Name: 미세 주입에 의한 3D 조직 유래 인간 오르가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 배우세요 Cryptosporidium parvum 스포로조이트 정제 및 미세주입 기법을 활용한 3D 인간 장기 오르가노이드 감염 연구 방법을. 면역염색을 통한 감염 가시화 기술도 함께 익힐 수 있습니다.

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우리는 동물 및 비교 생물 의학 의학교, 농업 및 생명 과학 대학, 애리조나 대학, 투손, 애리조나, 미국, oocyst 생산 및 분석으로 우리를 도와 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 고립된 유기체 난소의 TEM 준비 그리고 화상 진찰을 위한 워싱턴 주립 대학에 프란체증 현미경 검사법 및 화상 진찰 센터 및 D.L. Mullendore 감사합니다.
D.D.는 네덜란드 과학 연구 기구(NWO-ALW, 016.Veni.171.015)로부터 VENI 보조금을 받는 사람입니다. I.H.는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO-ALW, 863.14.002)의 VENI 보조금 수혜자이며 유럽 위원회 (제안 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF)의 마리 퀴리 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 ERC 고급 보조금 협정 제 67013호에 따라 유럽 연구 위원회로부터 자금을 받았으며 R21 AT009174에서 RMO에 따라 NIH NIAIH로부터 자금을 받았습니다. 이 작품은 네덜란드 암 학회에 의해 부분적으로 자금을 조달하고 네덜란드 암 학회에서 보조금에 의해 지원된 Oncode 학회의 일부입니다.

<ol><li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+global+burden%2C+novel+diagnostics%2C+therapeutics%2C+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li>
<li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li>
<li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li>
<li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li>
<li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li>
<li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li>
<li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li>
<li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+infections%3A+molecular+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li>
<li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li>
<li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cpgp40%2F15+in+Toxoplasma+gondii%3A+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li>
<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

장 및 기도 오르가노이드에서 Cryptosporidium 기생충의 문화는 호스트 기생충 상호 작용을 연구하는 정확한 모형을 제공합니다10 그러나 또한 많은 그밖 응용이 있습니다. 예를 들어, 유전자 변형 Cryptosporidium 기생충을 선택하고 전파하는 현재의 방법은 생체 내 감염에 필수적인 수정이있는 기생충의 격리를 허용하지 않는 마우스19의 통과가 필요합니다. 크립토스포리듐의 오르가노이드 배양은 이 절차에 대한 대안을 제공합니다. 그러나, 우리는 전기 포자이트가 함께 뭉쳐마이크로파이펫을 막는다는 것을 주의했습니다. 유전자 변형 기생충을 선택하는 것을 목적으로, 오르가노이드는 형질감염된 포자화체에 감염을 허용하고 결과적으로 선택의 2 차원 조건에서 2 차원 형식으로 콜라겐 코팅 트랜스웰에 성장 할 수있다 유전자 변형 된 난모 낭종. 트랜스웰은 상피 및 바삭한 표면 모두에 접근할 수 있으며 ...

