Name: 호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 질량 세포 분석을 위한 전체 골수 준비 방법으로 호중구 계보 세포의 무결성을 보존하고 희귀 면역 세포 집단을 식별하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 짧은 수명의 골수 세포 연구에 필수적입니다.

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우리는 대량 세포 분석 절차에 도움을 LJI 흐름 세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01HL134236, P01HL136275 및 R01CA202987 (모두 C.C.H) 및 ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. 및 Y.P.Z)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 라호야 알레르기 및 면역학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 라 호야 알레르기 및 면역학 연구소에서 설명 된 기준에 따라 획득되었습니다. 건강의 국가 학회에서 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드.
1. 수확 마우스 골수 (BM)
<ol><li>상업 공급 업체에서 C57BL /6J 마우스를 구입. 병원균이 없는 시설에서 마이크로이솔레이터 케이지에 표준 설치류 차우 식단과 집을 먹이라.</li>
	<li>실험 목적으로 생쥐 6-10주를 사용하십시오. CO2 흡입에 의해 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.</li>
	<li>마우스를 복부 쪽을 위로 올려 놓고 멸균 수술 패드에 놓습니다. 70 % 에탄올을 분사하여 복부와 뒷다리 부위의 피부를 살균하십시오. 복강을 열어 절단해 해부 수술 가위 한 쌍을 사용합니다.</li>
	<li>뒷다리를 노출하기 위해 피부를 제거합니다. 무딘 팁 드레싱 포셉을 사용하여 마우스 경골을 발목 바로 아래에 고정시됩니다. 또 다른 한 쌍의 커브드레싱 집게를 사용하여 무딘 팁 드레싱 집게 아래의 경골을 안정시보세요. 경골을 부수고 무딘 팁 드레싱 집게로 근육을 찢어 뼈를 노출하십시오. 참고: 경골은 무릎 관절에 느슨하게 부착되어 무딘 팁 드레싱 집게를 사용하여 쉽게 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>차가운 1x PBS에 경골을 놓습니다.</li>
	<li>다음으로, 안정화 된 곡선 드레싱 집게를 대퇴골으로 아래로 이동합니다. 무딘 팁 드레싱 집게를 무릎 관절 아래로 밀어 내고 슬개골을 잡습니다. 슬개골을 부드럽게 당겨 탈비합니다. 슬개골에 부착 된 근육을 찢어 서 대퇴골을 노출. 구부러진 드레싱 집게에 의해 노출 된 대퇴골을 잡고 해부 수술 가위를 사용하여 뼈바닥에서 대퇴골을 잘라냅니다.</li>
	<li>대퇴골을 차가운 1x PBS에 놓습니다.</li>
	<li>18G 바늘로 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>경골과 대퇴골을 동일한 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣고 뼈의 열린 끝이 구멍에 아래쪽을 향하도록 합니다.</li>
	<li>경골과 대퇴골을 모두 포함하는 0.5 mL 튜브를 1.7 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.</li>
	<li>경골과 대퇴골을 모두 포함하는 이중 층 튜브를 마이크로 원심 분리기에서 30 초 동안 5,510 x g에서 돌십시오.</li>
	<li>BM이 뼈에서 추출되어 튜브 바닥에 펠릿되었는지 확인합니다. 신성한 뼈를 포함하는 0.5 mL 튜브를 버팅합니다. 마우스 BM이 다음 단계에 대한 준비가 되었습니다. 참고: 인간 BM은 앞서 설명한바와같이 임상 자원에서 수확된다 11.</li>
</ol>2. CyTOF를 위한 얼룩 BM 세포
<ol><li>1 mL 1x 적혈구 (RBC) 매착 완충액에서 BM을 다시 중단하십시오. 인간 BM의 경우, 10x 적혈구 (RBC) 용해 완충액의 10 배 부피로 전체 BM을 다시 중단하십시오. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다. 인간 BM의 경우, 2.3단계로 진행하기 전에 2.1 단계 및 2.2단계를 반복한다.</li>
	<li>조심스럽게 상류를 흡인하고 펠렛을 중단없이 둡니다. 차가운 1x PBS 의 1 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 펠릿을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 15 mL 원엽 튜브로 필터링합니다. BM 세포는 지금 완전히 근육과 뼈 파편에서 관으로 격리됩니다. 튜브에 차가운 1x PBS 9 mL을 추가하여 세포를 씻습니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 15 mL 튜브를 회전시면됩니다.</li>
	<li>상월체를 조심스럽게 흡인하고 10 mL 콜드 PBS로 BM 세포를 다시 중단하십시오. 계산을 위한 셀의 별표를 가져 가라. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.</li>
	<li>Aliquot 5 x 106 BM 세포를 CyTOF 염색을 위한 새로운 15 mL 튜브로 넣습니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 15 mL 튜브 aliquot를 돌십시오.</li>
	<li>시료에 대한 생존 성 지표로서 1 mL의 CyTOF 염색 버퍼에서 125 nM 시스플라틴으로 상류를 조심스럽게 흡인하고 BM 세포를 다시 중단합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>배양 후, 튜브에 CyTOF 염색 완충제 4 mL를 추가합니다. 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다. 인간 BM의 경우, CyTOF 염색 완충액에 10% 인간 AB 세럼을 추가합니다.</li>
	<li>상월체를 조심스럽게 흡인하고 FC 수용체 차단 용액의 50 μL로 BM 세포를 다시 중단합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 인간 BM에 대한 이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>수제 CyTOF 항체 칵테일 50 μL을 샘플에 추가하여 총 염색 량이 100 μL이 되도록 합니다. 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 항체 칵테일의 최종 부피는 마우스 BM 및 인간 BM 샘플 모두에 대해 100 μL이다.</li>
	<li>세포를 세척하기 위해 인큐베이션 후 각 튜브에 CyTOF 염색 완충액 2 mL을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 돌십시오.</li>
	<li>총 2회 2회 를 반복하여 2.12단계를 반복합니다.</li>
	<li>16 % 스톡 앰벌에서 신선한 1.6 % 포름 알데히드 용액을 준비하십시오. 1x PBS의 9 부분으로 주식 포름알데히드의 1 부분을 희석.</li>
	<li>조심스럽게 상류를 흡인하고 1 mL 신선한 1.6 % FA 용액으로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. RT에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다.</li>
	<li>상월체를 조심스럽게 흡인하고 1 mL 픽스 /파마 버퍼에서 125 nM 간 칼레이션 솔루션으로 셀 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 인터칼레이션 용액으로 인큐베이션합니다.</li>
</ol>3. CyTOF 수집을 위한 세포 준비
<ol><li>4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 부드럽게 소용돌이 및 스핀 셀.</li>
	<li>CyTOF 염색 완충액 2 mL을 첨가하여 세포를 세척하고, 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 세포를 스핀하고 흡인에 의해 상수체를 제거한다.</li>
	<li>diH2O. 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하여 각 튜브에서 작은 부피(약 10 μL)를 예약하여 세포를 계산합니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 세포를 회전시다.</li>
	<li>3.3 단계와 3.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상류를 흡인하고 펠릿에 세포를 둡니다. BM 세포는 이제 CyTOF 수집을 위해 1 x 106 셀/mL의 농도로 재서스펜션할 준비가 되었습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
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<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

