Name: 살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 살아있는 마우스의 등도 해마 CA1에서 세로 2광자 화상 촬영을 통해 기억 형성과 회상 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 수 주에 걸쳐 신경 구조 가소성과 활동 유발 세포 가소성을 미세미터 수준 해상도로 관찰할 수 있게 합니다.

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U. A. F.는 슈람 재단의 지원을 받고 있습니다. C.-W. T. P. 및 W. G. 맥스 플랑크 소사이어티의 지원을 받습니다. L.Y. 및 R.Y.는 막스 플랑크 학회 및 국립 보건 원 (R01MH080047, 1DP1NS096787)에 의해 지원됩니다. A. C. 유럽 연구위원회에서 FP7 그랜트에 의해 지원됩니다, ERANET 및 I-CORE 프로그램, 보건의 이스라엘 정부의 수석 과학자 사무실, 교육 및 연구의 연방 정부, 로베르토와 레나타 루만, 브루노와 시몬 리치, 넬라와 레온 베노지요 신경 질환 센터, 생물 의학 이미징 및 유전체학에 대한 헨리 차노흐 크렌터 연구소, 이스라엘 과학 재단 펄만 가족, 아델리스, 마크 베센, 프랫과 어빙 I. 모스코비츠 재단; A. A.는 막스 플랑크 소사이어티, 슈람 재단, 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)의 지원을 받고 있습니다. 3P 심상은 신경과학을 위한 막스 플랑크 플로리다 연구소에 신경 화상 진찰 기술에 고급 과정 도중 취득되었습니다. 신경 이미징 기술에 대한 고급 과정은 막스 플랑크 사회, 플로리다 주 맥스 플랑크 과학 펠로우십 프로그램 및 막스 플랑크 플로리다 연구소 기업 파트너십 프로그램에 의해 지원됩니다. 우리는 과정 동안 2P / 3P 이미징 시스템에 대한 지원 및 장비를 제공하는 Thorlabs, 코히런트 및 스펙트럼 물리학에 감사드립니다. 헨리 헤이벌레와 멜리사 에벌레가 이 과정을 진행하는 동안 이 시스템에 도움을 주신 것에 대해서도 감사드립니다.

