Name: 단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 AFM 캔틸레버에 단일 T 세포를 기능화하여 수지상 세포-T 세포 상호작용을 실시간으로 탐구하는 방법. 생체적합성 접착제를 사용하여 면역 세포 활성화와 면역 시냅스 형성을 연구할 수 있습니다.

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<ol><li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li>
<li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li>
<li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li>
<li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+probing+the+spatial+organization%2C+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li>
<li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro%3A+direct+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li>
<li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li>
<li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor%2FCD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li>
<li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li>
<li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent%2C+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li>
<li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li>
<li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li>
<li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li>
<li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li>
<li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li>
<li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li>
<li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+%28Fn%29+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li>
<li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li>
<li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li>
<li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li>
<li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li>
<li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

AFM 기반 단세포 힘 분광법은 살아있는 세포의 생물물리학적 특성을 해결하는 강력한 도구로 발전했습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우, 캔틸레버는 관심 있는 세포에 대한 특정 상호 작용 또는 특성을 조사하기 위해 제대로 기능화되어야 합니다. 여기서, 단일 T 세포와 단일 미크로넨 크기의 비드를 팁리스 캔틸레버에 결합하는 방법이 각각 기재되어 있다. 단일 T 세포를 캔틸레버에 부착하기 위해 생체 적합성 접착제를 세포 접착제로 선택했습니다. 해양 홍합에서 추출한 특수 한 단백질 용액입니다. 그것의 접착성은 하이드록실 그룹이 비특이적 인 방식으로 세포 표면에 노출 된 잔류물과 수소 결합을 형성 할 수있는 폴리 페놀 성 잔류물에서 비롯됩니다. 이 결합 방법은 일반적으로 결합 된 세포의 세포 기능을 방해하지 않습니다. 적절한 접착을 위해 부착할 세포의 조건도 중요합니다. 갓 정제된 마우스 CD4+T 세포의 경우, 캔틸레버 기능화에 사용되기 전에 인간 IL-2로 하룻밤 동안 먼저 처리해야 합니다. 그렇지 않으면, 그들은 오히려 빨리 세포 ...

