Name: 스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 생체 외 스크래치 분석과 생체 내 등갈 피부 접기 챔버를 이용한 상처 치유 평가 방법입니다. 이 기술은 섬유아세포 이동과 약물 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 박사 페트라 바이스 거버와 SPF 동물 시설의 트랜스 유전자 단위 (SFB의 프로젝트 P2 894) 의료 학부의 및 자를 란트 대학의 의료 학부에서 임상 및 실험 수술 연구소의 동물 시설, 홈버그. 안드레아스 벡 박사님이 원고를 비판적으로 읽어 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG) 손더포스충스베라이히(SFB) 894, A3~A.B. 및 V.F.에 의해 지원되었다.

모든 실험 절차는 자를란트 와 자를란트 대학의 윤리 규정 및 동물 복지위원회에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1 1 1 차적인 세포 배양 및 siRNA 형질감염
참고 : 설명 된 방법에서 1 차 섬유 아세포가 사용됩니다. 이들 세포는 상처 치유 및 조직 리모델링11에중요한 역할을 한다. 본 실험에서, Cacnb3 유전자는, 고전압 게이트 칼슘채널(12)의 Cavβ3 소단위를 코딩하여 하향 조절되었고, 이에 따라 생체내 세포 이동 및 피부 상처 수리에 그 역할을 나타내고4.
<ol><li>siRNA의 준비: siRNAs를 재구성하기 전에, 내용이 바닥에 있는지 확인하기 위해 튜브를 잠시 원심 분리합니다. 100 μL RNase-free 버퍼(100 mM 칼륨 아세테이트, 30 mM HEPES, pH 7.5)에서 siRNAs를 20 μM의 농도로 재구성합니다. 이것은 siRNAs의 재고 솔루션입니다.</li>
	<li>Aliquot 이 스톡 용액은 튜브당 10 μL(20 μM 농도)에서 사용될 때까지 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>초미세 영구 마커를 사용하여, 항상 관심의 동일한 스크래치 영역을 식별하고 그 폐쇄를 따를 수 있도록 각 우물의 하단에 수평 라인6 웰 플레이트를 표시합니다. 참고: 6-well 배양 플레이트는 충분히 크기 때문에, 셀 단층 전반에 걸쳐 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 일관되고 재현 가능하며 수직 스크래치를 적용할 수 있는 충분한 공간과 유연성을 제공하기 위해 이 분석기에 사용되었다. 제한된 수의 셀을 사용할 수 있는 경우, 대안이자 비용 효율적인 방법은 12-또는 24웰 배양 플레이트를 사용하는 것입니다.</li>
	<li>플레이트 1차 섬유아세포는 야생형 및 β3 결핍 마우스4로부터분리되어, 2 mL 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)가 10% 태아 소 혈청(FCS)으로 보충된 경우 5 x 105 세포의 밀도에서 6웰 플레이트에서 잘 한다. 참고: 웰당 5 x 105 세포는 6웰 배양 플레이트와 1차 마우스 섬유아세포에 대해 확립되었습니다. 12- 또는 24-well 세포 배양 플레이트 또는 그밖 세포 모형을 사용하는 경우에 시험은, 크기에서 다를 수 있었습니다 필요할 수 있습니다. 세포는 생물학적 안전 캐비닛 클래스 II와 같은 멸균 환경에서 처리되어야 합니다.</li>
	<li>6웰 플레이트에 세포 유형, 유전자형 및 날짜를 표시합니다.</li>
	<li>6웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터내로 옮기고 24시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 세포를 유지한다.</li>
	<li>다음날, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내, 우물에서 세포 배양 배지를 흡인하고, 그것을 버리고 우물의 벽에 조심스럽게 첨가하여 2.25 mL 신선한 배양 배지로 대체한다.</li>
	<li>siRNAs와 섬유 아세포를 트랜스 펙트하기 위해, 제조 업체에서 권장하는 대로 지질 기반 의 형질 감염 시약을 사용합니다.</li>
	<li>각 형질감염에 대해 두 개의 미세 원심 분리튜브에 라벨을 붙입니다. 첫 번째 에서, 형질감염 시약의 9 μL을 추가하고 150 μL 감소 된 혈청 배지로 희석하십시오. 두 번째 튜브에서 1.5 μL siRNA(Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 또는 스크램블 된 siRNA를 음성 대조군으로)를 넣고 150 μL 감소 된 혈청 배지로 희석하십시오.</li>
	<li>희석된 siRNA를 2s. 21°C에서 5분 동안 인큐베이션하여 희석된 형질감염 시약 및 와류를 함유하는 튜브에 첨가한다.</li>
	<li>Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 또는 스크램블 siRNA로 우물을 라벨링합니다. siRNA-형질감염 시약 혼합물의 250 μL을 세포에 드롭와이즈로 첨가한다.</li>
	<li>6웰 배양판을 다시 인큐베이터에 넣고 세포를 37°C 및 5%CO2에서 72시간 동안 유지한다.</li>
	<li>Cacnb3 유전자 침묵의 효율을 확인하기 위해, 형질감염된 세포를 수집하고 앞서 설명한 바와 같이 면역블롯 분석을수행한다 4.</li>
</ol>2. 시험관 내 상처 치유 분석 (스크래치 마이그레이션 분석)
<ol><li>인큐베이터에서 세포 배양 판을 꺼내 10x 목적을 사용하여 현미경하에서 세포를 검사하였다. 스크래치 분석이 100% 합의에 도달한 경우에만 시작합니다. 참고: 정확성과 재현성을 위해 100% 합류는 스크래치 마이그레이션 분석을 시작하는 필수 요소입니다. 따라서, 배양 웰에 동일한 수의 세포를 시드하고, 각각의 웰을 수렴하고, 동일한 시점(일 0+)에 스크래치를 적용하는 것이 중요하다. 세포가 100% 합류에 도달한 후에 더 오래 기다리는 것은 다른 반응을 불러일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>일단 세포가 100% 합류에 도달하면, 우물에서 배양 배지를 흡인하고 그것을 폐기합니다.</li>