설명 된 모든 방법은 상부 바이에른 정부 (라이센스 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48)와 스탠포드 와 막스 플랑크 플로리다 연구소에 의해 실험실 동물 관리에 대한 신경 과학 관리 패널에 의해 승인되었습니다.
1. 이미징 캐뉼라 의 준비
<ol><li>이동식 눈금자 테이블이 제공된 드릴 스탠드에서 정밀 드릴을 잡습니다.</li>
	<li>3.0mm 직경의 스테인리스 스틸 튜브를 이동식 눈금자 테이블에 고정합니다.</li>
	<li>튜브를 1.6mm 길이의 금속 링으로 자릅니다. 절단 후 링의 가장자리가 무디지 않으면 요철을 피하십시오.</li>
	<li>금속 링과 원형 4mm 직경의 유리 커버슬립을 100% 아세톤으로 헹구고 5분 간 건조시면 됩니다.</li>
	<li>금속 링과 유리 커버슬립을 스테레오스코프 아래에 부드럽고 균일하고 깨끗한 작업장소에 놓습니다.</li>
	<li>페트리 접시와 같은 매끄러운 표면에 UV 경화 광학 접착제 한 방울을 떨어 뜨립니다. 바늘이나 주걱을 사용하여 접착제를 펴서 얇은 (&lt;0.5 mm) 층을 형성하십시오.</li>
	<li>금속 링의 한쪽면을 접착제에 담그려면 집게를 사용합니다. 링 의 내부를 밀봉하지 않도록 주의하십시오. 이 경우 바늘을 사용하여 링의 광학 접착제를 부수게 하십시오.</li>
	<li>스테레오스코프를 사용하여 금속 링을 유리 커버슬립중앙에 놓고 덮개 슬립에 접착제로 덮인 링 의 측면을 배치합니다. 금속 링과 커버슬립 사이의 계면에 접착제의 얇은 링이 형성되어야 합니다. 커버슬립 중앙으로 접착제가 퍼지는 것을 피하십시오.</li>
	<li>UV 경화 LED 드라이버 유닛을 켜고 1 분 동안 빛 (365 nm)을 밝춥니다. 주의: 자외선은 피부 화상을 유발하며 돌연변이 치료제입니다. 자외선 차단 안경을 착용하고 장갑과 실험실 코트로 손과 팔을 덮어 피부 노출을 피하십시오.</li>
	<li>접착제를 고르게 경화하려면 광원의 방향을 변경하여 링의 모든 면이 똑같이 비춰지도록 하십시오.</li>
	<li>접착제를 적어도 2 시간 동안 경화시키십시오, 바람직하게는, 하룻밤.</li>
	<li>금속 링의 열린 끝에서 캐뉼라를 단단히 고정하여 지혈에 의해 잡습니다. 회전 파일이 장착된 치과 용 드릴을 사용하여 스테레오스코프 아래에서 작업하고 링의 측면과플러시 될 때까지 여분의 유리 커버 슬립을 제거하십시오 (그림 1A).</li>
</ol>2. 등쪽 해마 위에 화상 진찰 캐뉼라의 이식
<ol><li>장비 및 설치 준비
	<ol>
<li>모든 수술 기구가 깨끗하고 멸균되어 있는지 확인하십시오. 멸균을 위해 유리 비드 멸균기를 사용하는 경우, 기기를 청소하고 사용하기 전에 10 분 동안 멸균기 (250 °C로 설정)에 놓습니다. 또는 사용하기 전에 기기를 오토클레이브하십시오.</li>
		<li>수술기구뿐만 아니라 수술기구에 필요한 모든 자료를 준비하여 쉽게 도달할 수 있도록 하십시오.</li>
		<li>진통제 나 항 염증 약물과 같은 충분히 갓 준비 된 약물이 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>수술 기간 내내 충분한 이소플루란이 있는지 확인하십시오 (수술 당 약 1 시간).</li>
		<li>가열 카펫을 켜고 마취 상태에서 동물의 온도를 안정적으로 유지하기 위해 37 °C로 설정합니다.</li>
		<li>이소플루란의 청소 시스템이 작동하는지 확인합니다.</li>
		<li>산소 흐름의 밸브를 엽니 다.</li>
	</ol></li>
	<li>마취 유도 및 동물 고정
	<ol>
<li>마취 유도 챔버에 마우스를 놓고 3% 이소플루란 1 L/min O 2에 의식을 잃을 때까지 기다립니다. 발가락 핀치 반사 테스트를 사용하여 마취를 평가합니다.</li>
		<li>동물의 무게를 측정합니다.</li>
		<li>항 염증제를 적용 (멜 록시 캄, 1mg / Kg) 및 진통제 (Vetalgin, 200mg / kg) 약물 피하.</li>
		<li>가열 카펫에 마우스를 놓습니다. 동물이 가열 카펫과 직접 접촉하지 않도록 하여 열 화상을 피하십시오.</li>
		<li>머리를 입체 장치에 고정하고 코 콘을 배치하여 주전자를 덮습니다. 마취를 유지하려면 이소플루란을 1.5-2 %로 줄이면됩니다. 수술 내내, 시각적으로 호흡을 모니터링하고 발가락 핀치 반사를 테스트하여 마우스 상태를 모니터링합니다. 필요한 경우 이소플루란 백분율을 조절하십시오.</li>
		<li>눈에 안과 연고를 바르면 탈수와 실명을 예방할 수 있습니다. 참고 : 마취 및 동물 약물의 경우 대체 방법과 약물이 가능합니다. 동물 면허증과 상대 문헌을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>광학 캐뉼라 이식
	<ol><li>광섬유 광원을 켭니다.</li>
		<li>머리카락을 제거하고 마우스 머리 위로 피부를 소독합니다.</li>
		<li>가위와 집게를 사용하여 마우스 두피를 제거합니다. 람다에 가까운 위치에서 두피에 작은 컷으로 시작합니다. 양면에 두피를 열어 계속합니다. 먼저 귀 방향으로 횡방향으로 이동한 다음, 눈 궤도 방향으로 장전하여 시상 축에 삼각형을 형성하고, 약 4 mm 로스트랄을 bregma로 이동합니다. 귀와 눈에 너무 가까이 자르지 말고, 브레그마와 람다뿐만 아니라 정수리 뼈와 정면 뼈의 후방 절반을 노출하십시오.</li>
		<li>두개골에 리도카인 1방울(28.9% v/v)을 바르고 있습니다.</li>
		<li>골막을 지우고 면봉을 사용하여 두개골을 건조시십시오.</li>
		<li>마우스 헤드를 고정하려면 이어 바를 놓습니다.</li>
		<li>0.5mm 너비의 버가 있는 마이크로 드릴을 사용하여 작은 개두체 를 만듭니다. 심상해 해마 반대쪽 의 정면 뼈에 구멍을 위치, 약 1.5 시상 봉합사에서 약 1.5 mm 와 관상 봉합사에서 2 mm 거리.</li>
		<li>0.86mm 너비의 스테인리스 스틸 뼈 나사를 두개골 구멍에 나사로 조입니다.</li>
		<li>필요한 경우, 파편을 청소하고 두개골을 건조.</li>
		<li>빠른 접착제 시멘트의 혼합물의 제조
		<ol>
<li>작은 숟가락(직경 4.5mm)을 사용하여 L-파우더 1-1-5 레벨 스쿱을 잘 섞어 넣으세요.</li>
			<li>빠른 베이스를 3-4 방울을 우물에 넣습니다.</li>
			<li>범용 촉매 1방울을 우물에 분배합니다.</li>
			<li>정밀 어플리케이터를 사용하여 5-10초 동안 믹스를 저어줍니다. 참고: 대체 시멘트를 사용할 수 있습니다. 제조업체의 지침을 참조하십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>정밀 도포기를 사용하여 두개골, 나사 및 주변 피부에 빠른 접착 시멘트를 적용하십시오. 30s 에서 1 분 동안 건조시키십시오.</li>
		<li>3.0 mm 직경의 트레핀 드릴을 사용하여 정수리 뼈에 개두를 만듭니다. 시상 봉합사에서 약 1.5 mm 떨어진 구멍을 놓고 람도이드 봉합사에서 2mm 떨어진 위치에 놓습니다.</li>
