다. 다음으로, 접시의 각 웰에 p32 orthphosphate의 100 마이크로 큐리를 추가합니다.외부 라벨이 세포 간 뉴클레오티드 풀과 크게 평형화할 수 있도록 1~2배의 이중배로 흔들리는 인큐베이터에서 배양을 성장시키게 한다. 적절한 시각화를 위해 이 비디오에서 활성 재질이 사용되지 않았습니다. 실제 실험에서는 적절한 차폐뿐만 아니라 측량 계측기의 오염에 대한 지속적인 모니터링이 필요합니다.먼저, 연구된 스트레스의 종류에 적합한 방법을 사용하여 스트레스를 유도한다. 다음으로, 각 표지된 세포 샘플의 마이크로리터 20개를 별도의 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 추가하여 20마이크로리터의 얼음 냉간 6개의 어금산이 함유되어 있습니다. 즉시 드라이 아이스에 샘플을 배치합니다.동결 및 해동의 세 주기에 의해 세포 추출 효율을 향상시킵니다. PEI 셀룰로오스 얇은 층 크로마토그램을 발견하기 직전에, 원심 분리는 펠릿 세포 파편에 최대 속도로 1 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 먼저, 20% 20센티미터 PEI 셀룰로오스 TLC 플레이트를 설정합니다.가위를 사용하여 상위 5센티미터를 제거합니다. 그리고 부드러운 연필을 사용하여 가장자리에서 1 센티미터 떨어진 원점 선을 표시합니다. 각 샘플의 5개의 마이크로리터 액자를 PEI 표면에 적용합니다.반점이 건조되기 전에, 원산지 시점을 만지지 않을 정도로 얕은 1.5 개의 어금반 모노칼타슘 인산염층을 포함하는 탱크로 플레이트를 옮기. 밀폐 씰로 탱크를 덮고 15센티미터 트리밍 시트의 상단으로 액체 상승을 허용합니다. 그 후, 완전히 발달 된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 공기 건조.무료 P32를 함유한 크로마토그램의 상부 부분을 방사성 폐기물로 잘라버리고 버립니다. 인광 화면을 사용하여 밤새 오디오 라디오 필름을 노출하십시오. 다음 날, 필름을 개발하고 인광의 녹색 신호를 캡처하고 양을 양화하기 위해 인광기 이미지를 사용합니다.그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 방사성 반점을 양량화합니다. ppGpp 축적을 허용하기에 충분한 시간 동안 스트레스 나 기아를 자극 한 후 적절한 방법을 사용하여 스트레스를 반전시면 됩니다. 20~30초마다 샘플을 최대 2분 동안 채취하고 이전에 설명한 대로 샘플을 처리합니다.TLC가 개발되고 시간 과정에서 ppGpp의 수준을 얻으면 잔여 ppGpp 콘텐츠를 반로개반성 플롯에 플롯합니다. 이 연구에서는, ILV를 제외한 모든 아미노산을 함유하는 MOPS에서 자란 세포는 P32로 표시된다. 일단 라벨이 붙으면 L valine이 첨가되어 이솔루신 기아를 생성합니다.5 분 후, 구아노신의 테트라 와 펜타 포스 페이트의 수준에 있는 2 그리고 2 반 오래된 증가가 일어났습니다. 세포 무표지 샘플의 부정적인 제어는 P32 소스에서 직교하지 않는 가능한 화합물을 검출하는 데 사용됩니다. 이솔루신 기아의 반전은 단백질 합성 억제제인 클로람페니콜(chloramphenicol)에 의해 달성될 수 있으며, 이는 충전된 이솔루신 tRNA의 소비를 감소시키고, 차례로 충전되지 않은 tRNA에 대한 높은 비율을 회복시킨다.강력한 레라 매개 ppGpp synthetase의 활성화는 폐지되며, 이는 잔류 합성에 의해 흔들리지 않는 ppGpp 분해의 측정을 허용한다. 이 경우 ppGpp는 약 64 초의 반감기로 부패합니다. 어떤 긴장 또는 기아를 유도 하기 전에 균일 한 라벨을 달성 하기 위해 세포의 몇 세대에 대 한 성장 하는 것이 중요 하다.ppGpp는 박테리아 중 널리 퍼져 있기 때문에,이 방법은 다른 유기체에 적용 될 수있다. TLC 개발 방법의 수정은 ppApp와 같은 모든 규제 뉴클레오티드의 적절한 분리를 허용할 수 있었다. P52는 더 나은 방사제 동위 원소이므로 적절한 차폐를 사용하고 잔류물을 올바르게 폐기하는 것이 중요합니다.

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형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

출처: Fernández-Coll, L. 및 Cashel, M. 대 장균 (p)ppGpp의 다중 생체 내 측정에 이어 박층 크로마토그래피를 위해 마이크로타이터 접시 방사성 표지를 사용합니다. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 박테리아 스트레스 반응 뉴클레오티드 ppGpp 및 pppGpp의 수준과 역학을 측정하기 위한 고처리량 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다양한 스트레스 조건에서 박테리아 배양에서 (p)ppGpp를 정량화하는 강력하고 신속하며 비용 효율적인 접근 방식을 제공하여 박테리아 생리학 및 엄격한 반응에 대한 고해상도 분석을 가능하게 합니다.

스트레스 유도 박테리아에서 분리된 (p)ppGpp 뉴클레오티드의 박층 크로마토그래피 기반 분리

이 비디오는 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 피로포스포키나제 활성을 결정하기 위한 박층 크로마토그래피 기반 효소 분석을 보여줍니다. 이 방법은 뉴클레오티드 합성 및 인산 전달 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.

박층 크로마토그래피 기반 효소 활성 분석: 박층 크로마토그래피를 사용하여 체외 피로포스포키나제 활성을 측정하는 기술

이 동영상은 세포 내 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 단백질의 체계적인 고처리량 스크리닝 기술인 리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 보여줍니다. 이 기술은 세포 용해물에서 과발현된 표적 단백질에 메신저를 직접 결합할 수 있게 하여 단백질 정제의 필요성을 우회할 수 있습니다.

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여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

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대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

리간드 분석(DRaCALA)의 차동 적개 모세관 작용은 ORFeome 라이브러리를 사용하여 유기체의 작은 리간 결합 단백질을 식별하는 데 사용될 수 있다.

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

배우세요 대장균에서 방사성 라벨링과 얇은 층 크로마토그래피를 이용하여 다양한 생리적 스트레스 조건에서 ppGpp 수준을 측정하는 고효율 분석 방법을. 이 기술은 세균의 뉴클레오타이드 조절 메커니즘 연구에 필수적입니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

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