크립토스포리듐 감염의 치료 및 예방을 위한 약물 또는 백신의 개발은 인간1,2의생체내 상황을 정확하게 모방하는 체외 시스템의 부족에 의해 방해받고 있다. 현재 사용 가능한 시스템의 대부분은 단기 감염 (&5 일)을 허용하거나기생충3,4의전체 수명 주기를 지원하지 않습니다. 기생충의 완전한 발달을 가능하게 하는 그밖 시스템은 인간에 있는 생리적인 상황을 충실하게 되풀이하지 않는 불멸한 세포주 또는 암세포주에근거를 두어5,6,7 . 오르가노이드 또는 '미니 장기'는 다양한 조직 특정 성장 인자로 보충된 세포외 매트릭스에서 성장되는 3D 조직 유래 구조입니다. 오르가노이드는 다양한 장기와 조직에서 개발되었습니다. 그(것)들은 유전으로 안정되고 그들의 기원의 기관의 대부분의 기능을 되풀이하고, 시간의 연장된 기간 동안 문화에서 유지될 수 있습니다. 우리는 장 및 호흡기 크립토스포리디오증과 관련된 호스트 기생충 상호 작용의 연구를 위한 정확한 시험관 내 모델을 제공하는 Cryptosporidium으로 인간 장 및 폐 오르가노이드를 감염시키는 방법을 개발했습니다8 ,9,10,11,12,13. 다른 출판 된 문화 모델과는 달리, 오르가노이드 시스템은 실제 호스트 기생충 상호 작용을 대표하며, 기생충 수명 주기의 모든 단계를 연구 할 수 있도록 수명 주기를 완료 할 수 있으며 기생충 전파를 유지합니다. 최대 28 일10.
크립토스포리듐 방부는 호흡기와 장관의 상피를 감염시켜 장기간 설사 질환을 일으키는 양봉복합 기생충입니다. 내성 환경 단계는 오염된 음식과물(14)에서발견되는 난모낭이다. 일단 섭취되거나 흡입되면, 난모낭종은 상피 세포에 부착되는 4개의 포자형을 방출한다. 스포로조이스는 숙주 세포에 미끄러지고 숙주 세포 수용체를 교반하지만, 기생충은 세포를 완전히 침범하지 않으며, 숙주 세포가15를삼키도록 유도하는 것으로 보인다. 기생충, 세포 내 하지만 extracytoplasmic 구획 내에서 내면화, 세포의 꼭대기 표면에 남아, parasitophorous 백액 내에서 복제. 그것은 무성 생식의 두 라운드를 겪는다- 메로고니라는 과정. merogony 도중, 타입 I 메론은 새로운 세포를 침략하기 위하여 풀어 놓인 8개의 merozoites를 포함하는 개발합니다. 이 merozoites는 4개의 merozoites를 포함하는 타입 II 메론으로 발전하기 위하여 새로운 세포를 침략합니다. 이 merozoites, 풀어 놓일 때, 세포를 감염시키고 macrogamonts와 microgamonts로 발전합니다. 마이크로게임테스가 출시되어 난모낭으로 성숙하는 zygotes를 생산하는 매크로게임테스를 비옥하게 한다. 성숙한 난모낭은 이후에 내강으로 풀어 놓입니다. 난모세포는 후피를 재감염시키기 위해 즉시 방신하는 얇은 벽, 또는 다음숙주(14)를감염시키기 위해 환경으로 방출되는 두꺼운 벽중 하나이다. Cryptosporidium 수명 주기의 모든 단계는 이전에 우리의 그룹10에의해 개발 된 오르가노이드 배양 시스템에서 확인되었습니다.
인간 오르가노이드는 인간 조직을 충실하게 복제하기 때문에9,11,13, 및 Cryptosporidium10의모든 복제 단계를 지원하기 때문에 연구하기에 이상적인 조직 배양 시스템입니다. 크립토스포리듐 생물학 및 호스트 기생충 상호 작용. 여기에서 우리는 Cryptosporidium oocysts 및 황삭 한 포자화물 둘 다로 오르가노이드를 감염시키고, 이 조직 배양 시스템에서 생성된 새로운 oocysts를 격리하기 위한 절차를 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>기저막 추출물 (세포외 기질)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo 항체 (난포세포 특정 항체)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>최종 농도 = 2-3 드롭/슬라이드</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM 코팅 마그네틱 비드</td> 사용 <td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 15 랙</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 랙</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD 밀리포어&nbsp; Isopore 폴리카보네이트 멤브레인 필터- 3&micro; m</td><td>EMD-밀리포어</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>빠른 녹색 염료</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtojet 4i 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1 mm 직경의 유리 모세관</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마트리겔(세포외 기질)</td><td>코닝</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로퍼지 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러 P-97</td><td>셔터 기구</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>노멀 당나귀 세럼</td><td>바이오 라드</td><td>C06SB&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>펜스트렙</td><td>기브코</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 하이포 클로 라이트 (5 % 사용</td><td>) 클로 록스</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>슈퍼 스틱 슬라이드</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm 폴리카보네이트 필터 홀더</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>타우로콜산 나트륨 소금 수화물</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>머크</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vectashield 장착제</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>최종 양</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>500mL DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>500mL DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5mL DMEM</td></tr><tr><td>에 5mL 재고 INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (팽창 매체)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>최종 농도</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0.5 &micro; M</td></tr><tr><td>어드밴스+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>최대 100mL까지 만들기</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>집 안*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>P38 억제제 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &마이크로; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL 미디어</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>사내*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>사내*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>사내* - 요청 시 세포주가 제공됩니다</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (분화 매체)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>오가노이드를 구별하기 위해, 팽창하는 소장 오가노이드를 분열 후 6-7일 동안 Wnt가 풍부한 배지에서 성장시킨 다음, 분화 배지(Wnt, 니코틴아미드 SB202190 철회), 분화 배지(Wnt, 니코틴아미드, SB202190, 프로스타글란딘 E2를 Wnt가 풍부한 배지 또는 OME에서 추출)에서 성장</td></tr>시켰습니다<tr><td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (분화 배지)</strong</td><td>>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>최종 집중</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>최대 100mL까지 만들기</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>회사에 직접 문의</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>시그마</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &마이크로; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>직접 회사에 연락하십시오</td><td>10%</td></tr><tr><td>Reducing buffer (주사를 위한 난포낭과 sporozoite의 재현탁액을 위해)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>final 농도</td></tr><tr><td>L-Glutathione 감소된</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0.5 &mu; 지/&무; OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>베타인</td><td>시그마</td><td>61962</td><td>0.5 &mu의 L; 지/&무; OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마</td>의 L <td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu; 지/&무; OME / OMD / LOM</td></tr><tr><td>리놀레산</td><td>시그마</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &mu의 L; OME/OMD /LOM</td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마</td><td>T0625-10MG</td><td>0.5 &mu의 g/mL; 지/&무; OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Blocking buffer (면역형광 염색용)의 L</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>최종 농도</td></tr><tr><td>Donkey/Goat serum</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>70011044 Make up to 100</td></tr><tr><td>mL Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>List of Antibodies of Used </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Alexa 568 염소 안티 토끼</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>희석-1:500; RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo 종합 키트- 플루오레세인 표지 항체 Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>희석- 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS 비드- 단클론 항체 반응성</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>희석-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1</td><td>:1:1,000으로 코팅된 마그네틱 비드; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>희석-1:1,000; RRID:</td></tr><tr><td>R. M. O'에 의해 생성된 AB_2620155 Rabbit anti-gp15 항체 Connor (공동 저자).</td><td>요청 시</td><td></td><td>희석-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>희석- 1:200</td></tr></tbody></table>