지난 수십 년 동안, 형광 계류 세포측정은 세포 혈통 및 이질성을 연구하는 주요방법으로 사용되었다 1,2,3. 유세포측정법이 다차원 데이터를 제공했지만 이 방법은 매개 변수 와 스펙트럼 중복의 선택에 의해 제한됩니다. 유세포 분석의 약점을 극복하기 위해 우리는 형광단 대신 중금속 동위원소를 사용하여 검출기 채널 또는 세포의 자가 형광 사이의 누화를 제거하는 항체에 라벨을 붙이는 CyTOF를 활용했습니다. 단일 세포 수준에서 동시에 더 많은 매개 변수를 생성하고 세포 다양성12의훨씬 더 깊은 평가를 생성합니다. 고갈 또는 게이팅 과정에서 과거에 생략된 세포 집단, 특히 호중구 계보 세포와 같은 중요한 면역 세포는 오랫동안 균질한 것으로 여겨졌던13,<sup cl...

지난 수십 년 동안, 세포 분석 방법은 BM의 조혈 시스템을 조사하는 강력한 도구되었습니다. 이러한 방법은 중금속 표지 항체를 사용하여 형광 활성화 유동 세포 분석 및 CyTOF의 새로운 방법을 포함한다. 그(것)들은 그들의 유일한 표면 마커 발현 단면도의 확인에 의하여 이기종 생물학 견본에 있는 많은 세포 모형의 발견으로 이끌어 냈습니다. 더 많은 채널과 관련된 스펙트럼 중복이 증가하면 형광 활성화 유동 세포 분석 애플리케이션에서 더 높은 데이터 부정확성이 발생합니다. 따라서, 불순한 세포는 형광 활성화 유동 세포 분석 분석을 위한 관심있는 세포 인구를 풍부하게 하기 위하여 일상적으로 제거됩니다. 예를 들어, Ly6G (또는 Gr-1) 및 CD11b는 성숙한 골수성 세포 마커로 간주되며 Ly6G+ (또는 Gr-1+) 및 CD11b+ 세포는 유세포 분석 전에 자기 농축 키트를 사용하여 BM 샘플에서 일상적으로 제거됩니다. 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 또는 하나의 덤프 칵테일 채널 1,2,3에이러한 마커를 결합하여. 또 다른 예는 호중구가 면역학 연구를 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 풍부하게 하기 위하여 인간적인 혈액 견본에서 일상적으로 제거된다는 것입니다. 마우스 또는 인간에서 격리된 전체 골수는, 그러나, 세포 측정 분석을 위해 손상되지 않는 조사되지 않습니다.
최근 CyTOF는 조혈 계 4,5,6을조사하는 혁신적인 도구가되었습니다. CyTOF를 사용하면 불소 표지 된 항체가 무거운 원소 리포터 표지 된 항체로 대체됩니다. 이 방법을 사용하면 스펙트럼 중복의 염려 없이 동시에 40개 이상의 마커를 측정할 수 있습니다. 사전 고갈 단계 또는 덤프 채널없이 그대로 생물학적 시편의 분석을 가능하게했다. 따라서, 우리는 기존의 2차원 유동 세포분석 플롯에서 고함량 치수성으로 조혈계를 종합적으로 볼 수 있습니다. 고갈 또는 게이팅 공정 동안 과거에 생략된 세포 집단은 이제 CyTOF4,5에의해 생성된 고차원 데이터로 빛을 가져올 수 있다. 우리는 동시에 골수성 보리 7에 초점을 맞춘 조혈 시스템에서 39 개의 매개 변수를측정하는 항체 패널을 설계했습니다. 기존의 유세포분석 데이터와 비교할 때 CyTOF에 의해 생성된 전례 없는 단세포 고차원 데이터의 해석과 시각화는 매우 까다롭습니다. 전산 과학자들은 고차원 데이터 세트의 시각화를 위한 차원 감소 기술을 개발했습니다. 이 문서에서는 T-분산 형 핵 종자 포함 (t-SNE) 기술을 사용하여 CyTOF 데이터를 분석하고 고차원 구조를 보존하면서 2 차원지도에 고차원 결과를 제시하는 알고리즘 viSNE을 사용했습니다. 데이터 8,9,10. tSNE 플롯에서 유사한 셀이 하위 집합으로 클러스터되고 색상이 셀의 특징을 강조 표시하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 도 1에 대해 골수성 세포는 CyTOF(도1)4로부터 유래된 33개의 표면 마커의발현 패턴의 유사성에 기초하여 여러 세포 서브세트로 분포된다. 여기에서 우리는 viSNE 분석 7에 의하여 우리의 이전에 보고된 39마커 CyTOF 패널을 가진 마우스 골수를 조사했습니다. 우리의 CyTOF 데이터의 viSNE 분석은 HSPC (CD117 ++) 및 호중구 (Ly6G+) 특성 을 모두 보여 준 미확인 세포 집단을 밝혀냈다 (도2)7.
결론적으로, 우리는 CyTOF 분석을 위한 신선한 전체 골수를 처리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서는, 우리는 예를 들면 마우스 골수를 이용했습니다, 이 프로토콜은 또한 인간적인 골수 견본을 가공하기 위하여 이용될 수 있는 동안. 인간 골수 견본에 특정한 세부 사항은 또한 프로토콜에서 또한 주의됩니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 골수에 대한 조사를 가능하게하기 위해 전체 골수에서 호중구 혈통 세포를 보존하도록 최적화 된 인큐베이션 시간 및 온도와 같은 세부 사항을 포함하고 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 형광 활성화 유동 세포 분석 응용 프로그램에 대해 용이하게 수정될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>CyTOF 항체 (mouse)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD115 (CSF-1R) (클론 AFS98)-정제</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD117/c-kit (클론 2B8)-166Er</td><td>플루이다임</td><td>Cat# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11a (클론 M17/4)-Purified</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11b (클론 M1/70)-148Nd</td><td>플루이다임</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11c (클론 N418)-142Nd</td><td>플루이다임</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD127 (IL-7R&alpha;) (클론 A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD150 (클론 