Name: 애기 장 대의 바닥 싱크대 조직에 로드 Cfda 추적자의 총격전 운동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 Arabidopsis 뿌리와 하배축에 CFDA 형광 추적자를 로딩하여 세포 간 수송을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 형광 현미경을 통해 플로엠 활성을 시각화하고 심플라스틱 장벽을 식별하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 중국의 국립 자연과학 재단 (31671257)과 곡물 산업 (LXT-16-18)에 대 한 후베이 공동 혁신 센터에 의해 자금을 지원 했다.

1. 애기 장 대 MS 배지에서 수직 성장
<ol><li>층 류 캐비닛의 내부는 사용 전에 30 분의 자외선과 15 분의 공기 흐름으로 처리 해야 합니다. UV 표시등이 켜져 있을 때 유리 도어를 닫아야 합니다. 모든 공구와 플레이트를 캐비닛에 배치 하기 전에 70% 에탄올로 분무 하십시오.</li>
	<li>층 류 캐비닛 아래 표준 90 mm 직경의 페 트리 디쉬에서 무라 시 게와 스 쿤 크 (MS) 배지를 준비 한다. 참고: MS 미디어에는 다음과 같은 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 20.6 mM NH4아니오3, 18.8 mm kno3, 1.25 mm 2 PO4,1.5 mm 2· 2 시간2분, 0.1· H2o, 1.03 µ m 나2무4·2시간 3 분 0.1 mM, 30 µm 즈 소 4 · 7 월3일(일), 0.1 µ m.5시간 2 분, 0.1µ, 1.39, 97 µ FeSO4 · 114.5 µm ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 4.07 µ m 니코틴산, 2.44 µ m 피리 독신 hcl, 0.15 µ m 티 아민 Hcl 2.68 mm 글리신, 555 µ m 묘-이노 시 톨, 87.7 mm 자당 및 10G/L 한 천.</li>
	<li>팁 또는 이쑤시개를 MS 배지에 터치 하 여 멸 균 된 팁 또는 이쑤시개를 보습 한 다음, 시드 카드에 의해 표시 된 각 페 트리 디쉬의 고정 된 위치에 하나씩 멸 균 된 종자를 찍어 냅니다.</li>
	<li>파라핀 필름과 점착 테이프를 사용 하 여 페 트리 디쉬를 밀폐 하 여 생 육 실 (22 ° c, 70%)의 맑은 스탠드에 수직으로 배치 하 고 16 시간 동안의 빛과 어둠의 8 시간 (조명으로 오전 6 시 ~ 오후 10 분)의 하루 주기로 놓습니다. 애기 장 대 식물은 파 종 후 9-13 일에 cfda 적재를 위한 준비가 되어 있습니다. 참고: 다음 절차는 오후 2 시 ~ 오후 5에서 오후에 수행 됩니다.</li>
</ol>2. CFDA 루트 절단 절차 로드
<ol><li>사용 직전에 신선한 CFDA 작업 솔루션을 준비 하십시오. 5 µ M의 작업 농도로-20°c 냉동 고에 저장 된 1mm CFDA 원 액을 멸 균 초순 수로 희석 하십시오.</li>
	<li>미세 다공성 파라핀 막 필름 ( 재료 표참조)을 3mm x 3mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>22 ° c에서 방에서 성장 하는 식물을 발견 하 고 종이 타월과 여분의 습기를 취소 합니다. 각 루트 아래에 작은 필름 조각을 놓습니다. 참고: 이것에서 2.6 단계까지 전체 프로세스는 15 분 이내에 완료 되어야 합니다.</li>