		<li>조심스럽게 뼈 플랩을 제거합니다.</li>
		<li>캐뉼라를 사용하여 개두술의 크기를 확인하여 맞는지 확인하십시오. 필요한 경우 0.5mm 또는 0.9mm 너비의 마이크로 드릴을 사용하여 개두량을 확대하십시오.</li>
		<li>듀몬트 집게를 사용하여 수막을 제거합니다.</li>
		<li>외부 캡슐에 도달하기 위해 피질 물질을 절제하십시오. 진공 펌프에 연결된 0.9mm 직경(19게이지) 무딘 바늘을 사용하십시오. 노출된 조직의 탈수를 피하고 출혈이 해결된 후 잔여 혈액을 씻어내도록 식염수로 관개하십시오. 피질 조직을 천천히 빨아, 한 번에 50-100 μm, 캡슐에서 피질이 분리 될 때까지, cingulum 또는 코퍼스 callosum의섬유를 노출. 바늘을 자주 변경, 막힘을 방지 하기 위해.</li>
		<li>섬유는 주로 세 방향으로확장됩니다(그림 1B). 가장 깊은 섬유 (해마의알베우스)가 노출 될 때까지 등지 섬유를 조심스럽게 벗깁니다.</li>
		<li>식염수로 조직을 헹입니다. 얇은 포셉을 사용하여 바닥 캐뉼라를 식염수에 담그고 두개골 구멍 위에 놓습니다. 캐뉼라와 조직은 캐뉼라와 조직 사이에 기포가 끼어들지 않도록 식염수로 밀봉해야 합니다.</li>
		<li>유리 커버슬립이 섬유와접촉할 때까지 캐뉼라를 두개골(그림 1C)에 밀어 넣습니다.</li>
		<li>흡수 삼각형, 면봉 및 / 또는 진공 펌프를 사용하여 두개골을 잘 건조시면 됩니다.</li>
		<li>빠른 접착제 시멘트의 혼합물의 제조 (2.3.10 단계를 참조하십시오).</li>
		<li>정밀 도포기를 사용하여 두개골 에 빠른 접착 시멘트를 적용하십시오. 캐뉼라 테두리에도 접착제를 바하십시오. 접착제가 캐뉼라에 흘러 들어가지 않도록 주의하십시오. 30s 에서 1 분 동안 건조시키십시오.</li>
		<li>스테레오택시 암을 사용하여 두개골과 접촉하여 헤드 홀더 플레이트를 캐뉼라 위에 배치합니다.</li>
		<li>치과 아크릴의 혼합물의 준비
		<ol>
<li>숟가락(직경 9mm)을 사용하여 1 레벨 스쿱(1부)을 잘 섞어 넣으세요.</li>
			<li>같은 우물에서 액체 2-3 부분을 분배하십시오. 전체 분말을 액체로 덮습니다.</li>
			<li>주걱을 사용하여 1분 간 저어주세요. 참고 : 대체 아크릴을 사용할 수 있습니다. 제조업체의 지침을 참조하십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>주걱 또는 정밀 어플리케이터를 사용하여 두개골에 아크릴을 적용하십시오. 노출 된 두개골 전체, 나사 및 치과 아크릴로 열린 피부를 덮습니다. 이것은 준비를 안정하게 합니다. 아크릴이 목, 귀, 눈을 내리게 하지 마십시오.</li>
		<li>아크릴을 건조시키고 약 15 분 동안 경화시키십시오.</li>
		<li>탈착식 접착제 필름을 헤드 홀더 플레이트에 부착하여 이물질이 캐뉼라에 유입되는 것을 방지합니다. 필름 크기는 플레이트의 크기와 일치하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>이소플루란 흐름을 끄고, 입체 장치에서 동물을 제거하고 마취에서 깨어나는 동안 생리적 체온을 유지하기 위해 가열 판에 놓습니다.</li>
		<li>동물이 흉골 의전성을 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 모니터링하십시오.</li>
		<li>완전히 회복된 경우에만 수술을 받은 동물을 다른 동물의 회사에 반환하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 수술 후 치료
<ol><li>체중과 일반적인 행동을 모니터링하여 수술 후 2 일 동안 마우스의 상태를 확인하십시오.</li>
	<li>항염증제(멜록시캄, 1mg/Kg) 및 진통제(Vetalgin, 200mg/kg) 약물을 수술 후 2일 동안 피하로 적용 참고: 대체 모니터링 절차, 약물 및 복용량은 수술 후 치료에 대 한 가능. 동물 면허증과 상대 문헌을 참조하십시오.</li>
</ol>4. 이미징 세션 준비
<ol><li>이미징 설정을 미리 켜고 필요한 경우 레이저가 예열되고 안정화될 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>마우스를 마취합니다(2.2.1단계 참조).</li>
	<li>집게를 사용하여 헤드 홀더 플레이트에서 점착 필름을 조심스럽게 제거합니다. 마우스를 손에 들고 머리 홀더 플레이트를 손가락으로 잡습니다. 준비를 손상시키지 않도록 필름을 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>마우스를 현미경 아래에 놓고 가열 카펫 위에 놓고 헤드 플레이트를홀더에 고정합니다(그림 1D).</li>
	<li>코 콘을 배치하여 주유를 덮고 이소플루란을 1.5-2%로 줄입니다.</li>
	<li>마우스 눈에 안과 연고를 바하십시오.</li>
	<li>탈이온수로 헹구어 이미징 캐뉼라를 청소합니다. 주사기와 얇은 바늘을 사용하여 캐뉼라에 물을 떨어뜨리고 진공 펌프를 사용하여 제거하십시오.</li>
</ol>5. 이미징 세션
<ol><li>낮은 배율, 장거리 목표를 사용하여 캐뉼라에 잔류 물, 먼지, 무결성 및 형광이 있는지 시각적으로 확인합니다.</li>
	<li>헤드 홀더 암의 각도를 조정하여 캐뉼러를 광학 축에 맞춥습니다.</li>
	<li>25X 1.0 NA, 4mm WD 또는 40X 0.8 NA, 3mm WD, 침수 목표로 전환합니다. 캐뉼라를 채우고 캐뉼라 위에 여분의 물을 유지하기 위해 충분한 탈이온 수를 추가하십시오. 기포의 형성을 피하십시오.</li>
	<li>2P 여기 및 이미지 형광 신호를 사용합니다. 참고: 이미징 프로토콜은 이미지화할 시간과 공간 척도에 크게 의존합니다. 이 문서에 표시된 이미지를 생성하는 데 사용한 이미징 설정에 대한 자세한 내용은 대표 결과 및 토론을 참조하십시오.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기서, 살아있는 마우스에서 등쪽 CA1의 반복된 2P 이미징을 위한 절차가 기재되어 있다. 수술 후, 마우스는 일반적으로 2 일 이내에 회복. 절차는 최소한의 천체 성 동맥 을 유도26,43. 수술을 따를 지도 모르다 출혈 과 부종은 일반적으로 10 14 일 안에 재흡착됩니다. 일반적으로, 14 일 이식 후 이후에서 준비는 충분히 명확 하 게 활력 내 이미징을 수행 하기 위해. 수술의 성공은 멸균 환경에서의 작업에 의존하지 않습니다. 그러나, 위생의 높은 수준을 유지 하는 것이 중요 하다, 수술 관련 된 감염으로 인해 합병증을 피하기 위해. 이것은 수술 전후에 수술 기구를 꼼꼼하게 청소하고 각 사용 직전에 열 멸균하여 얻어진다 (단계 2.1.1). 광학 캐뉼러는 깨끗하고 멸균된 용기에 보관되고 이식 직전에 멸균 식염수로 헹굴 수 있습니다. 손 소독 및 수술 스테이션의 청소의 일반적인 수술 관행을 수행하는 것도 매우 중요합니다. 준비는 안정되어 있고 몇 주 동안 세포 및 세포 및 세포 이하 해상도 화상 진찰을 허용합니다26,35.
