Name: 단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 AFM 캔틸레버에 단일 T 세포를 기능화하여 수지상 세포-T 세포 상호작용을 실시간으로 탐구하는 방법. 생체적합성 접착제를 사용하여 면역 세포 활성화와 면역 시냅스 형성을 연구할 수 있습니다.

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<ol><li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li>
<li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li>
<li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li>
<li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+probing+the+spatial+organization%2C+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li>
<li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro%3A+direct+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li>
<li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li>
<li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor%2FCD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li>
<li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li>
<li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent%2C+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li>
<li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li>
<li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li>
<li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li>
<li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li>
<li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li>
<li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li>
<li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+%28Fn%29+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li>
<li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li>
<li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li>
<li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li>
<li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li>
<li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

AFM 기반 단세포 힘 분광법은 살아있는 세포의 생물물리학적 특성을 해결하는 강력한 도구로 발전했습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우, 캔틸레버는 관심 있는 세포에 대한 특정 상호 작용 또는 특성을 조사하기 위해 제대로 기능화되어야 합니다. 여기서, 단일 T 세포와 단일 미크로넨 크기의 비드를 팁리스 캔틸레버에 결합하는 방법이 각각 기재되어 있다. 단일 T 세포를 캔틸레버에 부착하기 위해 생체 적합성 접착제를 세포 접착제로 선택했습니다. 해양 홍합에서 추출한 특수 한 단백질 용액입니다. 그것의 접착성은 하이드록실 그룹이 비특이적 인 방식으로 세포 표면에 노출 된 잔류물과 수소 결합을 형성 할 수있는 폴리 페놀 성 잔류물에서 비롯됩니다. 이 결합 방법은 일반적으로 결합 된 세포의 세포 기능을 방해하지 않습니다. 적절한 접착을 위해 부착할 세포의 조건도 중요합니다. 갓 정제된 마우스 CD4+T 세포의 경우, 캔틸레버 기능화에 사용되기 전에 인간 IL-2로 하룻밤 동안 먼저 처리해야 합니다. 그렇지 않으면, 그들은 오히려 빨리 세포 ...

