Name: 박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 살아있는 박테리아 세포에서 RNA 결합 단백질의 결합 친화도를 정량화하는 방법을. 리포터 유전자 억제 분석을 통해 RBP-RNA 상호작용을 연구하고 세포 환경의 영향을 이해하세요.

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이 프로젝트는 기획 및 예산 위원회의 I-CORE 프로그램과 이스라엘 과학 재단 (그랜트 번호 152/11), 마리 퀴리 재통합 보조금 번호에서 자금을 받았다. PCIG11-GA- 2012-321675, 및 보조금 계약 번호 664918에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 - MRG-문법.

1. 시스템 준비
<ol><li>바인딩 사이트 플라스미드 설계
	<ol>
<li>그림1에 설명된 대로 바인딩 사이트 카세트를 디자인합니다. 각 미니유전자는 다음과 같은 부분(5' ~ 3')을 포함하며, Eagl 제한 부위, +40 기저의 카나마이신(Kan) 저항 유전자, pLac-Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), mCherry 유전자의 AUG, 스페이서(δ), RBP 결합 부위, 5' 말단의 80염기 mCherry 유전자, 및 ApaLI 제한 부위. 참고: 분석의 성공률을 높이기 위해 각 바인딩 부위에 대해 3개의 바인딩 사이트 카세트를 설계하고 스페이서가 적어도 1개, 2개 및 3개의 염기로 구성됩니다. 자세한 지침은 대표 결과 섹션을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>바인딩 사이트 플라스미드의 복제
	<ol>
<li>결합 부위 카세트를 이중 가닥 DNA(dsDNA) 미니유전자로 주문합니다. 각 미니유전자는 ~500 bp 길이이며, 각각 5' 및 3' 말단에 Eagl 제한 사이트 및 ApaLI 제한 사이트를 함유하고 있다(1.1.1단계 참조). 참고: 본 실험에서, 카나마이신 유전자의 절반을 가진 미니 유전자는 양성 콜로니에 대한 스크리닝을 용이하게 하기 위해 주문하였다. 그러나, 깁슨 어셈블리(17)는 또한 여기에 적합하며, 이 경우 결합 부위는 2개의 짧은 상보적인 단일 가닥 DNA 올리고스로서 주문될 수 있다.</li>
		<li>제한 프로토콜18에의해 Eagl-HF 및 ApaLI를 가진 미니 유전자 및 표적 벡터 둘 다 이중 소화하고, 컬럼 은19를정제한다.</li>
		<li>mCherry 리포터 유전자, 터미네이터 및 카나마이신 내성 유전자(20)의 나머지를 포함하는 결합 부위백본에 소화된 미니유전자를 리게이트.</li>
		<li>결찰 액을 대장균 TOP10세포(21)로변형시킨다.</li>
		<li>Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변압자를 식별합니다.<ol>
<li>관심 영역까지 상류에 프라이머(100) 염기를 설계합니다(프라이머 서열에 대한 표 1 참조).</li>
			<li>미니 프렙 몇 가지 세균 식민지22.</li>
			<li>프라이머의 5 mM 용액의 5 μL및 80 ng/μL 농도에서 DNA의 10 μL을 준비한다.</li>
			<li>Sanger 시퀀싱23을위한 편리한 시설로 두 가지 솔루션을 보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>정제된 플라스미드를 -20°C에서 저장하고, 글리세롤이24를스톡함에 따라 세균 균주를 96웰 형식으로 저장한다. DNA는 이어서 4개의 융합-RBP 플라스미드 중 하나를 함유하는 대장균 TOP10 세포로의 형질전환을 위해 사용될 것이다(단계 1.3.5 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>RBP 플라스미드의 설계 및 시공 참고: 본 연구에 사용된 외투 단백질의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 표2에 열거되어 있다.<ol>
<li>필요한 RBP 서열을 주문하여 정지 코돈이 결여된 정지 코돈이 단말에 제한 부위가있는 스톱 코돈이 결여된 맞춤형 dsDNA 미니유전자를 주문한다(도 1).</li>
		<li>시험된 RBP를 복제하여 유도성 프로모터의 바로 하류및 시작 코돈이 결여된 형광 단백질의 상류하류에 정지 코돈이 결여된 것을 복제(도1),단계 1.2.2-1.2.4와 유사. RBP 플라스미드가 결합 부위 플라스미드와는 다른 항생 저항 유전자를 포함하고 있는지 확인한다.</li>