원자력 현미경 검사법 (AFM), 다재 다능한 도구는세포 생물학 연구 1, 2,3,4,5에서많은 응용 프로그램을 발견했습니다. 고해상도 이미징 기능 외에도, 네이티브 포스 프로빙 기능은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 단일 세포 수준6,7에서현장에서 직접 조사 할 수 있게합니다. 이들은 세포내 세포 구조 또는 전체 세포 8,9,10,11,12,특정 리간드/수용체 결합 강도의 강성을 포함합니다. 세포 표면(13)에대한 단일 분자 수준, 고체 입자와 세포의 단일 쌍 또는 두 세포 사이 또는 1,2,14,15사이의 접착력. 후자의 두 가지는 종종 단세포 힘 분광법 (SCFS)16으로분류됩니다. 다양한 스프링 상수와 쉽게 사용할 수있는 캔틸레버로 인해 AFM에 액세스 할 수있는 힘 범위는 몇 피코 뉴턴 (pN)에서 마이크로 뉴턴 (μN)까지 다소 광범위하며, 이는 수십 개의 힘을 포함하는 세포 이벤트의 전체 범위를 적절하게 커버합니다. pN의, 예컨대 수용체 계 단일 분자 결합, nN, 예컨대 식세포이벤트(15). 이 큰 동적 힘 범위는 AFM을 광학/자기 핀셋 및 생체 막 힘 프로브와 같은 다른 힘 프로빙 기술에 비해 유리하게 만들며, 일반적으로 200 pN17 미만의 힘으로 약한 힘 측정에 더 적합합니다. , 18. 또한, AFM은 spatiotempoy 정의 된 방식으로 단일 세포에 다양한 자극을 전달하는 고정밀 조작기로서 기능 할 수있다4,19. 이는 실시간 단세포 활성화 연구에 바람직하다. 살아있는 세포 형광 화상 진찰과 결합된, 특정 자극에 대한 후속 세포 반응은 동시에 감시될 수 있습니다, 따라서 AFM 기지를 둔 SCFS는 세포 신호를 탐사하는 실용적인 공구를 제공하는 광학 화상 진찰로 대단히 견고하게 만듭니다. 예를 들면, AFM은 조골 세포20에있는 칼슘 과도를 이끌어 내는 것을 요구되는 긴장을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 작품에서, 칼슘 과도는 AFM 팁으로 배양 된 조골 세포에 국한 된 힘을 적용 한 후 칼슘 비율 측정 이미징을 통해 형광으로 추적되었습니다. 최근, AFM은 간 성세포(HSC)가 성장한 콜라겐 섬유를 스트레칭하는 데 사용되었으며, 이러한 메카노-트랜스듀싱 HSC 활성화는 형광 Src 바이오센서에 의해 실시간 모니터링되었으며, 그 인산화는 바이오 센서의 형광 강도는 HSC 활성화3과상관관계가 있습니다.
AFM 기반 SCFS 실험에서 AFM 캔틸레버의 적절한 기능화는 성공적인 측정을 향한 핵심 단계입니다. 우리의 연구 관심은 면역 세포 활성화에 초점을 맞추고 있기 때문에, 우리는 일상적으로 식세포증 및 / 또는 강한 면역 반응을 유발할 수있는단일 고체 입자와 같은 미립자 물질로 캔틸레버를 기능화4,14 , 15 및 활성 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포로 면역 시냅스를형성할 수 있는 단일 T 세포 2. 단일 고체 입자는 일반적으로 공기 환경에서 에폭시 접착제를 통해 캔틸레버에 결합되는 반면, 단일 T 세포는 비 접착 성질로 인해 용액의 생체 적합성 접착제를 통해 캔틸레버로 기능화됩니다. 여기서는 이러한 두 가지 유형의 캔틸레버 수정을 수행하고 두 개의 관련 응용 프로그램을 제공하는 방법에 대해 설명합니다. 첫번째 응용은 세포 역학 관점에서 규정하는 T 세포의 억제 기계장치를 이해하기 위하여 AFM-SCFS를 가진 T 세포/DC 상호 작용을 탐구하는 것입니다. 두 번째는 수용체 독립적 인 포스 파티딜리노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2)의 분자 메커니즘을 밝히기 위해 실시간으로 고체 입자에 대한 대식세포의 세포 반응을 모니터링하기 위해 살아있는 세포 형광 이미징과 AFM을 결합하는 것을 포함합니다. 모에신은 식세포증을 매개했다. 이 프로토콜의 목적은 면역 학적 연구를위한 AFM 기반 단일 세포 분석을 통해 자신의 실험 설정을 설계하고 구현하기 위해 관심있는 연구자들이 참조 프레임 워크를 제공하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher</td><td>104-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>직경 6cm 배양 접시</td><td>NALGENE nunc</td><td>150462</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>JET</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>AFM 캔틸레버</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow-TL1-50</td><td>팁리스 캔틸레버</td></tr><tr><td>&베타;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>7604</td><td></td></tr><tr><td>생체 적합성 접착제</td><td>BD Cell-Tak</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td><td>STEMCELL</td><td>19852C.1</td><td></td></tr><tr><td>DC2.4 cell line</td><td>K. Rock(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)의 선물덱</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트란 코팅 자성 입자</td><td>STEMCELL</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GENEray</td><td>Generay-E1101-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>에폭시</td><td>ERGO</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>twbio</td><td>00019</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Ex Cell Bio</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단제</td><td>STEMCELL</td><td>18731</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>로컬 벤더(Hai Men Lian Sheng)</td><td>HX-E37</td><td>24mm 직경, 0.17mm 두께,</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>JinTong 실험실 및 장비 관리 부서, Haimen&nbsp;</td><td>N / A</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>H < 서브 > 2 < / 서브 > O< 서브 > 2 < / 서브 > (30 %)</td> <td>중국 제약</td><td>10011218</td><td></td></tr><tr><td>H < 서브 > 2 < / 서브 > SO < >4 < ></td> <td>80120892</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>시그마</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>자석</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>메쉬 나일론 스트레이너</td><td>BD 팔콘</td><td>REF 352350</td><td></td></tr><tr><td>Moesin-EGFP</td><td>N/A</td><td></td><td>실험실에서 복제됨</td></tr><tr><td>마우스 CD25 Treg 세포 양성 분리 키트</td><td>STEMCELL</td><td>18782</td><td>구성 요소: FcR 차단제, 조절 T 세포 양성 선택 칵테일, PE 선택 칵테일, Dextran RapidSpheres,</td></tr> <tr><td>마우스 CD4+ Tcell 분리 키트</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td>구성 요소: CD4+T 세포 분리 칵테일, 스트렙타비딘 RapidSpheres, 쥐 혈청</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Lanyi 화학 제품 유한 회사? 베이징</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1022-500</td><td></td></tr><tr><td>PE 선택 칵테일</td><td>STEMCELL</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>PLC&delta;-PH-mCherry</td><td>Addgene</td><td>36075</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로스피어 6.0&mu; </td><td>m Polysciences</td><td>07312-5</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>랫 세럼</td><td>STEMCELL</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>&nbsp; ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 인터루킨-2</td><td>Peprotech</td><td>Peprotech, 200-02-1000</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>조절 T 세포 양성 선택 칵테일</td><td>STEMCELL</td><td>18782C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>샘플 챔버</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 코팅 자성 입자</td><td>STEMCELL</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>형질주입 키트</td><td>클론텍</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25% EDTA</td><td>생명</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>JD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x objective NA 0.8</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901</td><td>Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>Atomic force microscope</td><td>JPK</td><td>cellHesion200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>형광 이미징</td><td>Zeiss 현미경 스탠드를 기반으로 한 집에서 만든 대물렌즈 형 전반사 형광 현미경</td> 가습 CO2 인큐베이터 Thermo Fisher HERACELL 150i 도립광 현미경 Zeiss Observer A1 설명서 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 t 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