TC1512F12.2)-167Er</td><td>플루이다임</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD16.2 (Fc&gamma; RIV) (클론 9E9)-정제된</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD162(클론 4RA10(RUO))-정제</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD169 (Siglec-1) (클론 3D6.112)-정제된</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD182 (CXCR2) (클론 SA044G4)-정제</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD183 (클론 CXCR3-173)-정제</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD335 (NKp46) (클론 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD34 (클론 MEC14.7)-정제된</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD41 (클론 MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD43 (클론 S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD48 (클론 HM48.1)-156Gd</td><td>플루이다임</td><td>Cat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD62L (클론 MEL-14)-MaxPar Ready</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD71 (클론 RI7217)-정제된</td><td>바이오레전</td>드 <td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD90 (클론 G7)-정제</td><td>바이오레전</td>드 <td>고양이# 105202; RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 F4/80 (클론 BM8)-159Tb</td><td>플루이다임</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 Fc&epsilon; 리&알파; (클론 MAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-정제</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 I-A/I-E (클론 M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Ki67 (클론 B56 (RUO))-Purified</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 Ly-6A/E (Sca-1) (클론 D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 Ly6B (클론 7/4)-정제된</td><td>abcam</td><td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6G(클론 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 NK1.1 (클론 PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>cat# 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Siglec-F (클론 E50-2440 (RUO))-정제</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 TCR&베타; (클론 H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>(클론 H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 TER-119/적혈구 세포(클론 TER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody Stabilizer</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC 용해 버퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / 전사 인자 염색 버퍼 세트</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ 네 가지 요소 보정 비드</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Omega Scientific</td><td>Cat# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate 완충 식염수 GE</td><td>Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR 항체 라벨링 키트</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>아지드화</td><td>나트륨시그마-알드리치</td><td>Cat# S2002</td><td></td></tr><tr><td>트리톤&nbsp; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>실험 모델: Organism/Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>재고 번호: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비드 기반 노멀라이저</td><td>Finck et al., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank</td><td>Cytobank</td><td>https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen et al., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten and Hinton, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