		<li>Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변압자를 식별합니다(1.2.5단계와 유사).(프라이머 시퀀스의 경우 표 1 참조).</li>
		<li>하나의 긍정적 인 변형을 선택하고 화학적으로 유능한25합니다. -20°C에서 글리세롤 정제 플라스미드로 보관하고, 96웰 플레이트에서 -80°C에서 세균 균주24의 글리세롤 스톡을 저장한다.</li>
		<li>96웰 플레이트에 저장된 결합 부위 플라스미드(단계 1.2.6)를 이미 RBP-mCerulean 플라스미드(21)를함유하고 있는 화학적으로 유능한 세균 세포로 변형시킨다. 시간을 절약하기 위해 페트리 접시에 세포를 도금하는 대신 관련 항생제 (칸 및 Amp)가있는 루리아 베르타니 (LB)26 한천을 함유 한 8 채널 파이프터를 사용하여 접시에 담습니다. 식민지는 16 시간 안에 나타나야합니다.</li>
		<li>각 이중 형질전환제에 대한 단일 콜로니를 선택하고 관련 항생제(Kan and Amp)로 LB 배지에서 하룻밤 동안 성장시키고 96웰 플레이트에서 -80°C에서 글리세롤 스톡24로 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 실험 설정
참고: 여기에 제시된 프로토콜은 인큐베이터 및 플레이트 리더와 함께 액체 처리 로봇 시스템을 사용하여 수행하였다. 각 측정은 24개의 유도자 농도에 대해 수행되었고, 각 스트레인 + 유도기 조합에 대해 2개의 중복이 있었다. 이 로봇 시스템을 사용하여 하루에 16 개의 균주에 대한 데이터를 24 유도체 농도로 수집했습니다. 그러나 이러한 장치를 사용할 수 없거나 실험이 더 적은 경우 8채널 멀티 파이펫을 사용하여 프로토콜을 적절하게 조정하여 수작업으로 쉽게 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 12개의 유도자 농도와 4개의 시간 포인트를 가진 4개의 균주에 대한 예비 결과가 이런 식으로 획득되었다.
<ol><li>미리, 바이오분석완충제(BA) 1L의 트립톤 0.5 g, 글리세롤 0.3 mL, NaCl 5.8 g, 1 MMgSO4의50 mL, 10x 인산완충식염수(PBS) 완충액 pH 7.4, 및 950 mL의 이중 DW(diStillD)를 혼합하여 준비한다. BA 버퍼를 오토클레이브 또는 멸균 필터로 필터링합니다.</li>
	<li>적절한 항생제 (100 μg / mL의 최종 농도에서 25 μg / mL및 ampicillin의 최종 농도에서 카나마이신)와 함께 1.5 mL LB에서 37 °C 및 250 rpm에서 흔들리는 이중 형질전환 균주를 48 웰 플레이트에서 18 시간 (하룻밤)의 기간 동안 성장시킵니다.</li>
	<li>
아침에 다음 을 준비하십시오.
	<ol>
<li>유도판. 깨끗한 96웰 플레이트에서, 37°C에서 인큐베이터에서 95% BA 및 5% LB26으로 구성된 반불량 배지(SPM)로 우물을 준비한다. 웰의 수는 유도자 농도의 원하는 수에 해당합니다. 가장 높은 유도자 농도(218 nM)를 포함하는 유도판의 웰에 C4-HSL을 첨가한다.</li>
		<li>로봇을 0에서 218 nM에 이르는 23개의 낮은 농도로 각각의 고농도 우물에서 매질을 연속적으로 희석하도록 프로그래밍합니다. 각 유도기 희석의 부피는 모든 균주(중복 포함)에 충분해야 합니다.</li>
		<li>유도기 희석이 제조되는 동안, 96웰 플레이트에서 37°C에서 인큐베이터에서 SPM의 180 μL을 따뜻하게 한다.</li>
		<li>2.2 단계에서 하룻밤 균주를 연속 희석에 의해 100 의 요인으로 희석 : 먼저 48 웰 플레이트에서 SPM의 900 μL과 박테리아 100 μL을 혼합하여 10 의 요인으로 희석 한 다음 희석 된 용액에서 20 μL을 복용하여 다시 10 배로 희석하십시오. 형광 측정에 적합한 96웰 플레이트에서 180 μL의 사전 따뜻화 된 SPM.</li>
		<li>유도판으로부터 희석된 유도기를 최종 농도에 따라 희석된 균주를 가진 96웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 37°C에서 6시간 동안 96웰 플레이트를 흔들면서 30분마다 플레이트 리더를 통해 595 nm(OD595),mCherry(560 nm/612 nm) 및 mCerulean(460 nm/510 nm)에서 광학 밀도를 측정합니다. 정규화를 위해 셀이 첨가되지 않은 SMP의 성장을 측정합니다.</li>