원자력 현미경 검사법 (AFM), 다재 다능한 도구는세포 생물학 연구 1, 2,3,4,5에서많은 응용 프로그램을 발견했습니다. 고해상도 이미징 기능 외에도, 네이티브 포스 프로빙 기능은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 단일 세포 수준6,7에서현장에서 직접 조사 할 수 있게합니다. 이들은 세포내 세포 구조 또는 전체 세포 8,9,10,11,12,특정 리간드/수용체 결합 강도의 강성을 포함합니다. 세포 표면(13)에대한 단일 분자 수준, 고체 입자와 세포의 단일 쌍 또는 두 세포 사이 또는 1,2,14,15사이의 접착력. 후자의 두 가지는 종종 단세포 힘 분광법 (SCFS)16으로분류됩니다. 다양한 스프링 상수와 쉽게 사용할 수있는 캔틸레버로 인해 AFM에 액세스 할 수있는 힘 범위는 몇 피코 뉴턴 (pN)에서 마이크로 뉴턴 (μN)까지 다소 광범위하며, 이는 수십 개의 힘을 포함하는 세포 이벤트의 전체 범위를 적절하게 커버합니다. pN의, 예컨대 수용체 계 단일 분자 결합, nN, 예컨대 식세포이벤트(15). 이 큰 동적 힘 범위는 AFM을 광학/자기 핀셋 및 생체 막 힘 프로브와 같은 다른 힘 프로빙 기술에 비해 유리하게 만들며, 일반적으로 200 pN17 미만의 힘으로 약한 힘 측정에 더 적합합니다. , 18. 또한, AFM은 spatiotempoy 정의 된 방식으로 단일 세포에 다양한 자극을 전달하는 고정밀 조작기로서 기능 할 수있다4,19. 이는 실시간 단세포 활성화 연구에 바람직하다. 살아있는 세포 형광 화상 진찰과 결합된, 특정 자극에 대한 후속 세포 반응은 동시에 감시될 수 있습니다, 따라서 AFM 기지를 둔 SCFS는 세포 신호를 탐사하는 실용적인 공구를 제공하는 광학 화상 진찰로 대단히 견고하게 만듭니다. 예를 들면, AFM은 조골 세포20에있는 칼슘 과도를 이끌어 내는 것을 요구되는 긴장을 결정하기 위하여 이용되었습니다. 이 작품에서, 칼슘 과도는 AFM 팁으로 배양 된 조골 세포에 국한 된 힘을 적용 한 후 칼슘 비율 측정 이미징을 통해 형광으로 추적되었습니다. 최근, AFM은 간 성세포(HSC)가 성장한 콜라겐 섬유를 스트레칭하는 데 사용되었으며, 이러한 메카노-트랜스듀싱 HSC 활성화는 형광 Src 바이오센서에 의해 실시간 모니터링되었으며, 그 인산화는 바이오 센서의 형광 강도는 HSC 활성화3과상관관계가 있습니다.
AFM 기반 SCFS 실험에서 AFM 캔틸레버의 적절한 기능화는 성공적인 측정을 향한 핵심 단계입니다. 우리의 연구 관심은 면역 세포 활성화에 초점을 맞추고 있기 때문에, 우리는 일상적으로 식세포증 및 / 또는 강한 면역 반응을 유발할 수있는단일 고체 입자와 같은 미립자 물질로 캔틸레버를 기능화4,14 , 15 및 활성 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포로 면역 시냅스를형성할 수 있는 단일 T 세포 2. 단일 고체 입자는 일반적으로 공기 환경에서 에폭시 접착제를 통해 캔틸레버에 결합되는 반면, 단일 T 세포는 비 접착 성질로 인해 용액의 생체 적합성 접착제를 통해 캔틸레버로 기능화됩니다. 여기서는 이러한 두 가지 유형의 캔틸레버 수정을 수행하고 두 개의 관련 응용 프로그램을 제공하는 방법에 대해 설명합니다. 첫번째 응용은 세포 역학 관점에서 규정하는 T 세포의 억제 기계장치를 이해하기 위하여 AFM-SCFS를 가진 T 세포/DC 상호 작용을 탐구하는 것입니다. 두 번째는 수용체 독립적 인 포스 파티딜리노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2)의 분자 메커니즘을 밝히기 위해 실시간으로 고체 입자에 대한 대식세포의 세포 반응을 모니터링하기 위해 살아있는 세포 형광 이미징과 AFM을 결합하는 것을 포함합니다. 모에신은 식세포증을 매개했다. 이 프로토콜의 목적은 면역 학적 연구를위한 AFM 기반 단일 세포 분석을 통해 자신의 실험 설정을 설계하고 구현하기 위해 관심있는 연구자들이 참조 프레임 워크를 제공하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher</td><td>104-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>직경 6cm 배양 접시</td><td>NALGENE nunc</td><td>150462</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>JET</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>AFM 캔틸레버</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow-TL1-50</td><td>팁리스 캔틸레버</td></tr><tr><td>&베타;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>7604</td><td></td></tr><tr><td>생체 적합성 접착제</td><td>BD Cell-Tak</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T cell isolation Cocktail</td><td>STEMCELL</td><td>19852C.1</td><td></td></tr><tr><td>DC2.4 cell line</td><td>K. Rock(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)의 선물덱</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트란 코팅 자성 입자</td><td>STEMCELL</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GENEray</td><td>Generay-E1101-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>에폭시</td><td>ERGO</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>twbio</td><td>00019</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Ex Cell Bio</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단제</td><td>STEMCELL</td><td>18731</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>로컬 벤더(Hai Men Lian Sheng)</td><td>HX-E37</td><td>24mm 직경, 0.17mm 두께,</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>JinTong 실험실 및 장비 관리 부서, Haimen&nbsp;</td><td>N / A</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>H < 서브 > 2 < / 서브 > O< 서브 > 2 < / 서브 > (30 %)</td> <td>중국 제약</td><td>10011218</td><td></td></tr><tr><td>H < 서브 > 2 < / 서브 > SO < >4 < ></td> <td>80120892</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>시그마</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>자석</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>메쉬 나일론 스트레이너</td><td>BD 팔콘</td><td>REF 352350</td><td></td></tr><tr><td>Moesin-EGFP</td><td>N/A</td><td></td><td>실험실에서 복제됨</td></tr><tr><td>마우스 CD25 Treg 세포 양성 분리 키트</td><td>STEMCELL</td><td>18782</td><td>구성 요소: FcR 차단제, 조절 T 세포 양성 선택 칵테일, PE 선택 칵테일, Dextran RapidSpheres,</td></tr> <tr><td>마우스 CD4+ Tcell 분리 키트</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td>구성 요소: CD4+T 세포 분리 칵테일, 스트렙타비딘 RapidSpheres, 쥐 혈청</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Lanyi 화학 제품 유한 회사? 베이징</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1022-500</td><td></td></tr><tr><td>PE 선택 칵테일</td><td>STEMCELL</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>PLC&delta;-PH-mCherry</td><td>Addgene</td><td>36075</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로스피어 6.0&mu; </td><td>m Polysciences</td><td>07312-5</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>랫 세럼</td><td>STEMCELL</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>&nbsp; ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 인터루킨-2</td><td>Peprotech</td><td>Peprotech, 200-02-1000</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>조절 T 세포 양성 선택 칵테일</td><td>STEMCELL</td><td>18782C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>샘플 챔버</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 코팅 자성 입자</td><td>STEMCELL</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>형질주입 키트</td><td>클론텍</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25% EDTA</td><td>생명</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>JD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x objective NA 0.8</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901</td><td>Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>Atomic force microscope</td><td>JPK</td><td>cellHesion200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>형광 이미징</td><td>Zeiss 현미경 스탠드를 기반으로 한 집에서 만든 대물렌즈 형 전반사 형광 현미경</td> 가습 CO2 인큐베이터 Thermo Fisher HERACELL 150i 도립광 현미경 Zeiss Observer A1 설명서 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 t 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