	<li>파이펫 팁(200 μL)을 사용하여 웰 의 중간에 있는 동시 셀 단층을 가로질러 웰 의 바닥에 표시된 수평 선에 수직 스크래치를 수동으로 생성합니다.</li>
	<li>2 mL 인산완충식염수(PBS)로 각각 2회 헹구고(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4,8.1 mMNa2HPO4,pH 7.4)로 손상된 세포, 느슨한 세포 및 긁힌 부위로부터 방출된 요인을 제거한다. 세포 배양에서 세포를 분리하지 않도록 우물의 벽에 조심스럽게 PBS 2 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>10% 혈청 또는 1% 혈청을 함유하는 세포 배양 배지 2 mL를 각 우물에 조심스럽게 추가합니다. 참고: 10% 혈청 및 1% 세럼 미만의 스크래치 분석기를 수행하여 관찰된 효과가 세포 증식 및 이동 또는 세포 이동에 의해서만 발생한다는 것을 확인하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>플레이트를 현미경 단계로 옮기고 가벼운 현미경을 사용하여 10배 배율로 긁힌 직후(잘 당 2개 영역)의 밝은 필드 이미지를 캡처합니다. 항상 스크래치의 동일한 영역을 이미지하려면 단계(1.3)로 준비된 가로선을 사용하고 이 선 위에 하나의 이미지와 이 선 아래에 있는 하나의 이미지를 가져가십시오. 이미지를 TIFF 또는 JPEG로 저장합니다.</li>
	<li>현미경 단계는 세포 성장 상태를 유지하지 않기 때문에, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮기고 세포를 37°C 및 5%CO2로유지한다.</li>
	<li>6, 10 및 30 h 후, 플레이트를 다시 현미경 단계로 이동하고 단계 2.6에 설명된 것과 동일한 방식으로 이미지를 캡처합니다. 참고: 이러한 시간 포인트는 기재된 절차 및 1차 섬유아세포에 대해 확립되었습니다. 첫 번째 파일럿 실험 동안, 더 많은 시간 포인트를 테스트하여 섬유아세포가 격차를 얼마나 빨리 다시 채우는지 확인했습니다. 0, 6, 10 및 30h가 합리적인 시작 지점이지만, 조사자는 각 응용 프로그램과 각 셀 유형에 대해 적절한 시간 지점을 최적화하고 설정해야 합니다. 더 정확한 대안은, 가능한 경우에, 시간 경과 현미경 검사법을 사용하는 것입니다.</li>
	<li>ImageJ13을사용하여 초기 무세포 영역(100%)을 정량화합니다. 및 6, 10 및 30 h 후 나머지 영역(그림 1). 그런 다음 셀 마이그레이션을 통해 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율은 초기 스크래치 영역을 기준으로 계산됩니다.</li>
</ol>3. 스크래치 영역 분석
<ol><li>Open ImageJ 소프트웨어13.</li>
	<li>이미지를 ImageJ 메뉴 모음에 삭제하여 첫 번째 이미지를 JPEG(예: 24비트 RGB 이미지 1360x1024)로 업로드합니다.</li>
	<li>프리핸드 선택 버튼을 선택하고 셀 프리 영역을 표시합니다.</li>
	<li>분석을 클릭하고 측정을선택합니다. 결과가 있는 창에 영역 값이 포함된 창이 나타납니다.</li>
	<li>이 값을 분석 스프레드시트로 전송합니다.</li>
	<li>시간 점 0h에서 각 이미지에 대해 3.2-3.5 단계를 반복한 다음 다음 시간 포인트 6, 10 및 30h에 대해 다시 시작합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 각 스크래치에 대해 6, 10 및 30h 후에 셀을 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율을 계산합니다. <img alt="세포 이동 분석을 위한 스크래치 분석 방정식. 공식: 세포 재증식 비율." src="/files/ftp_upload/59608/59608eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> a = 초기 스크래치의 셀 프리 영역, b = 6 시간 이후의 셀 없는 영역</li>
	<li>6시간 이후 셀을 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율에 대한 평균 및 표준 오차(S.E.M.)를 계산합니다.</li>
</ol>4. 생체 내 피부 상처 치유 분석
참고: C57BL/6 야생형 수컷(체중 22-26g을 가진 8-12주) 및 Cavβ3 결핍 마우스를 이 연구에 사용됩니다.
<ol><li>실험을 시작하기 하루 전에, 피부 접힘 챔버 준비에 사용되는 모든 수술 기구, 나사, 너트 및 티타늄 프레임을 오토클레이브합니다. 참고 : 티타늄 프레임은 두 개의 대칭 보완 반으로 구성되어 있으며 상처가 적용되고 현미경 검사법 (그림 2a참조)이 있는 원형 관찰 창이 있습니다.</li>
	<li>케타민 (75 mg / kg 체중)과 자일라진 (25 mg / kg 체중)의 혼합물을 포함하는 0.1 mL 식염수 / 10g 의 체중을 복강 내 (즉, 체외)에 의해 야생 형 또는 β3 결핍 마우스 (22-26 g 체중)를 마취. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오. 참고 :이 주사는 약 30 분 외과 마취를 제공하고 마취의 깊이는 마우스의 반사를 확인하여 수술 절차를 통해 제어해야합니다.</li>