</ol>3. 예비 결과 분석
<ol><li>실험의 각 일에 대해, 선형 성장 단계와 고정된(T 0, T최종)사이의 측정된성장 곡선에 따라 로그 성장의 시간 간격을 선택한다. 지수 성장 감지의 부정확성에서 파생된 오류를 방지하기 위해 첫 번째 및 마지막 측정값을 폐기하면서 약 6~8개의 시간 지점을 취합니다(그림 2A,상단 패널 참조). 참고: 비정상적인 성장 곡선 또는 로그 성장 단계를 감지할 수 없는 균주를 보여주는 균주를 버리고 실험을 반복합니다.</li>
	<li>
mCerulean의 평균 정규화 형광 및 mCherry의 생산 속도, 각 유도체 농도에 대한 mCerulean 및 mCherry 형광의 원시 데이터로부터 계산 (도2A).
	<ol>
<li>다음과 같이 정규화된 mCerulean을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> 여기서 블랭크(mCerulean)는 mCerulean 수준[a.u.]이 중간 값에만, 블랭크(OD)는 중간 값에만 광학 밀도이고, mCerulean 및 OD는 각각 mCerulean 형광 및 광학 밀도 값입니다.</li>
		<li>서로 다른 시간 포인트(그림2B,상위 2개 패널)에 대한 평균 mCerulean은 다음과 같습니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> #Time 포인트가 고려되는 데이터 타임포인트의 수인 경우 T0은 지수 증가 단계가 시작되는 시간이며 Tfinal은 지수 증가 단계가 끝나는 시간입니다.</li>
		<li>m체리 생산속도 계산(그림2B,하단 2개 패널) 다음과 같다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> 여기서 mCherry(t)는 시간 t에서 mCherry 수준[a.u.]이고, OD는 광학 밀도 값이고, T 0은 지수 성장 단계가 시작되는 시간이며, Tfinal은 지수 성장 단계가 끝나는 시간입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마지막으로, mCerulean의 함수로서 생산의 mCherry 비율을 플롯하고, RBP-mCerulean 융합 형광의 함수로서투여량 응답 곡선을 생성한다(도 2C). 이러한 플롯은 세포내 RBP 존재의 함수로서 리포터 유전자의 생산을 나타낸다.</li>
</ol>4. 복용량 응답 기능 피팅 루틴 및 KRBP 추출
<ol><li>RBP 바운드를 가진 번역의 리보솜 비율이 일정하다는 가정 하에, mCherry 생산 속도를 다음과 같이 모델링합니다(그림 2D, 녹색 선 참조). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> 여기서 [x]는 Eq. 2에 따라 계산된 정규화된 평균 mCerulean 형광이, mCherry 생산률은 Eq. 3에 따라 계산된 값이며, KRBP는 상대적 결합 친화성 [a.u.], K언바운드는 리보솜 비율이다. RBP 언바운드로 변환, n은 협력 계수이고, C는 기본 형광 [a.u.]입니다. C, n, K언바운드및 KRBP는 mCherry 생산 속도 데이터를 모델(Eq. 4)에 피팅하여 발견됩니다.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 mCherry 생산 속도를 평균 mCerulean(단계 3.3)의 함수로 묘사하는 플롯에 피팅 절차를 수행하고 Eq. 4의 수식에 따라 맞춤 매개변수를 추출합니다. 참고: R2 &gt; 0.6을 가진 피팅 결과만 고려됩니다. 이러한 적합의 경우, KRBP 오차는 주로 KRBP 값의 0.5%에서 20% 범위이며, 0.67 신뢰 구간의 경우 KRBP 오류가 높은 값도 눈으로 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>KRBP 값을 각 투여량-응답 함수에 대한 평균 mCerulean의 각각 최대 값으로 정규화합니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> 여기서 [a.u.]의 KRBP는 Eq. 4의 피팅 프로시저로부터 추출된 값이며, 최대(평균 mCerulean)는 현재 변형에 대해 관찰된 최대 평균 mCerulean 신호[a.u]이다. 참고: 정규화는 특정 최대 RBP 발현 수준에 대한 의존도를 제거하여 균주 전반에 걸친 조절 효과의 정확한 비교를 용이하게 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