중요한 단계, 수정 및 문제 해결.
가장 깊은 섬유가 노출 될 때까지 외부 캡슐을 벗기는 것이 중요합니다. 3mm 또는 4mm WD로 상업적 목표를 사용할 경우 알베우스를 노출하지 않으면 PN의 소마에 초점을 맞출 수 없거나 해상도가 감소된 수지상 척추에 초점을 맞출 수 없습니다. 이 목적을 위해, 0.9 mm 직경 의 바늘을 사용하여 신피질을 매우 천천히 제거 한 다음 0.3-0.5 mm 직경 (24-29 게이지) 바늘로 전환하여 가장 등쪽 섬유를 제거 할 때 흡입을 보다 세밀하게 제어하는 것이 유용합니다. 대안적으로, 미세 집게는 섬유노출(36)후에 나머지 피질을 제거하는데 사용될 수 있다.
혈액이 시야를 가리기 때문에 수술 중 출혈은 문제가 될 수 있습니다. 혈전이 형성될 때까지 기다린 다음 남은 혈액을 씻어식염수로 헹구는 것이 좋습니다. 필요에 따라 반복합니다.
캐뉼라와 개두술 사이에 꼭 맞는 것은 특히 캐뉼라의 바깥쪽 가장자리가 두개골과 플러시되는 경우 시멘트를 적용하기 전에 캐뉼러를 제자리에 유지하여 준비의 안정성을 높이는 데 도움이됩니다. 트레핀 드릴과 캐뉼라의 크기가 일치하기 때문에 캐뉼라 측면의 요철로 인해 느슨한 착용감이 발생할 수 있습니다 - 약간 더 큰 두개두개미가 필요합니다 (단계 2.3.14 참조) 또는 불규칙한 개두술. 모든 캐뉼라 부정행위는 반드시 제기되어야 하며(1.3단계 및 1.12단계) 트레핀은 두개골 절제술이 완료될 때까지 두개골에 수직으로 유지되어야 합니다(단계 2.3.12). 개두술이 완료되기 전에 두개골에서 trephine를 제거하는 것은 불규칙한 두개두개절을 초래할 수 있습니다.
제한 사항- 침략과 준비의 안정성.
직접 및 간접적으로 영향을받는 영역을 정확하게 정의하는 것이 힘들기 때문에 피질 절제의 효과를 평가하기가 어렵습니다. 일반적으로, 수술은 정수리 피질의 부분과 시각 및 뒷다리 감각 피질(21)의일부를 제거합니다. 압제 된 피질은 해마에 직접 투영되지 않으며 해마 조직은 만지지도 다치지도 않습니다. 중요한 것은, 이미징 캐뉼라의 이식이 해마 기능 및 특히 해마 의존적 학습21,36,37,38, 39. 여전히, 캐뉼라와 임플란트의 외부 부분 (헤드 홀더 플레이트 및 치과 아크릴 캡)이 코르티코스테론 혈중 농도와 부신 무게를 평가하여 만성 스트레스인 정도를 정량화하는 것이 중요합니다. 이식되지 않은 마우스.
준비는 일반적으로 주에서 달26에안정적으로 남아 있습니다. 장기적으로, 피부와 뼈의 성장은 아크릴 캡을 대체하고 이미징 제제의 불안정성을 증가시키는 경향이 있다.
광학적 한계.
기존의 2P 현미경 검사법은 신피질 조직40,41에약 1 mm 깊이까지 이미징을 허용합니다. 이와 일치하여, SR(도 2D-F) 또는 SLM36에위치한 수상돌기 및 수지상 척추를 이미지화할 수 있다. 그러나, 캐뉼라를 통한 이미징은 효과적인 NA에 한계를 제기한다. 최대 해상도를 달성하기 위해 이미징 캐뉼라의 직경과 깊이는 더 작은 직경과 더 긴 깊이가 높은 NA 목표의 빛을 클립으로, 이미징 NA에 일치해야합니다. 예를 들어, 1.6mm 길이의 캐뉼라를 통해 1.0 NA 수몰입 목표를 가지고 이미징할 때, 전체 NA를 유지하기 위해 3.65mm 내경이 필요합니다. 그러나이 직경의 캐뉼라를 사용하면 해마의 압축이 증가하고 조직의 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 직경이 작은 캐뉼라를 사용합니다. 1.6 mm 길이의 캐뉼라를 통해 0.8 NA 수분 침지 목적으로 이미징할 때, 2.5 mm의 내경은 전체 NA를 유지하기에 충분할 것이다. 그러나 0.8 NA 수분 침지 목표는 WD(경우 3mm)가 짧아 SP에 초점을 맞추는 것을 방지할 수 있습니다.
이러한 계산은 캐뉼라 하단의 시야 중심에 적용됩니다. 그러나, 시야의 이미징 필드를 옆으로 움직이면 캐뉼라 가장자리에 더 가깝게 또는 조직 깊숙이 초점을 맞추거나 캐뉼라의 유리 표면에서 더 멀리 집중하면 초점 평면에서 효과적인 NA가 더 감소하여 해상도가 감소합니다. 이것은 심상 조직의 상이한 양에 걸쳐 비 균일한 해결책으로 이끌어 낼 것이고, 특히 2P-STED 현미경42와같은 초고해상도 기술을 사용하는 경우에, 세포내 체질 에서 정량적인 화상 진찰을 위한 관심사일 수 있습니다. 이 문제는 세포 해상도에서 화상 진찰할 때 보다 적게 중요합니다.
조직 운동.
조직 내의 운동 - 마취된 동물에 있는 호흡 그리고 심박동에서 유래하는 - 화상 진찰 캐뉼라에서 증가한 거리로 더 가혹하게 되는 경향이 있습니다. 이것은 아마도 이미징 캐뉼라가 뇌에 기계적 압력을 가하여 캐뉼라 부근의 일부 움직임을 중화하기 때문일 수 있습니다 (신피질 제제와 유사하게). 따라서, 수지상 척추의 이미징은 SR과 SLM에서 가능하지만, 우리의 손에, 그것은 캐뉼라의 표면에서 200 μm까지 SO에 가장 견고한 등쪽이다. 움직임을 보정하기 위해 공진 스캐너와 오프라인 평균을 사용합니다. Z 스택의 이미지 평면당 최대 사용 가능한 속도(30프레임/s)로 여러 이미지(4~6회 반복)를 획득합니다. 각 z 평면에 대한 모든 반복은 (상용 소프트웨어, AutoQuant를 사용하여), 등록 (ImageJ를 사용하여) 및 단일 이미지(26)로평균화된다. 소마타의 화상 진찰을 위해, 운동은 마취35에 수시로 무시할 수 있고 2개의 평균은 수시로 운동 아티팩트를 보상하기 위하여 충분합니다.
메서드의 향후 응용 프로그램 또는 방향 . 
준비는 마이크로 내시경26,43과결합 될 수있다. 마이크로 내시경은 경부 조직(18)에서빛을 안내하기 위해 그라데이션 굴절률 (GRIN) 마이크로 렌즈를 사용하는 단단한 광학 프로브입니다. 마이크로 내시경을 사용하면 더 작은 직경의 캐뉼라를 허용하거나 캐뉼라가 전혀 없습니다. 그러나 상업용 미세 내시경은 광학 수차에 대해 덜 잘 보정되며 상업적 목표보다 NA가 낮습니다. 현재 프로브는각각 17,18,44의측면 및 축 해상도에 도달합니다 .0.6-1 μm, □10-12 μm. 마이크로 내시경의 사용은 또한 헤드 마운트 통합 광시야 현미경45,46,47와이 준비의 조합을 가능하게 합니다.
이 방법은 또한 비마취 마우스에서 사용하기도 하며, 깨어있는 머리 고정 마우스21,37,48,49에서Ca2+ 센서를 사용하여 세포 활성을 조사하는 데 사용되어 왔다. 이러한 경우, 형광 변화의 빠른 시간 척도로 인해, 라인 등록(50)을구현하는 것이 바람직하다. 또한 치과 자이러스(DG)39,51,52와같은 다른 해마 하위 영역의 이미징을 위한 준비를 적응시킬 수도 있다. 이 제제를 3P 여기53,54와 1400 nm로 튜닝된 1 MHz 주파수 펄스 레이저와 결합하여 분자층, 과립 세포 층 및 해마 형성에 더 깊이 영상을 할 수 있었습니다. 오버레이 CA1을제거하지 않고 DG (그림 4)의 힐루스.
결론적으로, 우리는 등등 해마에 광학적인 접근을 제공하고 해마 구조 및 활동의 역학의 경도 및 상관 관계 연구를 허용하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 생리적 및 병리학적 조건하에서 해마 기능 분석의 가능성을 확장합니다.