	<li>눈의 건조나 손상을 방지하려면 안과 연고를 두 눈에 바르고 필요한 경우 반복하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 마우스 dorsum을 면도, 전기 면도기를 사용하여 다음 면도 영역에 제모 크림의 응용 프로그램은 나머지 머리를 제거합니다. 마우스 피부를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 모든 모발을 완전히 제거하기 위해 탈모 크림을 약 10분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>대칭 티타늄 챔버 프레임의 한 부분을 복용하여 티타늄 챔버를 준비하고 한쪽에 너트와 연결 나사를 고정합니다. 이러한 견과류는 피부내 혈관의 압축을 피하기 위해 챔버의 두 대칭 부분 사이에 400-500 μm을 유지하는 스페이서 역할을 할 것이다.</li>
	<li>마우스 뒷면에서 크림을 제거하고 따뜻한 (35-37 °C) 수돗물로 털이없는 부위를 청소하십시오.</li>
	<li>수술을 할 장소가 깨끗하고 따뜻하며 (37 °C) 가습되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>피부 소독제로 마우스의 털이 없는 부위를 소독합니다. 광원 앞에서 마우스의 뒤쪽 피부의 주름을 취하고 티타늄 챔버가 이식 될 피부의 이중 층의 중간 선을 배치합니다. 그 후, 폴리 프로필렌 봉합사로 피부를 고정하고 꼬리에 꼬리를 물고 금속 랙에 봉합사의 다른 쪽을 조여 마우스 접힌 피부를 들어 올립니다. 마우스가 편안하게 앉을 수 있도록 랙높이를 조정합니다.</li>
	<li>티타늄 챔버를 마우스의 뒤쪽 피부의 주름에 이식하여 접힌 등쪽 피부 층을 티타늄 프레임의 두 대칭 반쪽 사이에 끼우는 방식으로 삽입합니다. 티타늄 프레임의 전반부는 폴리프로필렌 봉합사를 통해 등쪽 피부 주름의 뒷면에 우수한 가장자리에 부착합니다. 참고 : 티타늄 프레임에는 우수한 가장자리에 8 개의 구멍이 있으며(그림 2a)접힌 피부는 8 개의 구멍 각각에 폴리 프로필렌 봉합사에 의해 잘 고정되어야합니다.</li>
	<li>다음 단계로 이동하기 전에 마우스의 반사를 확인하여 마취깊이가 유지되는지 확인하십시오.</li>
	<li>티타늄 챔버의 전반부에 부착된 두 개의 연결 나사를 피부 접기를 뒤쪽에서 앞쪽으로 관통합니다. 연결 나사의 매끄러운 침투를 돕기 위해 피부에 작은 절개를 (미세 가위를 사용하여) 확인합니다.</li>
	<li>랙에서 마우스를 분리하고 측면 위치에 놓습니다. 티타늄 챔버의 두 번째 상보반을 3개의 연결 나사 위에 놓고(그림 2a참조) 티타늄 프레임의 후반부를 통과하기 위해 손가락으로 약간의 압력을 가합니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 너트로 두 대칭 부품을 모두 고정합니다.</li>
	<li>너무 느슨하면 분리 될 수 있으므로이 단계에서 나사의 압박감에주의하십시오. 대조적으로, 너무 단단하면, 그것은 피부 주름을 짜내고, 혈류를 감소시키고 조직 손상 및 괴사로 이끌어 낼 수 있습니다. 참고: 4.5단계에서 제조된 너트는 티타늄 챔버의 두 대칭 반쪽 사이에 400-500 μm의 거리를 유지하는 스페이서 역할을 한다. 약간의 저항이 느껴질 때까지 너트를 조여야 합니다.</li>
	<li>펜치를 사용하여 나사의 나머지 부분을 잘라냅니다. 참고: 이 단계에서는 나사가 잘못된 방향으로 벗겨지는 경우를 대비하여 눈 보호를 위해 실험실 안전 안경을 사용해야 합니다.</li>
	<li>재발성 상처 크기를 보장하기 위해 피부 접이식 챔버의 관찰 창 내의 피부 중앙에 표준화된 생검 펀치(직경 2mm)로상처 부위를 표시합니다.</li>
	<li>미세 한 집게와 가위를 사용 하 여 표피와 진피와 함께 전체 피부를 제거 하 여 표시 된 영역 내에서 원형 상처를 만듭니다. 최종 상처 부위는 약 3.5-4.5 mm2, 그림 2b를 참조하십시오. 0.5 mL 멸균 식염수 (0.9 % NaCl, 37 °C)로 상처를 청소하십시오.</li>
	<li>유리 커버 슬립으로 상처를 덮고 티타늄 챔버의 스냅 링 플라이어를 사용하여 스냅 링으로이 유리 커버 슬립을 고정하십시오.</li>
	<li>수술 을 마친 직후, 카메라가 장착 된 입체 현미경의 이미징 단계에 마우스를 놓고 조명 아래 이미지 (0 일째)를 찍습니다. 40배 배율을 사용하고 향후 오프라인 분석을 위해 이미지를 저장합니다. 참고: 조사관은 캡처 직후 이미지를 검사하여 향후 오프라인 분석에 품질이 충분한지 확인해야 합니다. 피부 접이식 챔버의 제조 및 피부 상처의 성능은 약 30 분이 소요됩니다.</li>
	<li>적어도 2 시간 동안 마취에서 회복하는 동안 따뜻한 장소에 마우스를 유지하십시오. 그 후, 개별 케이지에 있는 마우스를 동물 시설(12 시간 빛/어두운 주기)으로 옮기고 마우스가 음식과 물에 접근할 수 있는지 확인합니다.</li>
	<li>3일 후 상처 후 마우스를 마우스 구속기에 놓고 이미징 단계 위에 구속기를 고정시다.</li>
	<li>카메라가 장착된 스테레오현미경 아래에 스테이지를 놓습니다. 40배 배율로 조명 아래에서 이미지를 찍고, 모든 사진을 녹화하고, 향후 오프라인 분석을 위해 저장합니다.</li>
	<li>6일째, 10일 및 14일째에 4.20 단계와 4.21단계를 다시 반복합니다.</li>
	<li>ImageJ13의오프라인 분석을 위해 상처 이미지를 사용합니다. 0일째의 상처 부위는 100%로 간주되며 시간이 지남에 따라 상처 폐쇄는 초기 상처 부위를 기준으로 플롯됩니다. 대표적인 결과는 그림 2c,d에나와 있습니다.</li>
	<li>백분율 계산(%) 다음 방정식을 사용하여 각 시점에서 상처 부위의 다음을 수행합니다. <img alt="상처 치유 계산 공식, 수학 방정식에서 시간 경과에 따른 상처 면적의 백분율." src="/files/ftp_upload/59608/59608eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> x: 시간 점 (일 0, 3, 10 또는 14), a: 0일째의 상처 부위, b: 시간 지점 x의 상처 부위</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

