Name: 생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 생체 내피 세포에서 리보솜 결합 mRNA를 정제하는 TRAP 방법을 이용한 혈관생성 연구 기법입니다. EGFP 태깅을 활용하여 마우스 뇌, 폐, 심장 조직의 전사체 분석이 가능합니다.

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렌 박사의 작품은 미국 심장 협회 (13SDG14800019)에 의해 지원됩니다. BR), 앤스 호프 재단 (FP00011709; BR), 미국 암 학회 (86-004-26; MCW 암 센터 BR), 그리고 건강의 국립 연구소 (HL136423; BR); 조던 파머는 2018 MCW CTSI 500 스타 인턴십 프로그램에 의해 지원됩니다. P. 모란은 NHLBI (5T35 HL072483-34)의 기관 연구 교육 보조금에 의해 지원됩니다.

동물 실험을 위해, 여기에 기술된 모든 방법은 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>용해 완충액을 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2,0.5 mM DTT, 100 mg/mL 사이클로헤오히미드, 프로테아제 억제제 및 재조합 RNase 억제제의 농도로 준비한다.<ol>
<li>다음 시약을 RNase 없는 탈이온수 500 mL에 추가: HEPES 1.19 g, 5.59 g의 KCl, MgCl2,DTT 35 mg, 사이클록색시미드 0.5 mL, NaOH 는 pH 7.4까지 필요, EDTA 무프로테아제 억제제(10mL당 1개의 미니 정제) 및 RNase 억제제(1개 0 μL/mL).</li>
		<li>4°C 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mM HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl 2,1 % vol / vol CA-630, 0.5 mM DTT 및 100 mg / mL 사이클로헴 세척 완충제를 준비하십시오.<ol>
<li>RNase-free 탈이온수 의 500 mL에 다음 시약을 추가: HEPES의 1.19 g, KCl의 13.05 g, MgCl의 0.24g, 5 nonionic의 5 mL, 비 치성 세제, 5 의 7.7 DTT의 mg 튜브, 그리고 0.5 cyclohexie의 0.5 mL까지.</li>
		<li>4°C 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 항 GFP 항체를 단백질 G 자기 구슬에 결합합니다.<ol>
<li>단백질 G 구슬에 PBS 200 mL에 희석 된 항 GFP 항체 10 mg을 추가하십시오.</li>
		<li>실온에서 10 분 동안 끝 끝 회전으로 인큐베이팅하십시오.</li>
		<li>비드를 마그네틱 랙에 놓고 상급을 제거합니다.</li>
		<li>200 mL의 PBS에 구슬을 일시 중단하고 최대 1 주 동안 4 ° C 냉장고에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mg/mL 사이클로헵시미드로 차가운 PBS를 준비하세요.<ol>
<li>99개의 얼음 차가운 PBS에 1부의 사이클로착시미드 용액(100 mg/mL)을 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 원하는 조직을 분리하고 라이즈합니다.
<ol><li>케타민 (500 mg / kg / 체중)과 자일라진 (10 mg / kg / 체중)의 IP 주입으로 마우스를 안락사시키고 원하는 조직 (즉, 심장, 폐)을 분리하십시오. 즉시 다음 단계로 진행합니다.</li>
	<li>원하는 조직을 100 mg/mL 사이클로헵시미드와 함께 얼음으로 차가운 PBS 500 mL에 넣습니다.</li>
	<li>모터 구동 균질화 또는 작은 클리어런스 유리 균질화로 세포 현탁액으로 조직을 다진. 모터 구동 균질화를 사용하는 경우, RNA 변성 방지를 위해 저주파수(<15,000 Hz)에서 균질화를 1분 미만으로 제한하십시오.</li>
	<li>파이펫팅하고 버퍼를 여러 번 다시 그려 서 200 mL의 lysis 버퍼에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 또한 스몰 클리어런스 유리 균질화로 10스트로크 또는 모터 구동 균질화기에서 저주파(&15,000Hz)에서 15초 동안 셀 서스펜션을 균질화합니다.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 2,000 x g에서 10분 동안 균질화하여 펠릿 핵 및 큰 세포 파편을 하고, 상류를 유지한다.</li>
	<li>1% vol/vol 및 DHPC에 1% vol/vol및 DHPC에 30 mM에 비변성, 비변성 세제를 상급에 추가합니다. 얼음에 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>원심분리기는 펠릿 불용성 물질에 16,000 x g에서 10 분 동안 용해됩니다. 향후 단계에 대한 입력으로 명확한 용해의 15 %를 전송하고 유지합니다.</li>
</ol>3. 리보솜/mRNA 복합체 분리
<ol><li>50 mL의 항체 결합 구슬을 세포 용해 상류에 넣고 4 °C에서 혼합물을 배양하고 30 분 동안 끝 부분 회전을 합니다. 이것은 반대로 GFP 항체가 GFP 태그된 리보솜을 묶을 것입니다, 우리가 이 리보솜에서 RNA를 더 격리하는 것을 허용하는 곳에 입니다.</li>
	<li>마그네틱 랙에 구슬을 모으고 고염 폴리섬 세척 버퍼로 5회 세척하십시오.<ol>