본 항에 기술된 방법은 대장균 세포에서 RBP-RNA 결합 친화도의 생체 내 정량적 측정을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 비교적 쉽고 정교한 기계를 사용하지 않고도 수행될 수 있으며 데이터 분석은 간단합니다. 더욱이, 결과는 차세대 염기서열 분석(NGS) 결과와 관련된 비교적 긴 대기 시간 없이 즉시 생성된다.
이 방법의 한 가지 제한은 세균 세포에서만 작동한다는 것입니다. 그러나, 이전 연구12 포유류 세포에서 L7AE RBP에 대 한 유사한 접근을 사용 하 여 억압 효과 입증 했다. 이 방법의 추가적인 제한은 mCherry 개시 영역에서 결합 부위의 삽입이 기저 mCherry 레벨을 억압할 수 있다는 것입니다. 구조적 복잡성 또는 결합 부위의 높은 안정성은 RBP가 없는 경우에도 리보좀 개시를 방해할 수 있으며, 이로 인해 mCherry 기저 농도가 감소할 수 있다. 기저 수준이 너무 낮으면 RBP의 농도를 증가시킴으...

RNA 결합 단백질(RBP)-기반 전사 후 조절, 특히 RBPs와 RNA 사이의 상호작용의 특성화는 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 있다. RBPs 억제에서 유래 하는 박테리아에서 번역 다운 조절의 여러 예가 있다, 또는직접 경쟁, 리보솜 바인딩 1,2,3. 합성 생물학 분야에서, RBP-RNA 상호 작용은 전사 기반 유전 회로4,5의설계를위한 중요한 도구로 부상하고 있다. 따라서, 세포 문맥에서 이러한 RBP-RNA 상호작용의 특성화에 대한 수요가 증가하고 있다.
단백질 RNA 상호 작용을 연구하기 위한 가장 일반적인 방법은 시험관내 설정으로 제한되는 전기동이동성 시프트 분석법(EMSA)6,및 CLIP 방법8,9를 포함한 다양한 풀다운 분석7이다. . 이러한 방법은 de novo RNA 결합 부위의 발견을 가능하게 하는 동안, 그들은 노동 집약적인 프로토콜 및 비싼 깊은 시퀀싱 반응과 같은 결점 때문에 손해를 입고 RBP 풀다운을 위한 특정 항체를 요구할 수 있습니다. 그것의 환경에 RNA의 영향을 받기 쉬운 특성 때문에, 많은 요인은 세포 문맥에서 RBP-RNA 결합을 심문하는 의 중요성을 강조하는 RBP-RNA 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 우리 및 그 외는 생체내 RNA 구조와 체외10,11사이의 유의한 차이를 입증하였다.
이전 연구12의접근법에 기초하여, 우리는 최근에 박테리오파지 GA13,MS214,PP715및 Qβ16에서 캡시드 RBP에 대한 미리 설계된 결합 부위를 배치할 때 10을 입증했다. [mRNA] 기자의 번역 개시 부위, 리포터 표현이 강하게 억압된다. 우리는 이 억압 현상에 근거하여, RBP와 그들의 대응하는 RNA 결합부위의 생체 내 친화성을 측정하기 위해 비교적 간단하고 정량적인 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 플레이트</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>8-lane 플레이트</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더용 96-웰 플레이트</td><td>Perkin, Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>결합 부위 염기서열</td><td>Gen9, Inc. 및 Twist Bioscience</td><td></td>, <td>표 1</td></tr><tr><td>E. coli TOP10 cells</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 참조</td><td>TECAN</td><td>liconic 인큐베이터</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin solfate</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>액체 핸들링 로봇 시스템</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA 96채널</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 분석 소프트웨어</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi- pipette 8 레인</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td><td>cayman</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>PBS 완충액</td><td>Biological Industries</td><td>020235A</td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 핫스타트 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP seqeunces</td><td>Addgene</td><td>27121 & 40650</td><td>표 2 참조</td></tr>: <tr><td>염화나트륨(NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV 겔 및 PCR 세척 시스템</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