이 원고에서, 우리는 생체 외 및 생체 내 상처 치유 분석기를 설명하고 얻어진 결과를 상관시상한다. 시험관내 분석의 경우, 1차 마우스 섬유아세포4,14,15를 사용하였으며 이는 상처 치유 및 조직 리모델링에 중요한 역할을 한다11. 단층으로 성장하는 다른 부착 세포 유형 (예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포)도 사용할 수 있습니다. 정확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 동일한 수의 생존 가능하고 건강한 세포를 도금하고 동일한 수준의 컨플루시로 스크래치를 적용하는 것이 가장 중요합니다. 생물학적 및 기술적 복제를 수행하는 것이 좋습니다. 본 방법에서는 6 웰 플레이트가 사용되었지만 12- 또는 24 웰 플레이트는 특히 제한된 수의 셀만 사용할 수있는 경우에도 사용할 수 있습니다. siRNA 처리의 경우에...

피부 상처 치유는 피부의 무결성을 회복하고 감염으로부터 유기체를 보호하기 위해 피부 손상 직후에 시작됩니다. 상처 치유 과정은 네 개의 겹치는 단계를 거칩니다. 응고, 염증, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링1. 세포 마이그레이션은 이러한 단계에서 매우 중요합니다. 염증성 세포, 면역 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 섬유아세포는 상이한 시점에서 활성화되고 상처 부위2를침범한다. 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 조사하는 방법은 근본적인 메커니즘을 이해하는 것뿐만 아니라 새로운 약물을 테스트하고 피부 상처 치유를 개량하고 가속화하는 것을 목표로하는 새로운 전략을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다.
셀 마이그레이션을 모니터링하고 분석하기 위해 스크래치 마이그레이션 분석을 사용할 수 있습니다. 그것은 종종 시험관 내 상처 치유 분석이라고합니다. 이 방법은 세포 배양 시설3을필요로 한다. 그것은 간단한 절차이고, 고급 장비의 필요가 없고 대부분의 세포 생물학 실험실에서 분석이 수행될 수 있습니다. 이 분석에서, 무세포 영역은 동봉된 세포 단층, 바람직하게는 상피-또는 내피 유사 세포 또는 섬유아세포의 기계적 파괴에 의해 생성된다. 스크래치 가장자리의 셀은 생성된 간격을 다시 채우기 위해 마이그레이션됩니다. 시간이 지남에 따라 감소하는 세포 없는 영역의 정량화는 이동 속도와 유사하며 세포가 간격을 좁힐 필요가 있는 시간을 나타냅니다. 이를 위해, 조사자는 WT 마우스 또는 관심 유전자가 결여된 마우스로부터의 급성 단리된 세포또는4, 또는 신뢰할 수 있는 세포 저장소로부터 사용할 수 있는 불멸의 세포를 사용할 수 있다. 스크래치 분석법은 약리활성 화합물의 영향 또는 형질 감염된 cDNAs 또는 siRNAs가 세포 이동에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다.
생체 내에서 상처 치유는 피부의 물리적 무결성을 가능한 한 빨리 복원하기 위해 각질 세포, 염증 세포, 섬유 아세포, 면역 세포 및 내피 세포를 포함한 다양한 세포 유형을 필요로하는 복잡한 생리적과정입니다 1 . 생체 내에서 연구하는 다른 방법은 과거5,6,7,8에서개발및 사용되어 왔다. 본 항에 기재된 등쪽 피부접이식 챔버는 이전에 상처 치유 어세9에사용되었다. 마우스에 대한 변형된 등지 피부 접힘 챔버 제제로서 사용된다. 변형된 스킨폴드 챔버 모델은 몇 가지 장점이 있다. 1) 그것은 상처 치유 과정을 관찰하는 것을 방지하고 마우스의 상처 수리에 영향을 미칠 수있는 피부 수축을 최소화합니다. 2) 이 챔버는 유리 커버 슬립으로 상처를 덮어 조직 감염과 탈수를 줄여 치유 과정을 지연시킬 수 있습니다. 3) 혈류와 혈관을 직접 모니터링 할 수 있습니다. 4) 상처를 치료하고 치유를 가속화하기 위해 약리활성 화합물 및 시약의 반복적 인 국소 적용을허용9,10.
우리는 고전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 프로토콜, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델을 사용하여 피부 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 시험관내 분석의 경우, 우리는 1차 섬유아세포를 사용하였지만, 이들 세포는 Cavβ3 단백질을 코딩하는 Cacnb3 유전자를 발현하지만 탈분극 유도된Ca2+ 유입 또는 전압 의존적Ca2+ 전류가 부족하다. 우리는 이 섬유아세포에서 Cavβ3의 새로운 기능을 기술했습니다: Cavβ3는 이노시톨 1,4,5-삼위산염 수용체(IP3R)에 결합하고 소포체로부터 칼슘 방출을 제약합니다. 마우스에서 Cacnb3 유전자의 삭제는 IP3에 대한 IP3R의 감도 증가, 향상된 세포 이동 및 증가된 피부 상처 복구4를유도한다.