원자력 현미경 검사법 기반 단일 세포 힘 분광법 (AFM-SCFS)은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 세포, 수용체 및 리간드 사이, 그리고 많은 그밖 변이와 더불어 그(것)들을 포함하여 살아있는 세포막에 상호 작용 힘 그리고 역학을 탐구하는 것을 허용합니다. 그것은 또한 spatiotemporally 통제된 방식으로 단 하나 세포에 물리적 또는 생화확적인 자극을 전달하는 기계장치로 작동합니다, 따라서 살아있는 세포와 결합될 때 특정 세포 활성화 및 후속 세포 사건을 실시간으로 감시될 수 있게 합니다 형광 이미징. 이러한 AFM-SCFS 측정의 핵심 단계는 AFM-캔틸레버 기능화 또는 즉, 관심 있는 주제를 캔틸레버에 부착하는 것입니다. 여기에서, 우리는 면역학 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 단 하나 폴리스티렌 비드를 각각 가진 AFM 캔틸레버를 수정하는 방법을 제시합니다. 전자는 단일 T 세포를 용액의 평평한 캔틸레버 끝에 결합하는 생체 적합성 접착제를 포함하고, 후자는 공기 환경에서 단일 비드 접착을 위해 에폭시 접착제에 의존합니다. 각 캔틸레버 수정과 관련된 두 가지 면역 학적 응용 분야도 제공됩니다. 여기서 설명한 방법은 다양한 세포 유형 및 고체 입자에 쉽게 적응할 수 있습니다.