원자력 현미경 검사법 기반 단일 세포 힘 분광법 (AFM-SCFS)은 살아있는 세포의 생물 물리학적 특성을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 세포, 수용체 및 리간드 사이, 그리고 많은 그밖 변이와 더불어 그(것)들을 포함하여 살아있는 세포막에 상호 작용 힘 그리고 역학을 탐구하는 것을 허용합니다. 그것은 또한 spatiotemporally 통제된 방식으로 단 하나 세포에 물리적 또는 생화확적인 자극을 전달하는 기계장치로 작동합니다, 따라서 살아있는 세포와 결합될 때 특정 세포 활성화 및 후속 세포 사건을 실시간으로 감시될 수 있게 합니다 형광 이미징. 이러한 AFM-SCFS 측정의 핵심 단계는 AFM-캔틸레버 기능화 또는 즉, 관심 있는 주제를 캔틸레버에 부착하는 것입니다. 여기에서, 우리는 면역학 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 단 하나 폴리스티렌 비드를 각각 가진 AFM 캔틸레버를 수정하는 방법을 제시합니다. 전자는 단일 T 세포를 용액의 평평한 캔틸레버 끝에 결합하는 생체 적합성 접착제를 포함하고, 후자는 공기 환경에서 단일 비드 접착을 위해 에폭시 접착제에 의존합니다. 각 캔틸레버 수정과 관련된 두 가지 면역 학적 응용 분야도 제공됩니다. 여기서 설명한 방법은 다양한 세포 유형 및 고체 입자에 쉽게 적응할 수 있습니다.

그림 4A는 단일 T 셀과 단일 DC 간의 결합 상호 작용으로부터의 일반적인 힘 거리 곡선을 하나의 접근-리트랙트 사이클에서 보여줍니다. 연한 빨간색 곡선은 확장 곡선이고 진한 빨간색 곡선은 후퇴 곡선입니다. 확장 곡선은 일반적으로 들여쓰기 또는 강성 분석에 사용되므로 여기서는 후퇴 곡선만 셀 접착에 대해 우려됩니다. 곡선의 최소값(녹색 원)은 최대 접착력을 측정합니다. 곡선 아래의 영역(그늘진 영역)은 T 셀을 DC로부터 분리하는 데 필요한 작업(에너지)을 나타냅니다. 완전한 분리 전에 날카롭고 단계별 파열 사건이 종종 관찰됩니다. 이것은 세포/세포 인터페이스에서 강한 결합으로 인해 세포 표면에서 멤브레인 테더가 당겨지고 연속 당김 하에서 개별적으로 파괴되는 것으로 해석됩니다. 상기 단계의 개수, 높이 및 길이는 세포막(21)의 기계적성질을 특성화하는데 사용될 수 있다. T...