<table><tbody><tr><td>0.9 % NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치</td><td>Kai Industries</td><td>48201</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Cacnb3 마우스 siRNA Oligo Duplex (궤적 ID 12297)</td> <td>Origene</td><td>SR415626</td><td></td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td></td><td></td><td>모든 탈모 크림</td></tr><tr><td>덱스판테놀 5% (베판텐)</td><td>바이엘</td><td>3400935940179.00</td><td>(베판텐)</td></tr><tr><td>디하이드록실리디노티아진 염산염(자일라진)</td><td>바이엘 헬스케어</td><td></td><td>롬푼 2%</td></tr><tr><td>둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)</td><td>생명 과학의 기브코</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>깁코 생명 과학의 생명 기술</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>육각형 전체 너트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>Zoetis</td><td></td><td>KETASET</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Keyence, Osaka, Japan</td><td>BZ-8000</td><td>유사한 현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Micro-byps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 구속 장치</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>오브젝티브</td><td>니콘</td><td>계획 apo 10x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 봉합</td><td></td><td></td><td></td></tr>사 <tr><td>스크루 드라이버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스킨 소독제 (octeniderm)</td> <td>Sch &uuml; LKE & Mayr GmbH</td><td>118212</td><td></td></tr><tr><td>슬롯 치즈 헤드 스크류</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스냅 링</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스냅 링 플라이어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>카메라가 있는 수술용 현미경</td><td>라이카</td><td>라이카 M651</td><td></td></tr><tr><td>스킨폴드 챔버용 티타늄 프레임</td><td>IROLA</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>와이어 파일러</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