이 문서에서는, 우리는 전체 BM CyTOF 분석을 위한 신선한 BM에 있는 호중구 계보 세포를 보존하기 위하여 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 골수성 편향 된 39 항체 CyTOF 패널을 사용하여이 프로토콜을 사용하여 호중구 혈통 세포에 초점을 맞춘 조혈 시스템을 평가했습니다. CyTOF 결과는 오픈 리소스 차원 감소 알고리즘, viSNE로 분석되었고, 데이터는 이 프로토콜의 결과를 입증하기 위해 제시되었다. 우리는 이 프로토콜에 근거를 둔 새로운 호중구 혈통 세포 인구를 발견했습니다. 신선한 전체 BM 제제의 이 프로토콜은 1), 전체 BM에서 확인되지 않은 세포 집단을 발견하기 위해 CyTOF 분석을 위해 사용될 수 있습니다, 2), 백혈병과 같은 혈액 장애를 가진 환자를 위한 전체 BM 결점을 조사하는, 3), 의 최적화를 지원 신선한 전체 BM을 활용하는 형광 활성화 유동 세포 분석 프로토콜.

도 1은 CyTOF 실험으로부터의 예로 제시된다. 이러한 tSNE 플롯상에서 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33-파라미터 CyTOF 패널에 의해 측정된 그들의 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 서브세트로 군집되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 세포상에 33개의 마커의 발현에 기초하여 호중구, 대식세포, 또는 DC와 같은 함께 자동으로 클러스터되었다.
도 2는 본 연구에 제시된 프로토콜을 이용하여 마우스 BM CyTOF 실험에 대한 예로서 제시된다. 이 프로토콜은 전체 BM의 무결성을 보존하여 호중구(Ly6G +, 도 2A)및 HSPC(CD117+,도 2B)시그니처 표면 마커를 공동 발현하는 이전에 알려지지 않은 세포 집단의 발견으...