<li>구슬이 튜브 의 측면에 수집되면 액체를 그려 폐기합니다. 그런 다음 파이펫을 다시 그리고 200 mL의 고염 폴리섬 세척 버퍼를 여러 번 다시 그립니다. 이 단계를 5번 반복하고 마지막 반복 후 모든 버퍼를 모두 버립니다. 즉시 다음 단계로 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mRNA 분리
<ol><li>RLT 버퍼에 구슬을 배치합니다. 다음 단계는 RNeasy 미니 키트 프로토콜에서 직접 수행되며 어떤 방식으로든 확장되지 않았습니다. 주의: RLT 버퍼에는 구아니딘 염이 포함되어 있습니다. 표백제와 섞지 마십시오.</li>
	<li>원심분리기는 최고 속도 13,000 rpm 또는 4 °C에서 16,000 g에서 3 분 동안 용해됩니다. 파이펫팅을 하여 350 mL의 상류를 조심스럽게 제거하고 새로운 마이크로 퍼지 튜브로 옮김을 옮김. 후속 단계에서이 상급 (용해)만 사용하십시오.</li>
	<li>마이크로 퍼지 튜브에 70% 에탄올의 동일한 부피를 추가합니다.</li>
	<li>형성되었을 수 있는 침전을 포함하여 샘플의 최대 700 mL을 2 mL 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 이송합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15초 동안 15초 동안 15초 동안 1,000 x g의 원심분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 세척합니다. 흐름을 취소합니다.</li>
	<li>스핀 열에 350mL의 버퍼 RW1을 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15초 동안 15초 동안 15초 동안 1,000 x g의 원심분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 세척합니다. 흐름 스루를 버리고 다음 단계에서 수집 튜브를 다시 사용합니다. 주의: 버퍼 RW1에는 구아니딘 염이 포함되어 있습니다. 표백제와 섞지 마십시오.</li>
	<li>스핀 열에 350mL의 버퍼 RW1을 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 ≥8,000 x g에서 15초 동안 원심분리기를 닫습니다. 흐름을 취소합니다.</li>
	<li>스핀 열에 버퍼 RPE 500mL를 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15초 동안 15초 동안 15초 동안 1,000 x g의 원심분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 세척합니다. 흐름을 취소합니다.</li>
	<li>스핀 열에 버퍼 RPE 500mL를 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 ≥8,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 씻으십시오. 그런 다음 수집 튜브에서 스핀 컬럼을 조심스럽게 제거하여 컬럼이 흐름 통과에 접촉하지 않도록합니다.</li>
	<li>스핀 컬럼을 새 2mL 컬렉션 튜브에 놓고 흐름 통과가 있는 이전 튜브를 폐기합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 원심분리기를 최고 속도로 1분간 닫아 잔류 완충장치를 제거합니다.</li>
	<li>스핀 컬럼을 새 1.5mL 컬렉션 튜브에 배치합니다. 30-50 mL의 RNase-free 물을 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 RNA를 용해시키기 위해 ≥8,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 하십시오.</li>
	<li>예상 RNA 수율이 >30 mg인 경우, RNase가 없는 다른 30-50 mL의 물과 함께 4.10 단계를 반복하거나 4.10 단계 (높은 [RNA]가 필요한 경우)에서 용적물을 사용하십시오. 4.10 단계에서 수집 튜브를 재사용하십시오.</li>
	<li>RNA 시퀀싱 또는 실시간 정량적 PCR을 포함한 다운스트림 분석을 위해 정제된 RNA를 사용하거나RNase-free H2 O에 용해된 RNA를 최대 1년간 -80°C에서 저장합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%2FPKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2FPKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosclerosis+Thrombosis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li>
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<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond%3A+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li>
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<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA%2FPKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li>
<li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