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

이 프로토콜은 단일 T 셀및 고체 입자를 사용하여 AFM 캔틸레버를 작동하는 가장 좋은 방법을 설명합니다. 이러한 팁은 단일 쌍 수지상 세포-T 세포 상호 작용을 조사하고 각각 변덕스러운 크기의 세포 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 캔틸레버의 단일 T 세포 기능화를 위해 생체 적합성 접착제를 사용한다는 것입니다.이 접착제는 진핵 세포에 불활성, 따라서 그들의 기준선 활성화 단계에 T 세포를 유지. 이 방법은 면역 세포 활성화 및 면역 시 냅 스 형성 등 복잡 한 세포 간 이벤트에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 방법은 또한 세포 세포 또는 세포 표면 상호 작용을 관련시키는 그밖 시스템으로 확장될 수 있습니다.이 기술에 새로운 누군가를 위해, T 세포가 사용하기 전에 양호한 상태에 있고 하룻밤 IL-2로 전처리된다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 또한 생체 적합성 접착제를 사용할 때는 불필요한 산화로부터 보호하기 위해 신속하게 움직입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜을 따라 다음하여 현미경 검사법에 대한 단일 T 셀을 준비합니다.그런 다음 DC2.4 셀로 시드된 유리 커버립을 준비하고, 37°C와 5%CO2에서 가습 챔버에서 밤새 세포를 배양한다. 피라냐 처리, 플라즈마 청소 또는 UV 오존 청소를 사용하여 낮은 스프링 상수로 부드럽고 팁없는 캔틸레버를 청소하십시오. 그런 다음 청소된 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착합니다.다음으로 깨끗한 샘플 챔버를 준비하고 순수한 물로 채웁니다. 캔틸레버의 감도를 얻기 위해 먼저 유리 기판에 힘 곡선을 실행하여 물 용액에서 캔틸레버를 보정합니다. 그런 다음 열 잡음 스펙트럼을 기록하여 스프링 상수를 추출합니다.캔틸레버가 제대로 보정되면 솔루션에서 AFM 스캐닝 헤드를 제거합니다. 장착된 캔틸레버를 순수 에탄올 몇 방울로 씻고 캔틸레버를 스캐닝 헤드에 건조하게 유지합니다. 살아있는 세포 환경 인클로저를 섭씨 37도로 예열하여 5%의 CO2로 예열합니다.이어서, DC2.4 셀로 시드된 유리 커버슬립을 샘플 챔버 어셈블리에 장착하고, 즉시 600마이크로리터의 중간 B를 챔버에 첨가한다. 완성된 어셈블리를 AFM 샘플 스테이지에 배치합니다. 인간 IL-2-인큐베이션CD4 양성 T 세포를 샘플 챔버에 추가합니다.표적 T 세포가 표지 슬립의 바닥에 완전히 정착 될 때까지 기다린 다음 현미경아래 시야로 세포를 가져옵니다. 이제 파이펫으로 장착 된 캔틸레버의 끝에 생체 호환 접착제 2 마이크로 리터 드롭을 추가하십시오. 생체 적합성 접착제가 캔틸레버에 적용되면 접착력을 최대화하기 위해 가능한 한 빨리 후속 단계를 완료해야 합니다.스캐닝 헤드를 샘플 단계에 빠르게 배치하여 접착제 코팅 캔틸레버를 솔루션에 담급니다. 상태 T 셀이 캔틸레버 의 끝 아래에 위치할 때까지 샘플 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 스캐닝 헤드를 이동하여 위치를 미세하게 조정합니다.다음으로 캔틸레버를 수동으로 낮춥춥습니다. 50 미크론 스텝 크기로 시작한 다음 캔틸레버 이미지의 선명도에 의해 표시된 대로 10, 5 및 2로 감소하고 마침내 0.5 미크론을 점진적으로 감소시다. 이제 스테퍼 모터의 위치를 잡고 스캔 헤드의 위치를 조정하여 캔틸레버 팁과 셀을 더 잘 정렬합니다.0.5 ~ 1.5 나노 뉴턴의 전형적인 힘에 대응하는 레이저 위치의 작은 변위에 의해 확고한 접촉이 표시 될 때까지 계속하십시오. 접촉 30초 후 캔틸레버를 철회합니다. 셀이 캔틸레버로 이동하는 경우 첨부 파일이 성공했습니다.그렇지 않은 경우 새 캔틸레버로 전환하기 전에 접착 단계를 최대 3배까지 반복합니다. 샘플 단계와 스캐닝 헤드를 이동하여 부착된 T 셀을 DC2.4 셀 위에 배치합니다. 적절한 매개 변수를 설정한 후 샘플 위에 힘 분광법을 실행합니다.새로운 프로빙을 위해 새롭고 깨끗한 캔틸레버를 장착하십시오. 순수한 물에서 교정한 다음 T 세포 수지상 세포 쌍으로 돌아가 스캔을 반복합니다. 시료 챔버 어셈블리에 청소 유리 커버 슬립을 마운트합니다.