포유류에서, 해마는 에피소드 기억의 인코딩 및 회상뿐만 아니라 공간 탐색 1,2,3,4의주요 뇌 영역이다. 이러한 이유로, 해마는 - 그리고 아직도 - 뇌가 기억을 인코딩하고 기억 할 수있는 기본메커니즘을 연구하는 매우 중요한 모델 5,6,7 또는 환경8 ,9 보상을 수집하고 위험을 피하기. 또한, 해마 형성은 설치류10,11 및 아마도 인간12,13의수명 동안 새로운 뉴런이 생성되는 뇌 영역 중 하나입니다. 마지막으로, 해마 형성의 변성 또는 손상은 알츠하이머병(14)을 포함하는신경및 정신장애와 연관된다.
마우스에서, 해마는 뇌 표면15의 밑에 대략 1 mm 위치. 그것의 위치는 손상되지 않은 두뇌에 있는 광학 접근을 방지하고 그 결과로, 해마 역학의 경도 연구 결과는 자기 공명 (MR) 화상 진찰, 전기 생리학 및 ex vivo 화상 진찰 분석에 주로 의존했습니다. MR 화상 진찰 방법은 생물학적 과정의 추적을 허용합니다 (예를 들어, 유전자 발현 변경16)여러 날에 걸쳐 동일한 동물에서, 그러나 단일 뉴런을 구별하는 공간 적 해상도가 부족하다. 고전 생체 내 전기 생리학 기술은 멤브레인 전위 변화에 매우 높은 시간적 해상도와 절묘한 감도를 제공합니다. 그러나, 그(것)들은 한정된 공간 해결책을 가지고 있고 더 긴 기간 동안 확실하게 동일 세포를 추적하는 기능이 부족합니다. 광학 이미징은 높은 시간적 및 공간적 해상도덕분에 보다 다양한 공정을 연구할 수 있게 해줍니다. 그러나, 생체 내 화상 진찰은 진행중인 프로세스의 스냅샷을 제공하고, 따라서 동물이 정보를 배우고 기억하는 동안 경도 연구 결과를 위해 적합하지 않습니다.
생체 내 광학 이미징은 MR 이미징 및 전기 생리학의 몇 가지 장점을 광학 이미징의 장점과 결합합니다. 따라서 마우스 뇌 역학 및 행동의 세로 및 상관 관계 분석에 매우 적합합니다. 이것은 매우 빠른 (밀리 초에서 초) 또는 매우 느린 (일 에서 몇 주) 시간 규모와 생물 학적 과정의 연구에서 관련이 있다. 신경 과학과 관련된 이러한 프로세스의 예로는 멤브레인 전압 역학, Ca2+ 과도, 세포 가소성 및 구조적 변화가 있으며, 이는 모두 메모리 형성 및 회수에 매우 중요하다고 여겨질 수 있습니다. 상이한 방법은 등쪽 해마18,19,20,21,22로생체 내 이미징을 확장했다. 급성 제제는 피라미드 뉴런(PN) 활성뿐만 아니라 수시간 동안 그들의 수상돌기 및 수지상 척추의 추적을20,22시간동안 허용하였다. 그러나 이 시간적 기간은 점진적 학습의 근간이 될 수 있는 장기적인 구조적 변화를 연구하는 것을 허용하지 않습니다. 만성 제제 - 마이크로 내시경23,24 또는 긴 작동 거리 (WD) 표준 현미경 목표(21)와 함께 - 여러 번 등쪽 해마의 반복 적 이미징을 가능하게했습니다. 주.
여기서, 우리는 영구적으로 삽입된 이미징 캐뉼라를 사용하여 살아있는 마우스의 등쪽 해마의 CA1 하위 필드에 재발하는 광학 접근을 제공하는 만성 제제를 기술한다. 이 제제는 기능적 장애 없이 CA1에 반복적으로 접근할 수 있으며, 인트라바이탈 2광자(2P) 또는 광전성 영상에 적합합니다. 살아있는 마우스의 등쪽 CA1에 있는 2P 깊은 두뇌 만성 화상 진찰의 2개의 보기는 상세한: 수지상 구조물의 종방향 화상 진찰 및 수지상 등등 역학 및 활동 불러일으킨 가소성의 경도 화상 진찰. 기술의 현저한 장점과 한계에 대해 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>전문 드릴/그라인더 IBS/E</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28481</td><td>Pecision drill</td></tr><tr><td>MICROMOT 드릴 스탠드 MB 200</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28600</td><td>이동식 눈금자 테이블</td></tr><tr><td>MICRO 복합 테이블 KT 70</td><td>Proxxon GmbH</td><td>27100</td><td>이동식 눈금자 테이블</td></tr><tr><td>기계 바이스 MS 4</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28132</td><td>이동식 눈금자 테이블</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 튜브 &오슬래시; 3,0 x 0,25 mm (내부 &Oslash; 2,5 mm ) L = 500 mm</td><td>Sawade</td><td>R00303</td><td>캐뉼라 금속 링용 스테인리스 스틸 튜브</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리(4mm 원형)</td><td>Engelbrecht Medizin 및 Labortechnik</td><td></td><td>캐뉼라 유리용 커버 슬립</td></tr><tr><td>Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui</td><td>Hoffmann Group</td><td>713750 160</td><td>매뉴얼 파일</td></tr><tr><td>Pr&auml; zisions-Nadelfeile Gesamtl&auml; 140 mm 4</td><td>Hoffmann Group</td><td>527230 4</td><td>수동 파일</td></tr><tr><td>UV 경화 광학 접착제</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>UV 경화 접착제</td></tr><tr><td>UV 경화 LED 시스템, 365 nm</td><td>Thorlabs</td><td>CS2010</td><td>UV 경화 LED 드라이버 유닛</td></tr><tr><td>Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stereoscope</td></tr><tr><td>Presto II</td><td>NSK-Nakanishi 독일</td><td>Z307015</td><td>치과 드릴</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein</td><td>MF Dental</td><td>F837.014.FG</td><td>치과 드릴</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob</td><td>MF Dental</td><td>G837.014.FG</td><td>치과 드릴</td></tr><tr><td>Graefe 집게 - 스트레이트 / 톱니 모양의</td><td>미세 과학 도구</td><td>11050-10</td><td>수술 용 집게</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>용 버 19008-05</td><td>마이크로 드릴용 0.5mm 너비 버</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-09</td>용 버 마이크로 드릴 MicroMotor mit Handst&uuml<td>용 0.9mm 너비 버</td></tr><tr><td>; ck</td><td>DentaTec</td><td>MM11</td><td>개두술용 마이크로 드릴</td></tr><tr><td>Dumont #3 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>수술용 Dumont 집게</td></tr><tr><td>Fine Scissors - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>수술용 가위</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>MW Dental</td><td>229-020</td><td>Trephine 드릴 - 직경 3.0mm; 마이크로 드릴용</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 셀프 태핑 뼈 나사</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>0.86 mm 너비 뼈 나사</td></tr><tr><td>입체 운동 장치</td><td>Kopf</td><td></td><td>입체 운동 장치</td></tr><tr><td>3-D-Gelenkarm</td><td>Hoffmann Group</td><td>442114</td><td>입체 운동 암 및 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>Aufnahme 2SM</td><td>Hoffmann Group</td><td>442100 2SM</td><td>입체 암 및 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>유리 구슬 살균기</td></tr><tr><td>Isofluran CP, Flasche 250 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798932</td><td>마취용 액체 이소플루란</td></tr><tr><td>Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer</td><td>Harvard Apparatus GmbH</td><td>34-1040</td><td>Isoflurane 기화기</td></tr><tr><td>Lab Active Scavenger</td><td>Gropper Medizintechnik</td><td>UV17014</td><td>Isoflurane 스캐빈저 시스템</td></tr><tr><td>메타캠 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798566</td><td>Meloxicam, 항염증제</td></tr><tr><td>Vetalgin 500 mg / ml</td><td>MSD Tiergesundheit</td><td></td><td>Vetalgin, 진통제</td></tr><tr><td>CMA 450 온도 조절기</td><td>Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH</td><td>8003770</td><td>난방 담요</td></tr><tr><td>Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>안과 연고</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td></td><td>광섬유 광원</td></tr><tr><td>Xylocain Pumpspray</td><td>AstraZeneca GmbH</td><td></td><td>Lidocain, 국소 마취</td></tr><tr><td>흡수 삼각형 - 장착되지 않은</td><td>미세 과학 도구</td><td>18105-03</td><td>수술 용 흡수 삼각형</td></tr><tr><td>Parkell C & ; B 메타본드 투명 파우더 L</td><td>Hofmeester 치과</td><td>013622</td><td>퀵 접착제</td></tr><tr><td>시멘트 Parkell C& B 메타본드 퀵 베이스 B</td><td>Hofmeester 치과</td><td>013621</td><td>퀵 접착제</td></tr><tr><td>시멘트 Parkell C& B Metabond 범용 촉매 C</td><td>Hofmeester 치과</td><td>013620</td><td>빠른 접착 시멘트</td></tr><tr><td>조정 가능한 정밀 애플리케이터 브러쉬</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td>수술 용 정밀 애플리케이터</td></tr><tr><td>무딘 바늘 0.9x23 mm</td><td>덴 티나</td><td>0441324</td><td>무딘 바늘</td></tr><tr><td>무딘 바늘 0.5x42 mm</td><td>덴 티나</td><td>0452155</td><td>무딘 바늘</td></tr><tr><td>무딘 바늘 0.3x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0553532</td><td>무딘 바늘</td></tr><tr><td>Kallocryl A / C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>아크릴 액체 구성 요소</td></tr><tr><td>Kallocryl</td><td>Speiko</td><td>1609</td><td>아크릴 분말</td></tr><tr><td>하이드로 필름 투명 롤</td><td>Hartmann</td><td></td><td>접착 필름</td></tr><tr><td>헤드 플레이트</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>30mm x 10mm 크기; 직경 8mm 구멍, 티타늄</td></tr><tr><td>헤드 플레이트 클램프</td><td>사용자 정의 메이드</td><td></td><td>헤드 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>받침대 포스트 홀더</td><td>Thorlabs</td><td>PH20E/M</td><td>헤드 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 포스트</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td><td>헤드 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 포스트</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M</td><td>헤드 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 포스트</td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M</td><td>헤드 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>포스트 커넥터 클램프</td><td></td><td></td> 맞춤형 <td>헤드 플레이트 홀더</td></tr><tr><td>알루미늄 브레드보드, 300mm x 450mm x 12.7mm, M6 탭</td><td>Thorlabs</td><td>MB3045/M</td><td>현미경 스테이지</td></tr><tr><td>7" x 4" Lab Jack</td><td>Thorlabs</td><td>L490/M</td><td>현미경 스테이지</td></tr><tr><td>로우 프로파일 안면 마스크 소형 마우스</td><td>Emka Technologies</td><td>VetFlo-0801</td><td>마취 안면 마스크 홀더</td></tr><tr><td>RS4000 튜닝 댐핑 최고 성능 광학 테이블</td><td>Newport</td><td></td><td>플로팅 테이블</td></tr><tr><td>S-2000A 최고 성능 공압 진동 아이솔레이터, 자동 리레벨링 기능</td><td>Newport</td><td></td><td>플로팅 테이블</td></tr><tr><td>파워 미터 모델 1918-R</td><td>Newport</td><td></td><td>파워 미터</td></tr><tr><td>X-Cite 120Q</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td> 형<td>광 램프</td></tr><tr><td>2광자 현미경</td><td>Bruker</td><td>Ultima IV</td><td>2광자 현미경</td></tr><tr><td>이광자 현미경</td><td>Thorlabs</td><td>Bergamo</td><td>이광자 현미경</td></tr><tr><td>Plan N 4x/0.10 &infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectives</td></tr><tr><td>Plan N 10x/0.25 &infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectives</td></tr><tr><td>LMPlan FLN 20x/0.40 &infin;/-/FN26.5</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectives</td></tr><tr><td>XLPlan N 25x/1.00 SVMP &infin;/ 0-0.23/FN18</td><td>올림푸스</td><td></td><td>대물렌즈</td></tr><tr><td>2P 여기용 Ultafast 조정 가능 레이저</td><td>분광 물리학</td><td>Mai Tai Deep See</td><td>Excitaiton 레이저</td></tr><tr><td>2P 여기용 Ultafast 조정 가능 레이저</td><td>분광 물리학</td><td>InSight DS+ 듀얼 빔</td><td>Excitaiton 레이저</td></tr><tr><td>3P 여기를 위한 Ultafast 조정 가능 레이저</td><td>Coherent</td><td>Monaco</td><td>Excitaiton 레이저</td></tr></tbody></table>