미세 주입에 의한 3d 조직 유래 인간 오르가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

크립토스포리듐 파르블은 인간 설사 질환의 주요 원인 중 하나입니다. 기생충의 병리학을 이해하고 효율적인 약물을 개발하기 위해서는 숙주의 상태를 재량화하는 체외 문화 시스템이 필요합니다. 그들의 기원의 조직과 밀접하게 닮은 오르가노이드는 호스트 기생충 상호 작용을 연구하는 데 이상적입니다. 오르가노이드는 3차원(3D) 조직 유래 구조로, 성체 줄기세포에서 유래되고 유전적 수차 나 변형을 겪지 않고 장시간 배양에서 성장한다. 그들은 정점과 바소측 표면 모두극성을 잘 정의했다. Organoids는 약물 테스트, 바이오 뱅킹 및 질병 모델링 및 호스트 미생물 상호 작용 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 여기에서 우리는 인간 장 및 기도 오르가노이드를 감염시키기 위한 Cryptosporidium의 난모낭및 포자조를 준비하는 방법의 단계별 프로토콜을 제시합니다. 우리는 그 때 어떻게 microinjection가 오르가노이드 lumen로 미생물을 주입하기 위하여 이용될 수 있는지 설명합니다. 오가노이드가 호스트 미생물 상호 작용 연구에 사용될 수 있는 세 가지 주요 방법이 있습니다- 미세 주입, 기계 전단 및 도금, 그리고 단층을 만들어서. 미세 주사는 3D 구조의 유지 보수를 가능하게하고 기생충 볼륨의 정확한 제어 및 미생물에 대한 직접 정점 측면 접촉을 할 수 있습니다. 우리는 화상 진찰 또는 난모낭 생성을 위한 오르가노이드의 최적 성장을 위한 세부사항을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 또한 새로 생성된 oocysts가 추가 하류 처리 및 분석을 위해 오르가노이드에서 격리될 수 있는 방법을 보여줍니다.