	<li>식물을 배양 접시 뚜껑에 올립니다. 루트-hypocotyl 접합부 아래 약 5-10 mm의 위치에 뿌리를 자릅니다. 촬영 부분을 매체의 필름에 다시 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 게 해 부 현미경의 각 루트의 절단 끝에 CFDA의 0.25 µ L을 적용 합니다. 식물의 다른 부분에 튀는 것을 피하십시오.</li>
	<li>플레이트를 덮고 성장 실에서 2-3 h (22°c)를 위해 식물을 빛 아래에 두십시오.</li>
	<li>3 회 염색 한 식물을 증류수로 채워진 세 개의 분리 된 비 커에서 순차적으로 헹 구 고, 그 다음 식물을 1.4 x에서 3.3 x로 확대 한 입체 형광 현미경으로 관찰 한다 ( 재료 표참조). 형광 검출을 위해, 고효율 필터 큐브 (470/20 nm 여기, 495 nm 분할 및 525/50 nm 방출)를 사용 하 여 형광 신호를 전송 합니다.</li>
</ol>3. hypocotyl 핀치 절차를 사용 하 여 CFDA 로드
<ol><li>사용 직전에 신선한 CFDA 작업 솔루션을 준비 하십시오. 5 µ M의 작업 농도로-20°c 냉동 고에 저장 된 1mm의 CFDA 원 액을 멸 균 초순 수 ( 재료 표참조)로 희석 하십시오.</li>
	<li>미세 다공성 파라핀 막 필름 ( 재료 표참조)을 3mm x 3mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>22 ° c에서 방에서 성장 하는 식물을 발견 하 고 종이 타월과 여분의 습기를 취소 합니다. 참고: 이것에서 3.7 단계까지 전체 프로세스는 15 분 이내에 완료 되어야 합니다.</li>
	<li>각 공장의 루트-저 축의 교차점 아래에 필름의 작은 조각을 놓는다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 해 부 현미경 아래에 있는 근-저 부 틸 접합부 근처의 피하 부를 부드럽게 핀치 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 해 부 현미경 아래 상처 사이트에 CFDA의 0.1 µ L을 적용 합니다. 식물의 다른 부분에 튀는 것을 피하십시오.</li>
	<li>플레이트를 덮고 2-3 h의 식물을 빛 (22°c)에서 남겨 둡니다.</li>
	<li>3 회 염색 한 식물을 증류수로 채워진 세 개의 분리 된 비 커에서 순차적으로 헹 구 고, 그 다음 식물을 1.4 x에서 3.3 x로 확대 한 입체 형광 현미경으로 관찰 한다 ( 재료 표참조). 형광 검출을 위해 고효율 필터 큐브 (470/20 nm 여기, 495 nm 분할 및 525/50 nm 방출)를 탑재 하 여 형광 신호를 전송 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
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<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
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<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
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<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
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<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