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 ca1의 세로 2 광자 화상 진찰

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

2 광자 현미경 검사법은 세포 이하에서 네트워크 수준에 구역 수색하고 밀리 초에서 주에 시간 규모에 구역 수색하는 공간 규모에 살아있는 동물의 두뇌의 조사를 허용하기 때문에 신경 과학을 위한 기본적인 공구입니다. 추가로, 2 광자 화상 진찰은 두뇌 기능 과 행동 사이 인과 관계를 탐구하기 위하여 행동 작업의 다양한 결합될 수 있습니다. 그러나, 포유류에서, 빛의 제한된 침투 및 산란은 표면적인 두뇌 지구에 주로 2 광자 내 생명 화상 진찰을 제한했습니다, 따라서 해마와 같은 깊은 두뇌 지역의 경도 조사를 배제하. 해 마 공간 탐색 및 에피소드 메모리에 관여 하 고 학습 및 기억에 대 한 중요 한 인지 프로세스 뿐만 아니라 세포를 공부 하는 데 사용 하는 오랜 모델, 건강 및 질병모두에서. 여기서, 살아있는 마우스에서 등쪽 해마에 대한 만성 광학 접근을 가능하게 하는 제제는 상세히 설명되어 있다. 이 제제는 몇 주에 걸쳐 두 개의 세포 및 세포 내 해상도에서 2 광자 광학 이미징과 결합될 수 있다. 이 기술은 등측 해마 CA1에 있는 신경 구조 또는 활동 가능하게 한 가소성의 수십에서 수백의 신경성의 반복한 화상 진찰을 가능하게 합니다. 또한, 이 만성 제제는 마이크로 내시경 검사, 헤드 마운트 와이드 필드 현미경 또는 3 광자 현미경 검사법과 같은 다른 기술과 함께 사용할 수 있으므로 관련 세포 및 네트워크 프로세스를 연구하기 위해 도구 상자를 크게 확장할 수 있습니다. 학습과 기억에서.

캐뉼라가 CA1에 다만 등받이에 배치되기 때문에, CA1의 등질 양상은 복부에 비해 현미경에 더 근접하다. 폐포는 지층 오리엔스(SO), 지층 피라미드(SP), 지층 라디에이터리움(SR) 및 지층 라쿠노섬 분자(SLM) 순으로 가장 근접한 구조이며, 가장 원위층(도 1B)이다. ,C)를 참조하십시오. 세포 내 해상도와 세포 해상도를 가진 활동 유발 가소성의 신경 구조의 세로 2P 화상 진찰은 대표적인 결과로 제출됩니다. 형광광 단백질(GFP), d2Venus 및 TurboFP635를 자극하기 위해 920 nm로 튜닝된 펨토초 펄스 Ti:사파이어 레이저가 사용되고 샘플에서 평균 레이저 전력이 5-25mW로 조정됩니다. 다른 방출 파장방출 필터와 다른 광증선튜브를 사용하여 분리된다.
수지상 구조및 수지상 척추 역학의 종방향 이미징.
희소하게 해마 PN을 표지하고 그들의 구조를 구상하기 위하여는, Thy1-GFP 형질전환 마우스 선 (M 선)이 이용됩니다. Thy1-GFP 마우스는 PN25의희소한, 임의 집단에서 Thy1 프로모터의 통제 하에 세포질 강화 GFP를 발현한다. 일반적으로 CA1 PN의 주요 축은 XY 이미징 평면에 대략 수직입니다(그림1B, 그림 2A 및 보조 동영상1). 기저 모수석은 SO에서 확장, 캐뉼라를 향해 소마에서, 반면 에피컬 및 정점 tuft 수상돌기는 캐뉼라에 distally 확장, 반대 방향으로 (보충영화1). 준비는 알베우스의 가장 깊은 섬유를 그대로 남기기 때문에 캐뉼라 바로 아래 시야를 통과하는 몇 가지 형광 섬유가 표시되어야합니다 (그림2A 및 영화1). 준비는 척추 해상도로 PN 수상돌기의 이미징을 허용합니다 (그림2 A-C). 이미지 수상돌기 및 수지상 척추에, 25X 1.0 NA, 4mm WD, 물 침지 상용 렌즈가 사용된다.
세로 추적을 위해, 캐뉼라의 시야 내의 몇몇 두뇌 지구는 첫번째 화상 진찰 세션 도중 정의됩니다. 각 영역은 약 240 x 240 μm의 영역에 해당하며 1과 7개의 수지상 세그먼트를 포함합니다 (그림 2B). 이들 영역은 이미징 캐뉼라 아래의 부피에서 GFP 발현패턴을 나타내는 저배율 3차원스택에 수동으로 매핑된다(도 2A). 이어서, CA1 PN 기저 모수석의 1 μm z-step 이미지 스택은 약 14일 동안 상이한 시간 간격(24 시간에서 3일)까지 획득된다(도2C). 더 긴 이미징 지속 시간 및 간격은26. 각 이미징 세션은 약 60~90분 동안 지속됩니다. 대부분의 이미지는 SO에서 수지상 척추이지만 SR의 경사 모수석에서 수지상 척추를 이미지화할 수도 있습니다(도2D-F). 척추 밀도 이외에,이 방법은 생존율, 이득 및 손실률26,27,28,29,30을정량화하여 척추 역학의 연구를 가능하게합니다. 31세 , 32. 시간이 지남에 따라 수지상 척추를 점수화하고 추적하기 위해 (그림2C),사용자 정의 MATLAB 인터페이스가 사용됩니다. 이를 통해 서로 다른 시점에서 획득한 이미지 스택의 정렬이 가능하며, 26시간 동안 수지상 길이와 척추 위치를 추적하면서 수상돌기와 척추의 수동 라벨링을 지원합니다. 중요한 것은, 이 방법은 기존의 수지상 척추와 신생아 수지상 척추 를 구별하기 위해 사용될 수있다 (각 시점당, 첫 번째 를 제외하고). 이것은 수지상 척추의 다른 클래스가 메모리 수집 및 보존33에서 서로다른 역할을 하는 것으로 생각되기 때문에 중요합니다.
활동 유발 가소성의 세로 이미징.
CA1 PN에서 활동 유발 가소성을 이미지화하기 위해, 등쪽 CA1 해마 영역은 아크 내의 시냅스 활성 반응 요소(E-SARE)의 향상된 형태를 통해 녹색 형광 불안정d2Venus를 발현하는 바이러스 벡터로 주입된다. ePGK 프로모터34를통해 인핸서/프로모터 및 적색 형광 터보FP635. 이것은 각 동물35에있는 CA1 PN의 수백의 활동 불러일으킨 가소성의 화상 진찰 수준을 허용합니다. PN의 매우 조밀한 레이블을 감안할 때 일반적으로 CA1 PN(보조영화2)의 모수석을 확인할 수 없습니다.
CA1 PN의 소마타를 이미지화하기 위해 40X 0.8 NA, 3mm WD, 침수 대물렌즈가 사용됩니다. 세로 추적의 경우, 첫 번째 이미징 세션 동안 마우스당 1~9개의 뇌 영역이 정의됩니다. 각 영역은 약 300 x 300 μm의 영역에 해당하며 50~150개의 셀을 포함합니다(그림3A). 이러한 영역은 낮은 배율에서 볼 수 있는 로컬 조직 랜드마크에 수동으로 매핑됩니다. 이어서, 3 μm z-step 이미지 스택이 획득되고, 이는 CA1 PN의 SP를 포괄한다(그림3A 및 보조 영화2)는 최대 약 30일 동안 상이한 시간 간격(24시간에서 6일까지)에 있다. 각 이미징 세션은 약 60 내지 90분 동안 지속됩니다. E-SARE 활성화피크는 신규또는 농축된 환경에 노출된 후 6 내지 8시간(EE, 도 3B)과며칠 동안 붕괴된다. 따라서, 우리는 일반적으로 경험 후 6 ~ 8 h를 이미지하고 이미징 세션35사이에 5 일 동안 허용합니다.
d2Venus 및 TurboFP635 형광 값을 정량화하기 위해, 세포 소마를 중심으로 신경 세포 체보다 작은 직경의 순환 영역 4.64 μm이 그려집니다. 그런 다음 다음 시점으로 진행하고 동일한 셀의 소마를 동일한 방식으로 점수를 매기고 세로 데이터 집합의 모든 시간 지점 및 모든 가시 셀에 대해 이 절차를 반복합니다. 각 뉴런(활성 의존적) d2Venus 방출의 평균 값은 평균(활성 독립적) TurboFP635 방출에 의해 정규화된다. 이 방법을 통해 CA1 PN35(도 3C)의 앙상블가소성의 장기 역학을 조사할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig1.jpg"> 그림 1: 생체 내 심부 뇌 광학 이미징을 위한 준비. (A). 위(왼쪽)와 측면(오른쪽) 보기 의 예 이미징 cannuals. 이미징 캐뉼러에는 해마에 광학적으로 접근할 수 있도록 투명한 유리 바닥이 있습니다. (B). 이미징 캐뉼라, CA1 PN 및 등지에서 복부까지섬유의 3층의 상대적 위치를 강조하는 제제에 대한 개략적 설명. (C,D). 이미징 세션 동안 이미징 설정(C) 및 동물 고정(D)에 대한 개략적 설명. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig2.jpg"> 그림 2: 수지상 구조및 수지상 척추 역학의 종방향 이미징. (A). 2P 이미지 스택 (최대 강도 프로젝션 (MIP) 59 이미지 평면, 2 μm z 간격) 뉴런과 수상 돌기라이브 Thy1-GFP 마우스에 의해 표시. (B). SO에 위치한 기저 모수석을 자세히 설명하는 더 높은 배율(53개의 이미지 평면 MIP, 1 μm z 간격). (C). 14일 이상 이미지화된 수지상 세그먼트의 타임랩스 이미지 시퀀스. 화살촉은 14일 동안 추적된 수지상 척추를 나타냅니다. (D,E). 살아있는 Thy1-GFP 마우스에서 GFP에 의해 표지된 뉴런 및 수상돌기의 2P 영상 스택; (D) ZY 프로젝션(31개의 이미지 평면, 3 μm z-간격) 및 (E) XY 프로젝션(17개의 이미지 평면, 3 μm z 간격). (F). SR. 화살촉에 위치한 상형 모수석과 수지상 척추를 자세히 설명하는 더 높은 배율(단일 이미지 평면)은 수지상 척추를 나타냅니다. 흥분: 920 nm; 방출 피크: 510 nm. 스케일 바: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D 및 E, 15 μm; F, 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig3.jpg"> 그림 3: 활동 유발 가소성의 종방향 이미징. (A). 라이브 마우스에서 2P 이미지 (단일 이미지 평면) 기준일 0 및 1 일째EE 후 동일한 셀을보여주는. (B). 2P 이미지 스택(4-6개의 이미지 평면, 3 μm z 간격)은 환경 A(1일, 19일 및 25일) 및 환경 B(일 7 및 13일)에 특정한 E-SARE 활성화 패턴을 나타낸다. 녹색: d2Venus 형광. 빨간색: 터보FP635 형광. 흥분: 920 nm; d2Venus 방출 피크: 530 nm; 터보FP635 배출 피크: 635nm. 스케일 바: A, 20 μm; B, 10 μm. 이 수치는 Attardo 외, 201835에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig4.jpg"> 그림 4: 3 광자 (3P) 현미경 검사법을 사용하여 해마 DG에서 신경 구조의 이미징. (A-H)를입력합니다. GFP에 의해 표지된 뉴런 및 수상돌기의 3P 이미지(single image planes)는 DG내의 CA1 및 (F-H) 과립 세포에서 의 한-E(P-E) PN을 상세히 하는 라이브 Thy1-GFP 마우스에서. 흥분: 1400 nm; 방출 피크: 510 nm. 배율 표시줄: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 동영상 1: 라이브 Thy1-GFP 마우스에서 이미징 시야. 2P 이미지 스택(83개의 이미지 평면, 7 μm z-간격)의 뉴런 및 Dendrites의 GFP(흰색)에 의해 표지된 산Thy1-GFP 마우스에서 캐뉼라의 바닥에서 SLM까지 연장된다. 깊이가 증가하는 형광 신호의 붕괴를 설명하기 위해 광증선 튜브의 이득의 비선형 그라데이션을 사용했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_1_FINAL.avi">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 영화 2: 활동 유발 가소성의 이미징. SP. 그린: d2Venus 형광을 포괄하는 라이브 마우스에서 IEG 발현의 E-SARE 리포터를 발현하는 뉴런의 2P 영상 스택(28개의 영상 평면, 3 μm z-간격). 빨간색: 터보FP635 형광. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_2_FINAL.avi">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