그림 4A는 단일 T 셀과 단일 DC 간의 결합 상호 작용으로부터의 일반적인 힘 거리 곡선을 하나의 접근-리트랙트 사이클에서 보여줍니다. 연한 빨간색 곡선은 확장 곡선이고 진한 빨간색 곡선은 후퇴 곡선입니다. 확장 곡선은 일반적으로 들여쓰기 또는 강성 분석에 사용되므로 여기서는 후퇴 곡선만 셀 접착에 대해 우려됩니다. 곡선의 최소값(녹색 원)은 최대 접착력을 측정합니다. 곡선 아래의 영역(그늘진 영역)은 T 셀을 DC로부터 분리하는 데 필요한 작업(에너지)을 나타냅니다. 완전한 분리 전에 날카롭고 단계별 파열 사건이 종종 관찰됩니다. 이것은 세포/세포 인터페이스에서 강한 결합으로 인해 세포 표면에서 멤브레인 테더가 당겨지고 연속 당김 하에서 개별적으로 파괴되는 것으로 해석됩니다. 상기 단계의 개수, 높이 및 길이는 세포막(21)의 기계적성질을 특성화하는데 사용될 수 있다. T...

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

이 프로토콜은 단일 T 셀및 고체 입자를 사용하여 AFM 캔틸레버를 작동하는 가장 좋은 방법을 설명합니다. 이러한 팁은 단일 쌍 수지상 세포-T 세포 상호 작용을 조사하고 각각 변덕스러운 크기의 세포 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 캔틸레버의 단일 T 세포 기능화를 위해 생체 적합성 접착제를 사용한다는 것입니다.이 접착제는 진핵 세포에 불활성, 따라서 그들의 기준선 활성화 단계에 T 세포를 유지. 이 방법은 면역 세포 활성화 및 면역 시 냅 스 형성 등 복잡 한 세포 간 이벤트에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 방법은 또한 세포 세포 또는 세포 표면 상호 작용을 관련시키는 그밖 시스템으로 확장될 수 있습니다.이 기술에 새로운 누군가를 위해, T 세포가 사용하기 전에 양호한 상태에 있고 하룻밤 IL-2로 전처리된다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 또한 생체 적합성 접착제를 사용할 때는 불필요한 산화로부터 보호하기 위해 신속하게 움직입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜을 따라 다음하여 현미경 검사법에 대한 단일 T 셀을 준비합니다.그런 다음 DC2.4 셀로 시드된 유리 커버립을 준비하고, 37°C와 5%CO2에서 가습 챔버에서 밤새 세포를 배양한다. 피라냐 처리, 플라즈마 청소 또는 UV 오존 청소를 사용하여 낮은 스프링 상수로 부드럽고 팁없는 캔틸레버를 청소하십시오. 그런 다음 청소된 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착합니다.다음으로 깨끗한 샘플 챔버를 준비하고 순수한 물로 채웁니다. 캔틸레버의 감도를 얻기 위해 먼저 유리 기판에 힘 곡선을 실행하여 물 용액에서 캔틸레버를 보정합니다. 그런 다음 열 잡음 스펙트럼을 기록하여 스프링 상수를 추출합니다.캔틸레버가 제대로 보정되면 솔루션에서 AFM 스캐닝 헤드를 제거합니다. 장착된 캔틸레버를 순수 에탄올 몇 방울로 씻고 캔틸레버를 스캐닝 헤드에 건조하게 유지합니다. 살아있는 세포 환경 인클로저를 섭씨 37도로 예열하여 5%의 CO2로 예열합니다.이어서, DC2.4 셀로 시드된 유리 커버슬립을 샘플 챔버 어셈블리에 장착하고, 즉시 600마이크로리터의 중간 B를 챔버에 첨가한다. 완성된 어셈블리를 AFM 샘플 스테이지에 배치합니다. 인간 IL-2-인큐베이션CD4 양성 T 세포를 샘플 챔버에 추가합니다.표적 T 세포가 표지 슬립의 바닥에 완전히 정착 될 때까지 기다린 다음 현미경아래 시야로 세포를 가져옵니다. 이제 파이펫으로 장

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

배우세요 AFM 캔틸레버에 단일 T 세포를 기능화하여 수지상 세포-T 세포 상호작용을 실시간으로 탐구하는 방법. 생체적합성 접착제를 사용하여 면역 세포 활성화와 면역 시냅스 형성을 연구할 수 있습니다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

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