박테리아에서 단백질 rna 결합을 정량화하기위한 분석

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

단백질 번역의 개시 단계에서, 리보솜은 mRNA의 개시 부위에 결합한다. 번역 개시는 리보솜 결합을 방해하는 mRNA의 개시 지구에 RNA 결합 단백질 (RBP)의 결합에 의해 차단될 수 있습니다. 제시된 방법에서는, 우리는 그들의 동체 및 비 cognate 결합 사이트에 대한 RP의 결합 친화도를 정량화하기 위해 이 차단 현상을 이용한다. 이를 위해, 우리는 리포터 mRNA의 개시 부위에 시험 결합 부위를 삽입하고 시험 RBP의 발현을 유도한다. RBP-RNA 결합의 경우, 우리는 RBP 농도의 함수로서 리포터 발현의 시그노이드 억압을 관찰했다. 결합 부위와 RBP 사이의 친화성 또는 매우 낮은 친화력의 경우, 유의한 억압이 관찰되지 않았다. 이 방법은 살아있는 세균 세포에서 수행되며 비싸거나 정교한 기계가 필요하지 않습니다. 박테리아에서 기능하는 상이한 RP의 결합 친화도를 설계된 결합 부위세트에 정량화하고 비교하는 데 유용합니다. 이 방법은 구조적 복잡성이 높은 사이트를 바인딩하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이는 RBP가 없는 복잡한 mRNA 구조에 의한 리보좀 개시의 억제 가능성, 이는 낮은 기저 리포터 유전자 발현을 초래할 것이고, 따라서 RBP 결합에 대한 관찰력이 떨어지는 리포터 억압에 기인한다.

제시된 방법은 mRNA 분자에 결합하기 위한 RBP와 리보솜사이의 경쟁을 이용한다(도 1). 이 경쟁은 유도제의 농도 증가로 인해 RBP-mCerulean의 증가 생산의 함수로 mCherry 수준을 감소시킴으로써 반영됩니다. mCherry에 큰 변화가 없는 mCerulean 형광이 증가하는 경우, RBP 결합의 부족은 추론된다. 양수 및 음의 변형모두에 대한 대표적인 결과는 그림2에 도시되어 있습니다. 도 2A에서,OD, mCherry 및 mCerulean 채널은 T0 = 1 시간 및 T최종 = 3.5 시간의 범위에 걸쳐 시간 및 유도기의 함수로서 제시된다. 도2B에서, 평균 mCerulean 형광(top) 및 m체리 생...