손상된 절단 상처 치유는 당뇨병을 앓고있는 환자와 노인에게 중요한 관심사이며 효과적인 치료가 필요합니다. 적절한 생체외 및 생체내 접근법은 피부 상처 치유 과정을 개선하기 위한 약물 치료를 위한 새로운 표적 분자의 식별에 필수적이다. 우리는 전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 분석법, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델에서 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 1 차 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs) 야생 형 (WT) 및 Cavβ3 결핍 마우스 (Cavβ3 KO) 또는 SiRNA로 처리 된 WT 마우스로부터 급성으로 분리 된 섬유 아세포는 Cacnb3 유전자의 발현을 하향 조절합니다. , Cavβ3을 인코딩하여 사용했습니다. 스크래치는 결합 된 세포 단층에 적용하고 갭 클로저는 마이그레이션 셀에 의해 갭의 완전한 재모독까지 정의 된 시점에서 현미경 이미지를 복용하여 뒤따랐다. 이들 이미지는 분석되었고, 각 조건에 대해 세포 이동 속도를 결정하였습니다. 생체 내 분석에서, 우리는 WT와 Cavβ3 KO 마우스에 등쪽 피부 접이식 챔버를 이식하고, 직경 2mm의 정의된 원형 상처를 적용하고, 감염및 탈수로부터 보호하기 위해 유리 커버 슬립으로 상처를 덮고, 거시적 상처 폐쇄를 모니터링했습니다. 시간이 지남에 따라. 상처 폐쇄는 Cacnb3-유전자결핍 마우스에서 상당히 빨랐다. 생체외 분석의 결과는 생체외 분석과 상관관계가 잘 연관되기 때문에, 시험관내 분석노는 생체내 상처 치유 모델에 의한 시험관 내 안타를 검증하기 전에 높은 처리량 스크리닝에 유용할 수 있다. 우리가 야생형 및 Cavβ3 결핍 마우스 또는 세포를 위해 여기에서 보여준 것은 또한 Cavβ3 이외에 특정 분자를 위해 적용될 수 있습니다.

스크래치 분석은 야생형 및 β3 결핍 MEFs의 동시 세포 단층상에서 수행하였다(도1c). 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 "스크래치"를 수행 한 후, 두 유전형의 세포가 스크래치 영역으로 이동하고 간격을 닫습니다. 이미지는 6, 10 및 30시간 후에 촬영하였다(도1a). 셀 마이그레이션을 백분율(%)으로 정량화했습니다. 스크래치 를 수행한 후 6시간 후에 셀을 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역입니다. Cavβ3 결핍 MEF를 마이그레이션하는 것은 야생 형 마우스로부터의 MEF보다 훨씬 일찍 스크래치 영역을 폐쇄하였다(그림1a,b). 세포 증식의 임의의 효과를 배제하기 위해, 스크래치 마이그레이션 분석기는 10% 또는 1% FCS의 존재 에서 수행되었다. 10% FCS...