여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

이 질량 세포 측정 프로토콜은 전체 골수의 무결성을 보존하여 연구 된 세포의 분석을위한 기존의 샘플 준비 중에 손실 된 정보를 구출 할 수 있습니다. 이 빠르고 수월한 골수 격리 프로토콜은 희귀 호중구 계보 계보 서브셋과 같은 실행 가능한 단명 골수성 세포 집단의 획득을 용이하게합니다. 호중구 계보 세포와 같은 평가된 면역 세포에서 이전에 식별하기 위해 질량 세포 측정을 사용하면 다양한 질병에 대한 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.이 프로토콜은 골수에 존재하는 짧은 수명 골수세포의 무결성을 보존하고 고형 종양과 같은 다른 조직 유형에 쉽게 적용될 수 있다. 우리는 가능한 한 사용자 친화적 인 있도록 프로토콜로 단순화, 하지만 모든 생물학적 연구에서와 같이 그것은 관리하기 위해 몇 가지 연습 실행이 필요할 수 있습니다. 이 작업을 처음 수행 할 때 모든 시약을 먼저 준비한 다음 프로토콜을 엄격하게 따를 수 있습니다.문제가 발생하면 CyTOForum에 연결하고 문제 해결을 도울 수 있는 다른 CyTOF 사용자와 대화할 수 있습니다. 생물학적 샘플 준비를 위해 간단한 트릭은 최종 결과와 큰 차이를 만들 수 있습니다. 시각적 데모는 새 사용자가 프로토콜을 쉽게 파악할 수 있습니다.이 작업을 처음 수행하는 경우 시약을 먼저 준비한 다음 프로토콜을 엄격히 따를 수 있습니다. 골수 수확의 경우, 멸균 수술 패드에 수핀 위치에 6-10 주 된 C57 블랙 6 마우스를 놓고 70 %에탄올을 사용하여 복부와 뒷다리를 살균하십시오. 해부 수술 가위 한 켤레를 사용하여 복강을 열고 피부를 제거하여 뒷다리를 노출시하십시오.무딘 팁 드레싱 포셉 을 사용하여, 발목 바로 아래 마우스 경골을 잡고 무딘 팁 드레싱 집게 아래 경골을 안정화곡선 드레싱 집게의 쌍을 사용합니다. 무딘 팁 드레싱 집게를 사용하여 경골을 부러뜨리고 근육을 제거하여 뼈를 노출시하십시오. 차가운 PBS에 경골을 넣기 전에 안정화 곡선 드레싱 집게를 대퇴골에 옮기고 무릎 관절 아래에 무딘 팁 드레싱 포셉을 밀어 무릎을 꿇습니다.슬개골을 부드럽게 당기고 슬개골에서 근육을 제거하여 대퇴골을 노출시합니다. 구부러진 드레싱 집게에 의해 노출 된 대퇴골을 잡고 수술 가위를 사용하여 뼈 바닥에서 대퇴골을 자른다. 그런 다음 대퇴골을 PBS에 배치합니다.다음으로, 18 게이지 바늘을 사용하여 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 구멍을 뚫고 두 뼈를 구멍으로 아래쪽으로 향하는 열린 끝과 함께 튜브에 두 뼈를 배치합니다. 0.5 밀리리터 튜브를 1.7 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 이중 층 튜브를 마이크로 원심분리기에서 회전시합니다. 원심 분리의 끝에서, 골수가 관의 바닥에 추출되었는지 확인합니다.대량 세포측정을 위해 골수 세포를 염색하기 위해 실온에서 10 분 동안 적혈구 용해 버퍼의 1 밀리리터에서 골수를 다시 중단하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 감기 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 70 마이크로미터 여과기를 통해 15밀리리터 원추형 튜브로 세포를 걸러내고 9밀리리터의 신선하고 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오.다시 계산하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 여섯 번째 세포 알리쿼트에 다섯 번 10을 전송하기위한 신선한, 차가운 PBS의 10 밀리리터에서 골수 세포 펠릿을 일시 중단합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 125 나노 몰라 시스플라틴으로 보충 질량 세포피떨림 염색 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 실온에서 5 분 후, 신선한 질량 세포 분석 버퍼의 네 밀리리터에 세포를 씻어.FC 수용체 차단 용액의 50 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 섭씨 4도에서 10분 후, 50마이크로리터의 항체 칵테일을 세포에 넣고 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요. 다른 잠복기 단계의 온도는 골수 세포의 생존가능성을 보존하는 데 매우 중요합니다.섭씨 4도에서 30분 후, 세척당 신선한 질량 세포측정 버퍼 2밀리리터로 세포를 2회 세척한 후 실온에서 15분 동안 1밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 4섭씨에서 하룻밤 배양을 위한 125 나노몰러 상호 작용 용액으로 보충된 고정 파마 버퍼의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 질량 세포측정에 의해 세포를 분석하기 전에, 신선한 질량 세포피성 염색 버퍼의 2밀리리터에서 세포를 세척하기 전에 세포를 부드럽게 소용돌이 및 원심분리.다음으로, 세척당 증류수 1밀리리터로 세포를 2회 세척하고, 질량 세포 분석 분석을 위해 질량 세포분석 버퍼 농도의 밀리리터당 10~6세포에서 세포를 다시 중단하기 전에 두 번째 세척 후 상체를 조심스럽게 흡입한다. 이 T 분산 스토샤스 인접 포함 플롯에서, 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33 파라미터 질량 세포측정패널에 의해 측정된 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 하위 집합으로 클러스터되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 셀에 있는 이 마커의 발현에 근거하여 자동으로 함께 클러스터되었습니다.이 방법을 사용하여, 전체 골수의 무결성이 보존되어 호중구 및 조혈 줄기 및 전구 세포 서명 표면 마커를 동시에 동시 표현하는 이전에 알려지지 않은 세포 집단의 발견으로 이어졌습니다. 이전에 골수성 전구 연구에서 생략되었던 이 세포 인구는 Ly6G 양성 세포 고갈로 인해 표면 마커 발현의 뚜렷한 패턴을 나타낸다. 더 중요한 것은, 이들 데이터는 Ly6G를 발현하지 않는 Ly6G 양성 세포 클러스터의 작은 하위 집합의 발견으로 이어졌지만, CD117 양성 Ly6G 양성 세포에 밀접하게 군집되어, 이 질량 세포 실험에 사용되는 33개의 표면 마커의 발현에 기초하여 호중구 계보와 이들 세포의 유사성을 시사한다.13색 플로레시엔스 활성화 셀 선별 패널을 구축하여 다운스트림 기능 분석용 세포측정을 통해 호중구 선조의 분리를 가능하게 한다. 가능한 한 빨리 골수 격리 절차를 수행하고 염색 절차 동안 섭씨 4도에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 백혈병과 같은 혈액 질환이 있는 환자의 전체 BM 결함을 조사하기 위해 마우스의 뒷다리에서 신선한 전체 골수를 분리하는 자세한 프로토콜을 설명합니다.