신생 연구는 식물이 실험 절차 (22)에 도입 된 조작을 포함 하는 외부 자극 (23)에 신속히 반응할 수 있다는 것을 보여주었다. 우리의 초기 실험에서,이 지식에 대 한 우리의 감독은 종종 염색 실패로 이어집니다. 이 단원에서는이 실험을 수행할 때 다음 예방 조치를 염두에 두어야 합니다. (1) 수확 후 씨앗은 저온과 낮은 수 분으로 설정 된 저장 캐비닛에 보관 해야 합니다. (2) 식물의 조작, 특히 캐비닛의 공기에 대 한 노출은 최소한의 시간으로 유지 되어야 합니다. (3) 실험 조건은 일정 하 게 유지 되어야 하며, 예를 들어, 모든 절차는 성장 실에서 수행 되어야 한다.
지적 되어야 하는이 실험의 또 다른 측면은 CFDA의 로딩 볼륨이 가능한 한 작게 유지 되어야 한다는 것입니다. 과잉 솔루션은 종종 과잉 CFDA 용액이 모 세관 작용을 통해 촬영까지 확산 될 수 있는 유물로 이어지고,...

다양 한 스펙트럼 특성을 가진 많은 형광 추적자 (carboxyfluorescein)1, 8 hydroxypyrene, 3, 6 트리 설파 닉 산2, 루시퍼 옐로우 CH (lych)3,에 스 컬 린 및 cter4가 개발 되어 symplastic 운동 및 걸러 활동을 모니터링 하는 식물에 적용. 일반적으로, symplastic 염료는 표적 조직에서 절단으로 로딩 되 고, 리포터의 순차적 분산은 식물의 다른 부분으로 전달 되어 세포 간 통신을 보여줄 것 이다. 염료 흡수의 메커니즘은 완전히 이해 되지 않았지만, 살아있는 세포 내부의 CF 움직임을 기본으로 하는 원리는 널리 인정 받고 있습니다. CF (CF 디 아세테이트, CFDA)의 에스테 르 형태는 비 형광 이지만 막 투과성입니다. 이 속성은 세포에 염료의 급속 한 막 확산을 허용. 살아있는 세포 내부에서, 세포내 에스테 라 제는 CFDA의 3 ' 및 6 ' 위치에서 아세테이트 그룹을 제거 하 고, 형광 및 막 불 투과성 CF를 방출 한다 (도 1을 참조 하면 라이트 외2). CF는 plasmodesmata를 통해 식물의 다른 부분으로 이동할 수 있습니다.
CFDA와 잘 확립 된 절차는 소스 잎에 로드 하 고 많은 종의 싱크 조직에서 걸러 스트리밍 및 걸러 언로드를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것입니다, 예를 들어, 애기 장 뿌리에서 CF 언로드로5, 걸러 언로드 감자 결 절 화6동안, 니코 티아 나 세 면 대에서 걸러 하 역, 등등7잎. 유사한 하 중 접근법에 의해, 다른 연구는 숙주와 기생충 사이에 symplastic 연결을 보여주기 위해이 염료를 채택8,9, 또는 공생 관계를 공개 하는10,11.
이 염료의 사용을 확인 하는 또 다른 방법은 그것의 분포 패턴을 결정 하기 위해 마이크로 주입에 의해 특정 세포 또는 단일 세포로 그것을 로드 하는 것 이다. 이러한 정교한 기술은 특히 symplastic 도메인12의 개념의 개발에서, plasmodesmata 매개 된 세포 간 통신에 대 한 우리의 깊은 이해를 크게 촉진 했다. 예를 들어, 애기 장 대의 자 엽 세포에 cfda의 미세 주입은 표 피 층에 염료 결합 패턴을 초래 하였으나 기저 세포에서 또는 뿌리 표 피에 비 결합 하 여, 따라서 배 축의 표 피를 형성 symplastic 도메인14. 구를 가드 셀 (15)과 같은 유사 도메인, 체 성분-동반자 세포 (16), 뿌리 모 세포 (14 ) 및 루트 캡 (17 )은 미세 주입 기술에 의해 확인 되었다. 놀랍게도 일부 도메인은 추적 자가 특정 방향으로 움직일 수 있도록 합니다. 난다 도메인을 예로 들면, 지지 표 피 세포에 형광 프로브의 미세 주입은 트라이 홈 도메인에 트레이 서의 흐름에 이르게, 그러나, 역방향 주입은 진정한19을 보유 하지 않습니다. 최근의 보고서는 또한 Sedum 배아 (20)의 symplastic 도메인에서 유사한 상황을 발견 했다. 따라서 위의 모든 경우는 로딩 사이트의 스와핑이 symplastic 통신에 대 한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있음을 의미 합니다. 우리의 이전 실험 루트-투-촬영 모바일 침묵의 경로를 해 부 하는 것을 목표로 하는 새로운 symplastic 도메인, 또는 HEJ (저 산소 접합) 영역, 루트 로딩을 통해 더 확인 되었다 (비 정식 싱크 로드) CFDA 실험21. 여기, 우리는 또한 간단한 방법을 사용 하 여 루트-촬영 CF 움직임을 정교 하 고 로딩 사이트를 이동 하 여 잠재적 인 symplastic 도메인을 복구. 또한,이 절차는 루트-촬영 장거리 전송을 변경 한 유전 배경을 차별화 하기 위해 적응 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol&nbsp; &nbsp;</td><td>맥클린</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>니코틴산&nbsp;</td><td>맥클린</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>피리독신 HCl</td><td>맥클린</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>티아민 HCl</td><td>맥클린</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>맥클린</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>한천 분말</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&뮤; l 피펫</td><td>드래곤 실험실 기기</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu; l 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&nbsp;</td><td>핀셋</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>파라필름</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 양면 블레이드</td><td>질레트</td><td>플래티넘 플러스 양날</td><td></td></tr></tbody></table> 블레이드