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

피부 상처의 치료에 대한 반란의 필요성. 약물 치료에 대 한 대상 분자를 식별 하려면, 시험 관 및 생체 내 테스트 시스템 필요. 적절한 시스템은 생체 외 스크래치 분석, 및 생체 내 등등 피부 접이식 챔버입니다.둘 다 약리학적활성 화합물의 부재와 존재에서 세포 이동 및 피부 상처 치유를 모니터링하기위한 직선 앞으로 절차입니다. 두 기술이 모두 직선적이지만 조사관은 스크래치 응용 프로그램을 연습해야 합니다. 그리고 등변 피부 접이식 챔버 이식, 그리고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 상처.절차의 데모는 박사 마티아스 Laschke에 의해 수행됩니다, 임상 및 실험 수술 연구소의 외과 의사 및 교수. 절차를 시작하기 전에 초미세 영구 마커를 사용하여 셀 유형당 6 개의 우물 플레이트를 표시하고 각 웰의 하단에 수평 선이 되어 각 배양에 대한 스크래치 영역을 묘사합니다. 다음 플레이트 1차 섬유 폭발은 야생형 및 베타 3 결핍 마우스로부터 분리되어, 6개의 웰 플레이트에서 5배 10에서 5배 의 5배 섬유 폭발에 잘 농도당 폭발한다.DMEM의 2mL에서 10 %의 태아 소 세럼으로 보충. 세포 유형, 유전자형 및 날짜로 플레이트에 레이블을 지정합니다. 그리고 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.다음 날 아침, 각 지질 기반 의 형질 전환 시약의 마이크로 리터 9 마이크로 리터를 튜브 당 150 마이크로 리터의 감소 된 혈청 매질을 포함하는 개별 마이크로 원심 분리 튜브에 추가합니다. 튜브 당 150 마이크로 리터의 감소 된 혈청 매체를 포함하는 transfection 시약 당 두 번째 마이크로 원심 분리튜브에 1.5 마이크로 리터의 siRNA를 추가하십시오. 각 siRNA 용액을 단일 형질 시약 용액과 혼합합니다.잠시 소용돌이 후 혼합물을 섭씨 21도에서 5분간 배치합니다. 인큐베이션 동안 각 우물의 슈퍼네이트를 조심스럽게 교체하십시오. 우물의 측면 아래로 신선한 문화 매체의 2.25mL.인큐베이션의 끝에서 적절한 siRNA 경질 시약 혼합물의 250 마이크로 리터를 추가하고, 세포의 각 해당 우물에 현명하게 드롭. 그리고 72 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다. 세포가 100%에 도달하면 각 우물에서 배양 상류를 폐기하십시오.그리고 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 컨클레이트 셀 단층에서 스크래치를 만듭니다. 각 웰의 하단에 표시된 수평 선으로 수직입니다. 그런 다음 조심스럽게 세차 당 PPS의 2mL로 2 번 잘 부상 각 상처를 씻어.손상된 세포에서 방출된 요인을 제거하려면, 긁힌 부위에서 느슨한 세포 또는 파편. 두 번째 세척 후 신선한 세포 배양 배지의 2mL을 각 우물에 1 또는 10 %의 혈청으로 보충합니다. 그리고 가벼운 현미경의 단계에서 각 접시에 상처의 이미지를 캡처합니다.10X 배율에서 긁힌 직후. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 다음 30시간 동안 적절한 실험 시간 지점에서 이미지를 계속 캡처합니다.실험의 끝에서 초기 세포 자유 영역과 6, 10 및 30 시간의 배양 후 남은 영역을 정량화한다. 초기 스크래치 영역을 기준으로 마이그레이션 셀에 의해 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율을 결정합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 야생 유형 또는 베타 3 녹아웃 C57 블랙 6 마우스에서, 신중하게 dorsum을 면도.그리고 동물의 눈에 연고를 적용합니다. 남은 모발을 제거하기 위해 디필 크림을 바르습니다. 10 분 후에 크림을 제거합니다.티타늄 챔버를 준비하려면 대칭 티타늄 챔버 프레임의 한 부분을 너트와 연결된 나사로 수정합니다. 챔버의 두 대칭 부분 사이에 400 내지 500 마이크로미터를 유지한다. 피부에 혈액 소포의 압축을 피하기 위해.노출된 피부를 70%에탄올로 소독합니다. 그리고 광원 앞에서 피부의 주름을 잡습니다. 티타늄 챔버가 이식될 곳에 피부 의 이중 층의 중간 선을 배치합니다.그리고 두개골과 캐디폴리 프로필렌 봉합사로 피부 주름을 고정합니다. 접힌 피부를 들어 올리기 위해 금속 랙에 봉합사의 반대편을 조입니다. 그리고 마우스가 편안하게 앉을 수 있도록 랙의 높이를 조정합니다.티타늄 챔버의 첫 번째 프레임을 등쪽 피부 주름의 뒷면에 우수한 가장자리에 폴리 프로필렌 봉합사에 의해 봉합. 세이빙을 재확인한 후 미세 한 가위를 사용하여 피부에 작은 절개를 만듭니다. 그리고 티타늄 챔버의 상반기에 부착 된 두 개의 연결 나사를 피부 주름의 베이스를 통해 전달합니다.랙에서 마우스를 제거하고 동물을 측면 위치에 놓습니다. 티타늄 챔버의 두 번째 무료 반쪽을 3개의 연결 나사 위에 놓습니다. 그리고 티타늄 프레임의 후반을 통과하기 위해 수동으로 약간의 압력을 가합니다.접힌 피부 층은 이제 티타늄 프레임의 두 대칭 반쪽 사이에 끼어 있습니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 너트로 대칭 부품을 모두 수정합니다. 표준화된 2mL 직경생검 펀치를 사용하여 피부 접이식 챔버의 관찰 창 내에서 피부 중앙에 있는 상처 부위를 표시합니다.그리고 미세 한 집게와 가위를 사용하여 마크 내의 전체 표피와 진피를 제거합니다. 원형 상처를 만들수 있습니다. 멸균 식염수 0.5mL로 3반~4반의 밀로미터 제곱 상처를 청소합니다.그리고 유리 커버 슬립으로 상처를 덮습니다. 티타늄 챔버의 스냅 링 펜치를 사용하여 커버슬립을 제자리에 고정시하십시오. 그리고 마우스를 스테레오 현미경의 이미징 단계로 즉시 전송합니다.그런 다음 상처를 40배배속도로 이미지화합니다. 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 케이지에 넣기 전에. 입증된 바와 같이 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 스크래치를 만든 후, 이 대표적인 실험에서 두 유전자형의 세포가 스크래치 영역으로 이동하고 간격을 닫았다.세포 이동은 스크래치를 수행한 후 6시간 동안 세포를 마이그레이션하여 다시 채워진 스크래치 영역의 백분율로 정량화되었다. 예를 들어 Cav beta 3 결핍 섬유 폭발을 마이그레이션하는 이 실험에서 야생 형 마우스의 섬유 폭발보다 훨씬 일찍 스크래치 영역을 폐쇄했습니다. Cav 베타 3 결핍 섬유 폭발에서 관찰된 Cav beta 3 의존효과를 확인하기 위해, 야생형 섬유 폭발은 Cav beta 3 단백질을 조절하기 위해 siRNA에 감염되었다.Cav 베타 3 특정 siRNAs로 처리된 섬유 폭발은 베타 3 결핍 섬유 폭발처럼 행동합니다. 두 유전자형 사이의 피부 상처 치유를 비교하기 위해, 피부 접이식 챔버의 상처 부위는 상처 후 직접 촬영되었다. 그리고 상처는 다음 2 주 동안 이미지되었다.상처의 크기는 이미지와 상처 부위에 측정되었으며, 주어진 날에는 초기 상처 부위의 백분율로 표현되었다. 예상대로 카베 베타 3 결핍 마우스에서 상처 폐쇄율이 야생형 대조군과 비교하여 증가하였다. 각 스크래치에 대해 파이펫 팁에 동일한 압력을 가하고 스크래치를 플레이트 바닥의 표시된 선에 가능한 한 가깝게 일치해야 합니다.등등 피부 접이식 챔버의 관찰 창은 치유 과정에서 언제든지 열 수 있습니다. 다른 약리학적 활성 화합물의 국소 적용을 허용. 또한 치유 과정의 다른 단계에서 부상당한 부위를 소비 할 수 있습니다.분자 단백질 생화학 적 또는 조직학적 분석을 위해.