여기에 제시된 프로토콜은 미세 주입을 위한 준비된 난모낭 및 포자화염(그림 1A)의효율적인 정제 귀착됩니다. excystation 프로토콜은 oocysts의 대략 70-80%에서 sporozoites의 방출 귀착됩니다, 그러므로 3 μm 필터를 통해 나머지 oocysts 및 껍질을 걸레질하는 것이 필수적입니다. 여과 결과 거의 100% 스포로 조이트 정제(그림 1B). 더욱이, 녹색 염료의 추가는 모든 오르가노이드의 주입을 보장하고 주입 된 오르가노이드의 시각화를 허용 적어도 24 주입 후 시간(그림 2B).
난모낭과 포자형의 준비를위한 이러한 프로토콜은 간단하고 수년 동안 사용되어 왔므로 치료 된 난모 낭종 및 정제 된 포자화물이 실행 가능하고 전염성이 있을 것으로 예상됩니다. 그러나, 우리의 연구 결과에서는, 우리는 ...

우리는 Cryptosporidium parvum에 의하여 인간 장 및 기도 오르가노이드의 감염을 공부하기 위한 난모낭을 준비하고 포자조를 정화하는 프로토콜을 기술합니다. 우리는 장 내 오르가노이드 루멘으로 기생충의 미세 주입 과 오르가노이드의 면역 염색을위한 절차를 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 오르가노이드에서 생성 된 난모낭의 격리를 설명합니다.