애기 장 대의 바닥 싱크대 조직에 로드 cfda 추적자의 총격전 운동

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Symplastic 트레이 서 5 (6)-carboxyfluorescein 디 아세테이트 (CFDA)는 세포 간 연결, 걸러 수송 및 혈관 패터 닝을 보여주기 위해 살아있는 식물에 널리 적용 되 고 있다. 이 프로토콜은 뿌리 절단 및 피하-핀치 과정을 각각 사용 하 여 애기 장 대의 CARBOXYFLUORESCEIN (CF) 이동을 보여준다. 이 두 가지 절차는 CF 이동의 다양 한 효율성을 초래 합니다: 약 91%는 반면에 하 부 틸 핀치 절차를 가진 촬영에서 CF의 외관, 루트 절단 절차와 CF의 약 70% 외관. 로딩 사이트의 간단한 변화는이 symplastic 염료의 이동 효율에 상당한 변화를 초래 하 고, CF 운동은 대부분 뿌리 hypocotyl 접합부에 의해 symplastic 규제 될 수 있음을 시사 한다.

Symplastic 운동은 종종 환경 변동에 따라 달라질 수 있습니다. 식물 성장 상태의 섭 동, 및 심지어 조직 준비의 과정은 plasmodesmata의 크기 배제 한계에 영향을 미칠 것 이다, 따라서 symplastic 수송에 영향을 미치는22. 염색 효율을 개선 하기 위해, 우리는 온도와 습기가 단단히 제어 되는 성장 실에서 우리의 작업을 제한 하 고 또한 가능한 한 빨리 전체 절차를 수행 합니다 (이상적으로 10-15 분 이내에 페 트리 디쉬의 뚜껑을 들어 올려). 실험 중 이러한 예방 조치는 실패 한 촬영 얼룩의 비율을 효과적으로 줄일 수 있습니다.
우리는 CF 촬영와 드의 움직임을 보여주기 위해 두 가지 약간 다른 절차를 설명 했다. 일반적으로 두 절차는 먹이 후 약 2 시간 동안 촬영에서 CF 염색을 초래할 ...

이 프로토콜의 목표는 애기장 대의 아래 부분의 다른 사이트에 cfda를 로드 하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 그런 다음 촬영에 CF의 결과 분포 패턴을 제시 합니다.