scratch-migration-assay-dorsal-skinfold-chamber-for-vitro-vivo

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이동 능력은 중간엽 기질 세포(MSC)를 포함한 다양한 세포 유형의 핵심 기능입니다. 그러나 피해 후 이동 능력의 변화를 정량화하는 것은 어려운 일입니다. 이 프로토콜은 엄격한 통계를 사용하여 손상 후 MSC 이동 용량의 변화를 정량화하는 쉽게 적용할 수 있는 이동 분석을 설명합니다.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

여기서, 우리는 96 웰 세포 배양 접시에 반 처리량 세포 이동 분석을 수행 할 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 셀 단층에 일관성 스크래치 상처를 만들 수있는, 빠르고 간단하고 경제적 인 방법이다.

96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

이 연구는 상처 치유 (스크래치 분석 결과의) 메커니즘으로 비소 영향 세포 마이그레이션 등 어떻게 환경 오염 물질을 결정 하기 위한 생체 외에서 모델에 중점을 둡니다. 결과이 체 외 분석 결과 제공 신속 하 고 초기 징후 vivo에서 실험 전에 셀룰러 마이그레이션에 대 한 변경 하는 방법을 보여 줍니다.

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

배우세요 생체 외 스크래치 분석과 생체 내 등갈 피부 접기 챔버를 이용한 상처 치유 평가 방법입니다. 이 기술은 섬유아세포 이동과 약물 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

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