미세 주입에 의한 3D 조직 유래 인간 오르가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

이 산발성 정제 및 미세 주입 절차를 사용하여, 본질적으로 모든 호스트 미생물은 조직 유래 기관 시스템에서 공부할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 오르가노이드 루멘 또는 오르가노이드의 정압 측에 주입 된 순수 스포로조이트의 양을 제어 할 수 있습니다. C.parvum sporozoites를 정화하기 위해, 15 밀리리터 튜브로 난모세포를 옮기고 밀리리터 포비스테이션 중간 농도당 1회 10회에서 7번 의 전모세포로 세포를 재연한다.섭씨 37도에서 60~90분 후에 는 14밀리리터의 적절한 세척 용액을 나침반과 섞고, 세포를 원심분리에 의해 퇴적시한다. 수퍼중의 흡기를 조심스럽게 흡인하여 스포로조이즘 펠릿을 3회 10번에서 DMEM 농도의 1~2밀리리터당 7번 의 양모로 재보종한다. 남은 난소와 껍질을 제거하려면 섭씨 4도에서 15밀리리터 튜브에 3마이크로미터 모공 크기의 폴리카보네이트 필터가 장착된 47밀리리터 필터 홀더 장치가 장착된 10밀리리터 주사기 배럴을 장착합니다.필터 조립에 스포로조이트 서스펜션의 7.5 밀리리터를 추가합니다. 전체 부피가 중력에 의해 여과기를 통과하면, DMEM의 또 다른 7.5 밀리리터와 여과기를 통해 남은 세포를 씻어. 모든 세척이 여과 된 스포로주이트 현탁액을 원심분리로 10분 동안 수집하고 펠릿을 적절한 오르간구 배양 배지의 50~100마이크로리터로 라벨을 부착하고, 0.05%의 빠른 녹색 염료, L-글루타티온, 베타인, L-cysteine, L-cysteine, 리올레, 리놀레 산을 함유 및 함유 된 완충제.기생충을 3D 오르간노이드의 액면에 마이크로주입하려면 먼저 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 유리 주입 모세혈관을 준비합니다. 포셉을 사용하여 모세관의 끝을 9~12 마이크로미터 직경으로 잘라 내어 스포로조이트 또는 난모의 쉬운 흐름을 가능하게 하고, 나낭을 직접 주입하기로 선택한 경우 마이크로 로더 팁을 사용하여 각 모세관을 빠른 녹색 염료 라벨또는 스포로이트 현탁액으로 채웁니다. 그런 다음, 첫 번째 산포로조이트 채워진 모세혈관을 마이크로인젝터에 적재하고 5배 배율및 일정한 압력을 사용하여 각 유기체에 서스펜션의 100~200나노리터를 마이크로젝트한다.전이 프로토콜은 스포로조이트의 방출을 약 70~80%의 스푸사이클리스트로 이룬다. 따라서 3마이크로미터 여과를 통해 나머지 난모낭 껍질을 걸러내는 것이 필수적입니다. excysted 난모종의 거의 100 %를 제거합니다.더욱이, 녹색 염료를 첨가하면 모든 오르가노이드의 주입을 보장하고 주입된 오르가노이드를 주입한 후 24시간 이상 시각화할 수 있다. 이것은 잘 실행된 방법이더라도, 전자 현미경 검사법은 전염 과정이 스포로조이트 또는 난모를 손상시키지 않았는지 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 오르가노이드 루멘에 동일한 양의 난모낭을 주입하면 간단한 현미경 이미징으로 시각적으로 확인할 수 있습니다.면역 형광 분석은 또한 Cryptosporidium에 의해 감염되는 세포의 모형을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 분화 된 오르가노이드가 5 일 동안 감염된 후, 스포로조이트 내의 존재는 접착 슬라이드에 난모낭의 일부를 건조하고, 메탄올로 난낭을 고정하고, DAPI 염색을 적절한 스모시트 특이적 항체와 결합함으로써 확인할 수 있습니다. 최대 결과 위해, 신선한 난모를 사용 하 여, 모든 주사에 대 한 동일한 모세관을 사용 하 여, 주사 후 매일 미디어를 변경.이 기술을 사용하여, 각종 실험실은 지금 호스트 세균 상호 작용을 공부하기 위하여 오르가노이드를 사용하기 시작했습니다. 우리는 유사한 오르가노이드 미세 배양 환경에서 다른 병원균뿐만 아니라 교만뿐만 아니라 다른 병원균을 연구하고 있습니다. Cryptosporidium은 인간의 기생충이기 때문에 레벨 2 안전 규정에 따라 이러한 실험을 수행하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 병원성 기생충 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum)의 두꺼운 벽을 가진 난포낭에서 포자낭을 정제하는 시험관 내 방법을 보여줍니다. 분리된 포자충은 감염 연구에 사용할 수 있습니다.

Cryptosporidium parvum Oocysts로부터 체외 Sporozoite 분리

이 동영상은 인간 장 오가노이드 감염 모델을 개발하기 위한 미세 주입 기술을 보여줍니다. 기생충 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum)의 감염성 포자암(sporozoite) 단계는 오가노이드 내강(lung)에 미세주입됩니다. 오가노이드의 상피 세포에 침입하면 무성 생식과 유성 생식을 거쳐 생명 주기를 완료하고 감염을 퍼뜨립니다.

미세주입을 통해 장 오가노이드에서 기생충 감염을 일으키는 기술

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다   모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

줄기세포 유래 배양은 감염병을 모델링할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드에는 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 미세주입됩니다.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

인간 유도 만능 줄기 세포 (힙 Sc) 유래 장 소기관은 시험관 내 장 질환을 모델링할 수 있는 흥미로운 기회를 제공 합니다. 우리는 장내 유기 체 (iHOs)로의 분화를 입증 하 고, 이러한 iHOs를 사이토 킨과 함께 자극 하 고,이 호 루멘에 살 모 넬 라 티 피 뮤 리 움의 미세 주입을 가능 하 게 하 여 상피 침입에 대 한 연구를 가능케 합니다. 병원 체.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

배우세요 Cryptosporidium parvum 스포로조이트 정제 및 미세주입 기법을 활용한 3D 인간 장기 오르가노이드 감염 연구 방법을. 면역염색을 통한 감염 가시화 기술도 함께 익힐 수 있습니다.

미세 주입에 의한 3D 조직 유래 인간 오르가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구

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