혈관신생은 복잡한 다단계 과정으로, EC 특이적 혈관신생 유전자 전사 및 발현이 EC 분화 및 혈관신생 재프로그래밍에 필수적인 역할을 하는3,4. 생체 내 분자 수준에서 포유류 혈관 시스템의 기능을 더 잘 이해하기 위한 세포 다양성 및 건축 적 복잡성의 장벽을 극복하기 위해 EC 특이적 CD36과 함께 EC 특이적 TRAP 마우스를 만들었습니다. , EC 특이적 pkd-1 결핍 또는 글로벌 cd36 결핍은 다른 유전자 조작 마우스 라인과 조합하여 Pu 실험실2에서 생성된 다용도 플록스 TRAP 마우스 모델 또는 EGFP-TRAP을 사용하여 결핍을 한다. 이것은 cd36 유전자 발현8에 있는 EC 특정 또는 글로벌 결핍에 의하여 생체 내 온전한 조직에서 혈관 EC의 전체 번역된 mRNA 보체의 검사를 ...

포유류 뇌, 심장 및 폐와 같은 복잡한 조직에서는 높은 수준의 세포 이질성이 전체 조직 샘플에서 파생된 유전자 발현 데이터의 분석을 복잡하게 만듭니다. 생체 내에서 특정 세포 유형에서 유전자 발현 프로파일을 관찰하기 위해, 새로운 방법론이 최근에 개발되었으며, 이는 임의의 유전자 정의 세포 유형의 전체 번역 된 mRNA 보체의 심문을 허용한다. 이 방법론은 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술1,2. 그것은 동물에 있는 그밖 혈관신생 관련 유전자를 유전으로 조작과 결합될 때 내피 세포 생물학 및 혈관 신생을 공부하는 유용한 공구입니다.
혈관신생 PKD-1 신호및 혈관신생 유전자 CD36의 전사가 내피세포(EC) 분화 및 기능성 혈관신생3,4,5,6에중요하다는 것을 보여주었다. 유전자 전사 및 EC 분화에서 혈관 신생 및 대사 신호의 분자 메커니즘을 결정하기 위해 TRAP 기술 1을 기반으로 특별히 삭제 된 혈관 신생 유전자를 사용하여 유전자 조작 TRAP 마우스를 만들었습니다1 , 2. 또한, 우리의 TRAP 동물에서, 뿐만 아니라 그들은 혈관 내피 또는 cd36 유전자의 글로벌 삭제에 pkd-1 또는 cd36 유전자 결핍을 가지고 있지만, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)도 유전적으로 태그 EC의 번역 리보솜. TRAP은 표적 조직의 혈관 내피에서 직접 리보솜 결합 mRNA의 친화도 정제를 허용하여 유전자 발현 및 EC 분화와 관련된 새로운 전사체의 식별을 가능하게 하며, 생체 내 조건 하에서 직접 혈관 신생. 우리는 성공적으로 이 유전으로 조작된 동물에 있는 내피에서 리보솜 바인딩된 RNA를 격리했습니다. 정제된 RNA는 EC 분화 및 기능의 조절에서 혈관신생 또는 동맥신생 유전자의 추가 특성화에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 생체 내에서 직접 ECs에서 mRNA의 격리를 위한 TRAP 접근법을 구현하는 단계별 가이드를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>2100 나노칩과 피코칩을 사용한 전기영동 바이오분석기</td><td>Agilent</td><td>G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizers</td><td>Fisher Scientific</td><td>K8855100020</td><td></td></tr><tr><td>Magnet (Dynamag-2)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td>정제 스케일에 따라 다릅니다. 1.5-mL 튜브의 시료는 다음에 농축될 수 있습니다. DynaMag-2</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>1.5-mL 마이크로 원심분리기 튜브용 로터</td></tr><tr><td>RNase-free 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12450</tr><tr><td>Rnase-free 50-mL 코니컬 튜브</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12501</tr><tr><td>RNase-free 1000-&mu; l 필터 팁</td><td>Rainin</td><td>RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 200-&mu; l 필터 팁</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>RT-200F</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 20-&mu; l 필터 팁</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>RT-20F</td><td></td></tr><tr><td>호모게나이저용 로터</td><td>Yamato&nbsp;</td><td>LT-400D</td><td></td></tr><tr><td>튜브 로테이터, Labquake 브랜드</td><td>써모 피셔</td><td>13-687-12Q</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 내피 세포에서 rna 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(trap) 번역