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

생체 내 RNA에 결합하는 단백질의 특성화는 RNA의 복잡한 특성과 단백질과의 상호 작용에 영향을 미치는 많은 요인으로 인해 주요 과제로 남아 있습니다. RNA 결합 단백질 또는 RBP-RNA 친화성은 살아있는 세균 세포 내부에서 측정된다. 세포 환경은 RNA와 결과 RBP-RNA 결합의 구조 모두에 영향을 미치기 때문에 생체 내의 친화성을 측정하는 것은 자연 시스템에서 이러한 상호 작용을 이해하는 데 매우 중요합니다.성공의 비결은 플라스미드의 디자인입니다. 디자인은 델타의 여러 파도를 사용하고 정지 코돈과 프레임 시프트 돌연변이의 삽입을 피해야한다. 바인딩 사이트 카세트를 디자인하여 이 프로토콜을 시작합니다.각 미니 유전자에는 EagI 제한 부위, 카나마이신 저항 유전자의 5개의 프라임 엔드로부터 40개의 염기, pLac/Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위, 8월 mCherry 유전자, 스페이서, RBP 결합 부위, mCherry 유전자의 5개의 최종로부터 80개의 염기, 및 ApaLI 제한 부위가 포함되어 있다. 분석의 성공률을 높이기 위해 각 바인딩 부위에 대해 최소 1개, 2개 및 3개의 베이스로 구성된 스페이서에 대해 3개의 바인딩 사이트 카세트를 설계합니다. 다이제스트의 컬럼 정화를 수행하기 전에 EagI HF 및 아파리를 통해 미니 유전자와 표적 벡터를 모두 이중 소화한다.mCherry 리포터 유전자, 종기 및 가나마이신 저항 유전자의 나머지 부분을 포함하는 결합 부위 백본에 소화된 미니 유전자를 리게이트합니다. 그런 다음 결찰 용액을 대장균 상위 10개 세포로 변환합니다. Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변혁제를 식별한 후 96°C의 정제된 플라스미드를 영하 20도의 우물 형식으로 보관하십시오.또한 혈당 육로 주식으로 세균 균주를 저장 96 영하 80도에서 잘 형식. 사용자 정의 순서는 끝에 제한 사이트가있는 이중 좌초 DNA 미니 유전자로 정지 코돈이 부족한 필요한 RBP 서열을 한다. 준비된 플라스미드를 이미 RBP mCerulean 플라스미드를 함유한 화학적으로 유능한 세균 세포로 변환합니다.시간을 절약하기 위해, 관련 항생제와 Luria-Bertani 천을 포함하는 8 개의 레인 플레이트에 8 채널 파이프터를 사용하여 세포를 판화. 식민지는 섭씨 37도에서 16 시간 동안 나타나야합니다. 각 이중 변압제에 대한 단일 콜로니를 선택하고 적절한 항생제로 LB1.5 밀리리터를 포함하는 48 개의 웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.250 RPM에서 흔들리는 섭씨 37도에서 18 시간 동안 세포를 성장시면 됩니다. 글리세롤 주식으로 하룻밤을 저장 영하 80 도 96 잘 접시에 섭씨. 아침에는 로봇을 프로그래밍하여 96개의 웰 플레이트에서 반모공 배지 또는 SPM 의 180 마이크로리터를 따뜻하게 합니다.유도플레이트를 준비하도록 로봇을 프로그래밍한다. 깨끗한 96 웰 플레이트에서 95 %의 BA와 5 %의 LB로 구성된 SPM으로 우물을 준비하십시오. 우물의 수는 유도제 농도의 원하는 수에 해당한다.유도체 농도가 가장 높은 유도체 플레이트의 우물에 C4-HSL을 추가합니다. 다음으로, 로봇을 프로그래밍하여 각 고농도 우물에서 0에서 218 나노몰러까지 23개의 낮은 농도로 배지를 연속적으로 희석시 한다. 각 유도제 희석의 부피는 모든 균주에 충분해야 합니다.하룻밤 균주를 희석하기 위해 로봇을 48 웰 플레이트에 SPM 180 마이크로리터와 박테리아 20 마이크로리터를 혼합하여 10배의 배분으로 희석하도록 프로그래밍합니다. 