이 절차는 살아있는 마우스의 등쪽 해마에 반복적으로 광학 액세스를 제공하여 학습 작업을 수행하는 동안 메모리 형성 및 리콜 메커니즘을 연구합니다. 이 기술은 몇 주 동안 세로로 마이크로 미터 수준의 공간 해상도에서 살아있는 마우스의 등쪽 해마를 연구하는 가벼운 현미경 검사법을 사용할 수 있습니다. 기억 상실은 알츠하이머 병과 같은 일부 뇌 질환의 일반적인 특징입니다.메모리 형성 및 리콜의 메커니즘을 이해 궁극적으로 이러한 질병으로 고통 받는 환자 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 작은 포유류와 같은 두개골을 가진 그밖 동물 시스템에 적용될 수 있었습니다. 생존 수술 중 활력 징후를 모니터링하는 것은 산만하고 스트레스가 될 수 있습니다.절차의 더 중요한 측면에 집중하기 위해 죽은 동물에 대한 절차를 먼저 수행하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이미징 캐뉼라를 준비하려면 먼저 3mm 직경의 스테인레스 스틸 튜브를 1.6mm 길이의 금속 고리로 자릅니다. 절단 후 링의 가장자리가 무디지 않으면 부정을 제기하십시오.다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 금속 링의 한쪽을 UV 경화 광학 접착제에 담급넣습니다. 그런 다음 금속 링을 유리 커버슬립 의 중앙에 놓고 링의 측면은 덮개 슬립을 만지는 접착제로 덮여 있습니다. UV 경화 LED 드라이버 유닛을 켜고 365 나노미터 파장 광을 접착제에 1분 동안 비추어 접착제를 치료합니다.광원의 방향을 변경하여 링의 모든 면이 똑같이 조명되는지 확인합니다. 접착제가 적어도 2 시간 동안 굳어진 후, 금속 고리의 열린 끝에서 기혈을 단단히 유지합니다. 회전 파일이 장착 된 치과 드릴을 사용하여 링의 측면으로 플러시 될 때까지 과도한 유리 덮개 슬립을 제거하십시오.필요한 계측기를 준비하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 머리카락을 제거하고 마우스 머리 위로 피부를 소독합니다. 다음으로 가위와 집게를 사용하여 람다 근처의 위치에서 두피에 작은 절단을 합니다.귀 방향으로 측면으로 이동한 다음 눈 궤도 방향으로 로스트로 하여 약 4mm 의 연막에서 모랄까지 적목축의 삼각형을 형성한다. 두개골에 리도카인 한 방울을 발라주세요. 2 분 후, 음막의 지우기와 면 봉면을 사용하여 두개골을 건조.그런 다음 이어 바를 배치하여 마우스의 머리를 고정합니다. 폭 0.5mm버가 있는 마이크로 드릴을 사용하여, 심상 봉합사에서 약 1.5밀리미터, 관상 봉합사에서 2밀리미터 의 상반되는 상반신 맞은편에 있는 정면 뼈에 작은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 두개골 구멍에 0.86 밀리미터 폭 스테인레스 스틸 뼈 나사를 나사.접착제 시멘트를 사용하여 제자리에 고정하십시오. 시멘트를 30초에서 1분 동안 건조시키십시오. 다음으로, 3밀리미터 직경의 트레핀 드릴을 사용하여 정수리 뼈에 작은 구멍을 만듭니다.구멍은 처릿 봉합사에서 약 1.5 밀리미터 의 탈구와 람도이드 봉합사에서 2 밀리미터 의 할수를 배치합니다. 조심스럽게 뼈 플랩을 제거합니다. 그런 다음 Dumont 집게를 사용하여 수막을 제거합니다.피질 물질을 압다하여 외부 캡슐에 도달합니다. 진공 펌프에 연결된 19 게이지 무딘 바늘을 사용하고 식염수로 관개하여 노출된 조직의 탈수를 피하고 출혈이 해결된 후 잔류 혈액을 씻어내도록 하십시오. 피질 조직을 천천히 약 50~100미크론으로 빨아서 캡슐에서 피질이 분리되어 칭굴럼 또는 코퍼스 캘로섬의 섬유를 노출시킨다.그런 다음 가장 깊은 섬유가 노출 될 때까지 등광섬유를 조심스럽게 껍질을 벗깁니다. 완료되면, 식염수로 조직을 헹지. 다음으로 얇은 집게를 사용하여 바닥 캐뉼라를 식염수로 찍어 두개골 구멍 위에 놓습니다.그런 다음 유리 덮개 슬립이 섬유와 접촉 할 때까지 캐뉼라를 두개골에 밀어 넣습니다. 두개골을 말리고 두개골 위에 빠른 접착제 시멘트를 적용하여 캐뉼라를 제자리에 고정시하십시오. 또한 캐뉼라의 가장자리에 접착제를 적용하지만 접착제가 캐뉼라에 실행되지 않도록주의해야합니다.일단 건조하면 스테레오탁스 암을 사용하여 두개골과 접촉하여 캐뉼라 위에 머리 홀더 플레이트를 놓습니다. 치과 아크릴의 혼합물을 준비한 다음 전체 두개골에 적용합니다. 노출된 두개골 전체, 나사 및 열린 피부를 치과 아크릴로 덮어 준비를 안정화시하십시오.15분 후, 이동식 접착제 필름을 헤드 홀더 플레이트에 발라 이물질이 캐뉼라로 유입되는 것을 방지합니다. 뇌를 이미지할 준비가 되면 마취에 대한 세부 사항을 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 다시 따르십시오. 충분히 진정되면 집게를 사용하여 헤드 홀더 플레이트에서 접착제 필름을 조심스럽게 제거하십시오.준비에 손상을 입히지 않도록 필름을 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 가열 카펫 위에 현미경 아래에 마우스를 배치하고 홀더에 헤드 플레이트를 고정합니다. 동물의 눈에 눈 연고를 바하십시오.그런 다음 주사기와 얇은 바늘을 사용하여 탈이온 된 물을 캐뉼라에 떨어 뜨리고 진공 펌프로 제거하여 이미징 캐뉼라를 청소하십시오. 낮은 배율 장거리 목표를 사용하여 잔류 물, 먼지, 무결성 및 형광의 존재를 위해 캐뉼라를 시각적으로 확인하십시오. 그런 다음 머리 홀더 암의 각도를 조정하여 캐뉼라를 광학 축에 정렬합니다.1.0 숫자 조리개와 4mm 작동 거리로 25X 목표로 전환합니다. 그런 다음 캐뉼라에 충분한 탈온화된 물을 추가하여 채우고 캐뉼라 위에 여분의 물을 유지합니다. 마지막으로, 두 개의 광자 여기를 사용하고 형광 신호를 이미지합니다.여기에 표시된 i1-GFP 형질전환 마우스 뇌에서 2P 이미지 스택. Thy1-GFP 마우스는 피라미드 뉴런의 드문 무작위 집단에서 Thy1 프로모터의 통제 하에 세포질 향상 GFP를 발현한다. 일반적으로, 등쪽 해마 CA1에서 피라미드 뉴런의 주요 축은 XY 이미징 평면에 대략 수직이다.이들 영역은 이미징 캐뉼라 아래부에서 GFP 발현의 패턴을 보여주는 낮은 배율 3차원 스택에 수동으로 매핑된다. 세로 추적을 위해, 캐뉼라의 시야 내의 몇몇 두뇌 지구가 정의됩니다. 각 영역은 약 240 x 240 마이크로미터의 영역에 해당하며 1~7개의 수지상 세그먼트를 포함합니다.여기에 이미지 된 시리즈는 14 일 동안 다른 시간 간격으로 획득 CA1 피라미드 뉴런과 기저 드런라이트의 하나의 마이크로 미터 z 단계 이미지 스택을 보여줍니다. 그러나, 더 긴 이미징 기간 및 간격가능. 대부분의 이미지는 지층 오리엔스의 수지상 척추이지만, 층 복사의 경사 원점에 수지상 척추를 이미지화할 수도 있습니다.이 기술의 또 다른 확장은 바이러스 벡터를 가진 등쪽 CA1 해마 부위를 주입하여 CA1 피라미드 뉴런에서 활동 유발 가소성을 이미지하는 것입니다. 이를 통해 각 동물에서 수백 개의 CA1 피라미드 형 뉴런이 2P 이미지 스택으로 도시된 것으로 측정할 수 있습니다. 지나치게 조직을 제거할 때 해마의 손상을 방지하는 것이 중요합니다.또한 안정적인 준비를 위해 캐뉼라를 올바르게 배치해야 합니다. 설명된 준비는 동물의 머리에 이식될 수 있는 소형 현미경과 같은 광학 화상 진찰의 다른 종류의 사용을 허용합니다. 이것은 연구원이 자유롭게 움직이는 동물에 있는 신경 활동을 따를 수 있습니다.원래, 기술은 해마 뉴런에서 구조적 가소성을 연구하는 데 사용되었다. 오늘, 그것은 또한 다른 뇌 영역에서 신경 활동을 공부에 구현.