커버슬립의 왼쪽에 에탄올에 희석되고 6미크로른 직경의 폴리스티렌 구슬이 들어 있는 비드 용액 한 방울을 추가합니다. 용매가 증발하면 20배 의 목표를 갖춘 밝은 필드 현미경을 사용하여 구슬의 간격을 확인하십시오. 개별 구슬이 잘 분리되어 있는지 확인합니다.그런 다음, 마이크로피펫 팁이나 이쑤시개를 잘 혼합된 에폭시 접착제에 담그고, 소량의 접착제를 오른쪽에 연속적인 부드러운 터치로 3개의 별도 반점으로 옮기지만, 표지슬립의 중앙에 가깝습니다. 다음으로, 깨끗하고 팁이 없는 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착하고 깨끗한 표면으로 공기 중으로 보정하여 스프링 상수를 얻습니다. 그런 다음, 마지막 에폭시 접착제 스팟의 왼쪽 경계 위에 캔틸레버 팁을 배치하고 스테퍼 모터의 작은 스텝 크기를 사용하여 캔틸레버를 접착제에 가깝게 천천히 놓습니다.접착제와 접촉하면 AFM 스캐닝 헤드를 뒤로 이동하여 캔틸레버를 측면으로 빠르게 당깁니다. 유리에 문지르면 여분의 접착제를 제거하고 끝 끝에 소량의 접착제만 남깁니다. 이제 캔틸레버 팁을 잘 분리된 비드 위에 넣습니다.단일 비드에 천천히 접근하여 약 10초 동안 2~5나노뉴턴 범위에서 단단히 접촉한다. 접촉하는 동안 미세 팁 조정을 사용하여 팁의 맨 끝에 비드를 배치합니다. 접촉 끝에 있는 팁을 철회합니다.구슬이 원래 초점 평면에서 사라지면 성공적인 접착 이벤트가 발생했습니다. 마지막으로, 비드 수정 캔틸레버를 조심스럽게 탈착하고, 에폭시가 완전히 치료할 수 있도록 하룻밤 동안 캔틸레버 상자에 보관합니다. 다음은 하나의 접근 방식-리트랙트 주기 동안 단일 T 셀과 단일 수지상 셀 간의 결합 상호 작용에서 얻은 일반적인 힘 거리 곡선입니다.밝은 빨간색 곡선은 연장 곡선이고 어두운 빨간색 곡선은 철회 곡선입니다. 곡선의 최소 값은 T 셀과 수지상 셀 사이의 최대 접착력을 측정하고 곡선 아래 영역은 이를 분리하는 데 필요한 작업을 나타냅니다. 날카롭고 단계적인 파열 이벤트는 세포-세포 계면에서 강한 결합으로 인해 세포 표면에서 막 밧줄이 꺼낸 다음 연속 당기는 하에서 이산적으로 깨는 것으로 해석될 수 있다.여기서, 종래의 T 세포결합은 수지상 세포에 대한 회색으로 나타내고, 수지상 세포에 결합하는 조절T 세포는 파란색으로 도시된다. 기존의 T 세포와 조절T 세포 사이의 접착력은 항원 제시 세포에 의해 제시된 펩티드 항원들을 인식하는 반면, 조절T 세포는 면역 반응의 끝으로 기존의 T 세포 매개 면역을 차단하는 억제제 T 세포이다. 형광 표지, phagocytic RAW264.7 세포의 이 회로도는 단일 벌거 벗은, 6 미크론 직경, 폴리스티렌 구슬로 접근하는 세포를 보여줍니다.구슬을 참여시막 PIP2는 b 근처의 접촉 부위에서 정렬되어 모에신의 막 모집을 유도하여 식세포 이벤트가 발생합니다. 여기에 설명된 절차 이외에, AFM 계 단일 세포 힘 분광법은 단일 세포 수준에서 실시간으로 면역 세포 활성화를 연구하기 위해 형광 영상과 함께 사용될 수 있다. 결합된 형광 기술, 이 방법은 수지상 세포와 T 세포 쌍 사이 면역 시냅스의 형성과 같은 더 복잡한 세포 프로세스를 실시간으로 해결하는 것을 허용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

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여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.

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단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

여기에서는 광열 오프-레조넌스 태핑(PORT)을 통한 생체 분자 상호 작용을 관찰하기 위한 이미징 프로토콜을 보여주며, 이미징 매개변수를 최적화하고, 시스템 한계를 식별하고, 이미징 3점-별 DNA 모티프 어셈블리의 잠재적 개선 사항을 조사했습니다.

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)

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단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

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