그런 다음 희석된 용액에서 20마이크로리터를 형광 측정에 적합한 미리 준비된 균질 플레이트로 복용하여 10배의 계수로 다시 희석한다. 이제 로봇을 프로그래밍하여 최종 농도에 따라 희석된 균주와 함께 유도판으로부터 96웰 플레이트에 희석유도자를 첨가한다.6시간 동안 섭씨 37도에서 96개의 우물판을 흔들어 보냅니다. 이 기간 동안, 30분마다 플레이트 리더기를 통해 595 나노미터의 광학 밀도 또는 OD뿐만 아니라 mCherry 및 mCerulean 형광을 측정하십시오. 정규화를 위해 셀이 첨가되지 않은 SPM의 성장을 측정합니다.여기에 는 양수 변형에 대한 3차원 플롯이 표시됩니다. 플롯은 원시 OD 수준, mCerulean 형광 및 mCherry 형광을 시간 및 유도기 농도의 함수로 묘사합니다. mCerulean 정상 상태 발현 수준은 양수 및 음수 균주 모두에 대한 각 유도체 농도에 대해 계산되었다.mCherry 생산 속도는 또한 양수 및 음수 균주 모두에 대한 각 유도기 농도에 대해 계산되었다. mCherry 생산 속도는 두 개의 균주에 대한 두 개의 생물학적 중복을 통해 평균 평균 평균 mCerulean 형광의 함수로 플롯되었다. 피팅 공식을 사용하는 적합 KRBP는 특정 결합 반응을 나타내는 양성 균주에 대해 도시된다.음수 변형의 경우 KRBP 값이 추출되지 않았습니다. 정규화된 투여량 반응 곡선은 서로 다른 위치에서 10개의 결합 부위로서 2개의 RBP를 기반으로 30개의 다른 균주에 대해 결정되었다. 세 가지 유형의 응답이 관찰되고, 선호도가 높고, 선호도가 낮으며, 친화력이 없습니다.여기에 표시된 2개의 RBPs를 위한 정량적인 KRBP 결과, MS2 코트 단백질 및 10개의 상이한 결합 사이트 카세트를 가진 PP7 코트 단백질. 4개의 다른 위치에서 돌연변이 결합 부위를 가진 MS2 코트 단백질에 대한 투여량 반응 곡선은 mCherry 생산에 대한 돌연변이 간격의 효과를 보여주기 위해 여기에 도시된다. 테스트된 돌연변이 바인딩 사이트의 시퀀스가 표시됩니다.단백질-RNA 복합체의 구조를 화학적으로 조사하고 RNA 결합에 의해 영향을받는 mRNA 영역을 시각화하고자 하는 모양과 같은 구조 적 기술을 사용하는 것이 중요하다. 최근에는 이 기술을 높은 처리량 방식으로 사용하여 RBP의 선호도를 동시에 10, 000 바인딩 사이트로 측정했습니다.

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연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 세포 내 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 단백질의 체계적인 고처리량 스크리닝 기술인 리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 보여줍니다. 이 기술은 세포 용해물에서 과발현된 표적 단백질에 메신저를 직접 결합할 수 있게 하여 단백질 정제의 필요성을 우회할 수 있습니다.

리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용: 박테리아 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 세포 내 단백질을 식별하기 위한 고처리량 기술

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배우세요 살아있는 박테리아 세포에서 RNA 결합 단백질의 결합 친화도를 정량화하는 방법을. 리포터 유전자 억제 분석을 통해 RBP-RNA 상호작용을 연구하고 세포 환경의 영향을 이해하세요.

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