longitudinal-two-photon-imaging-of-dorsal-hippocampal-ca1-in-live-mice

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

출처: Ulivi, A. F., et. al. 살아있는 마우스에서 등쪽 해마 CA1의 종방향 이광자 이미징. J. Vis. 특급. (2019) 이 비디오는 살아있는 쥐에서 형광 표지된 피라미드 뉴런의 종방향 이광자 이미징을 보여주며, 해마 CA1 영역의 뉴런 구조를 연구하기 위한 수상돌기 및 수지상 가시의 준비, 캐뉼라 정렬 및 이미징을 보여줍니다.

살아있는 쥐 해마에서 형광 표지된 뉴런의 종방향 이광자 이미징 

출처: Kamei, R., et. al., 마우스 해마에서 미세아교세포의 생체 내 만성 이광자 이미징. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 해마 CA1(Cornu ammonis 1) 및 치상회에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 현미경을 위한 설정 및 이미징 프로세스를 보여 최적의 광학 정렬 및 구조적 무결성 평가를 보장합니다.

마우스 해마에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 이미징

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

배우세요 살아있는 마우스의 등도 해마 CA1에서 세로 2광자 화상 촬영을 통해 기억 형성과 회상 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 수 주에 걸쳐 신경 구조 가소성과 활동 유발 세포 가소성을 미세미터 수준 해상도로 관찰할 수 있게 합니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

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