쥐 뒷다리에서 채취한 골수

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

MDS 진단 기준 형태학 또는 비 유익한 세포 유전학의 부재에 어렵습니다. MFC는 MDS 진단 과정을 구체화 도움이 될. 임상 연습에 유용 될, MFC 분석 기반으로 해야 합니다 매개 변수 충분 한 특이성 및 감도, 그리고 데이터 다른 연산자 사이 재현 되어야 합니다.

데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

single-cell/single-nuclei transcriptomics 및 multi-omics의 성공은 세포/핵의 품질에 크게 좌우됩니다. 따라서 조직에서 세포/핵을 분리하고 정제하는 것은 고도로 표준화되어야 합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 단일 핵 다중체 분석을 위해 뇌와 골수에서 핵을 준비하는 방법을 설명합니다.

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

이 원고는 최적의 호중구 생존력과 높은 라이브러리 품질을 보장하는 것을 목표로 쥐 골수에서 호중구의 ATAC-seq 라이브러리를 준비하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. BMC 준비, 면역자기 분류 및 라이브러리 구축에 대한 단계별 지침을 제공하여 특히 호중구 연구를 처음 접하는 사람들에게 유용한 가이드 역할을 합니다.

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils(쥐 골수 유래 호중구의 ATAC-Seq 라이브러리 준비)

배우세요 질량 세포 분석을 위한 전체 골수 준비 방법으로 호중구 계보 세포의 무결성을 보존하고 희귀 면역 세포 집단을 식별하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 짧은 수명의 골수 세포 연구에 필수적입니다.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

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