애기 장 대의 바닥 싱크대 조직에 로드 Cfda 추적자의 총격전 운동

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

널리 사용되는 프로브 CFDA, 또는 카복시 플루오레세인 이아세이산에 대한 짧은, 비 형광이다. 이 화합물에 대한 두 개의 H3 그룹과 3'6'위치는 멤브레인 퍼미티드렌더링합니다. 일단 세포 안쪽에, 내부 세포 아세테이트는 아세테이트 단을 제거하고 CFDA의 새로운 양식을 풀어 놓을 것입니다.그것은 형광인 카복시 플루오레세인 또는 CF입니다. 그리고 이 새로운 형태는 막 에 대한 왜곡이 적기 때문에, 무게, 모든 세포는 세포 간 모공, 또는 식물의 플라스모데마타를 통해 이동하는 것입니다, 그 말막 활동에서 세포 간 수송을 연구하는 이상적인 프로브를 diacetate만드는. 오늘의 비디오에서, 우리는 각각 아라비도시스 식물의 뿌리와 hypocotyl에 CFD 로딩을 시연 할 것입니다, 우리는 두 개의 약간 다른 절차가이 형광 프로브의 상단 움직임에 바닥에 영향을 미치는 방법을 보여줍니다.지속적으로 염색 결과를 달성, 우리는 4 섭씨, 40 %의 수분 캐비닛에 수확 된 애기장염 씨앗을 저장합니다. 7 일 이상이 조건에 저장 된 새로 수확 된 씨앗은 파종에 쉽게 사용됩니다. 모든 식물이 페트리 접시의 비교적 유사한 공간에서 재배되도록 하기 위해 종자 구역 등급 카드를 사용하고 있습니다.이제 살균 된 팁을 적시고 멸균 된 씨앗에 담그고 지정된 위치에 하나씩 씨앗을 뿌리는다. 파종을 마친 후, 페트리 접시에 파라필름과 끈적끈적한 테이프를 밀봉하여 페트리 접시 스탠드에 올려 수직으로 자랄 수 있습니다. 이 실험에서 사용할 도구는 다음과 같습니다.가능한 한 빨리 염료를 더 잘 적재할 수 있습니다. 일반적으로 전체 프로세스를 10~15분 만에 완료합니다. CFDA 로딩 실험을 수행하기 전에 항상 새로운 CFDA 솔루션을 준비합니다.여기서, 즉시 사용하기 전에 물로 1 밀리머 CFDA를 5 개의 마이크로 몰라 농도로 희석하십시오. 파라필름을 3mm 크기로 작은 조각으로 자른다. 페트리 접시의 뚜껑과 바닥에 응축이 있기 때문에, 우리는 주위에 흐르는 염료를 피하기 위해 종이 타월로 그들을 취소해야합니다.작은 파라필름 조각이 뿌리 아래에 놓여 있습니다. 식물을 들어 올려 뚜껑에 놓습니다. 고체 코틸 아래 약 5 ~ 10 밀리미터 의 뿌리를 잘라.파라필름의 작은 조각에 다시 촬영을 가져 가라. 이제 조심스럽게 루트의 절단 끝에 하나의 마이크로 리터 CFDA를 적용합니다. 모든 프로토 식물을 오염하지 않도록보십시오.그런 다음 뚜껑을 덮고 2 시간 동안 성장실에 둡니다. 하이포코틸 꼬집기 방법. 이전에 준비된 작은 파라필름 조각은 뿌리-시코틸 접합하에 놓입니다.우리는 조심스럽게 루트 조직에 가까운 hypocotyl을 꼬집기 위해 forecep를 사용하고, 조심스럽게 꼬집어 측에 0.1 마이크로 리터 CFDA를 적용하고 2 시간 동안 식물을 둡니다. 영역 염색 식물 후 9 일에서 12 일에서 사진. 그들은 모두 코틸레던과 진정한 잎 모두에서 혈관 염색 패턴을 보여줍니다.매우 드문 경우에만, 코틸레톤 잎은 반 잎 염색 패턴을 보였다. 따라서 기본적으로 두 가지 방법은 CF 염색 패턴에 차이를 만들지 않았지만, 점점 더 많은 식물에 염료 로딩을 수행하면 두 절차가 효율성에 상당한 차이를 제공하는 것을 발견했습니다. 루트 컷 방법을 사용하면 식물의 약 70 %가 촬영시 형광 신호를 보여줍니다.그러나 하이코틸 꼬집기 방법을 사용하여 효율성을 91%로 증가시킬 수 있다. 우리는 또한 루트 꼬집기 방법을 시도했지만,이 방법은 더 낮은 효율을 초래, 그것은 약 30 %따라서, 염색을로드하는 방법은 염색차이를 고려하지 않는 것으로 보인다. 차이점은 대부분 대두근 장벽으로 구분 될 수있는 로딩 사이트에있을 수 있습니다.우리는 우리가 아랍염 뿌리와 hypocotyl에 CFDA를 로드하는 방법을 보여주었습니다. 우리는 두 개의 약간 다른 절차를 사용, 이 두 약간 다른 절차는 상단 프로브 움직임에이 하단에 상당한 차이를 초래. 이 방법은 뿌리 유래 촬영 신호에 대한 잠재적인 대두화 장벽을 식별하는 데 도움이 될 수 있다고 제안합니다.

shootward-movement-cfda-tracer-loaded-bottom-sink-tissues

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

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