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

많은 연구는 qPCR 및 RNA 염기서열 분석에 의한 전사체 및 유전자 발현의 시험관 내 분석을 위해 동물로부터 시험관 내 세포 분석 및 전체 조직 또는 특정 세포 유형을 분리하는 것으로 제한되었습니다. 복잡한 조직 및 기관에 있는 특정 세포 모형의 포괄적인 전사체 그리고 유전자 발현 분석은 유전자가 통제되는 세포와 분자 기계장치를 이해하고 조직 항상성 및 기관과의 그들의 협회를 이해하는 것이 중요합니다 함수. 이 기사에서는, 우리는 예를 들어 동물 폐의 혈관 내피에서 생체 내에서 직접 리보솜 결합 RNA의 격리를위한 방법론을 보여줍니다. 조직 처리 및 RNA 정제를 위한 특정 물질 및 절차는 동맥 생성 유전자 검정을 위한 RNA 질 및 수율의 평가 뿐만 아니라 실시간 qPCR를 포함하여 기술될 것이다. 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술로 알려진 이 접근법은 복잡한 조직에서 임의의 특정 유형에서 생체 내에서 직접 특정 세포 유형의 유전자 발현 및 전사체 분석의 특성화에 활용될 수 있다.

우리의 이전연구 4,7은 CD36이 LPA/PKD-1 신호 통로를 통해 동맥 분화 및 모세관 동맥화를 위한 스위치로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. LPA/PKD-1-CD36 신호 축이 생체 내 동맥 발생에 필수적인지 여부를 연구하기 위해, 우리는 글로벌 cd36 결핍 또는 내피 특이적 cd36- 또는 pkd-1 결핍뿐만 아니라 선택적 격리를 허용하는 새로운 TRAP 라인을 설립했습니다. GFP에 의한 크레마크 세포 계에서 리보솜 결합 RNA의, 및 cre 활성화형광 리포터2로 유용하다.
유전형 검사를 수행함으로써, 우리는 cd36 유전자가 내피 특이적 cd36 null 마우스에 대한 전 세계적으로 또는 혈관 내피에서 삭제된 것을 관찰하고(데이터는 도시되지 않음), pkd-1 유전자는 또한 혈관 내피에서 삭제되었다. 도 1은 생성...

우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

안녕하세요, 저는 빈 렌입니다, 나는 알라바마 대학 버밍엄 의과 대학에서 수술 및 생물 의학 공학의 부교수입니다. 우리의 실험실은 이러한 일반적인 심장 혈관 질환과 암의 맥락에서 내피 세포 생물학 기능 혈관 신생 아큐오발생에 관심이 있습니다. 우리의 연구 중 하나는 내피 세포 전분 및 혈관 신생의 후성 유전학 및 전사 조절에 있습니다.혈관 신생의 전사 메커니즘을 이해하기 위해, 우리는 자궁 내피 세포에서 혈관 신생과 관련된 특정 유전자를 삭제했을뿐만 아니라 향상된 GFP 프로브가 토착 내피 세포의 리보솜에 유전적으로 태그될 트랜스젠트 엔지니어링 마우스 라인을 확립했습니다. 이러한 방식으로, 우리는 형질전환 동물에서 직접 다른 조직 기관에서 내피 세포에서 관련 메신저 RNA의 루프를 분리하고 정화 할 수 있습니다. 그런 다음 정제 된 메신저 RNA를 사용하여 성적 증명서 및 전사의 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다.RNA 시퀀싱 및 실시간 냉각 PCR에 의해. 이 비디오에서, 내 학생 패트릭 모란과 조던 파머와 연구 기술자 니콜라스 바네코프와 롱 위안당신에게 트랜스 제닉 동물의 내피에서 직접 지각 형생 마우스와 멸망 메신저 RNA를 유전자화 하는 방법을 보여줍니다. Genotyping은 얼음이 내피 세포의 리보솜에 GFP 태그를 가지고 있는지 확인하기 위해이 프로토콜에서 중요한 예비입니다.모든 다운스트림 RNAi 절연 단계는 GFP 태그 리보솜의 존재에 의존하기 때문에 실험을 시작하기 전에 유전자형을 결정하는 것이 필수적입니다. RNA 격리를 시작하기 전에 몇 가지 준비 단계를 완료해야 합니다. 이들은 단백질 G dina 구슬에 항 GFP 항체를 완충 제제 및 결합을 포함한다.완충제는 섭씨 4도에서 최대 1개월까지 지속될 수 있으며 항체 바인딩구슬은 섭씨 4도에서 최대 1주일까지 지속될 수 있습니다. 따라서 실험을 계획할 때 이러한 제한 사항을 고려하십시오. 어금니 구동 균질화제를 사용하는 것은 RNA 수율을 높이는 훌륭한 방법입니다.RNA 분해를 줄이기 위해 낮은 주파수 설정 및 지속 시간을 사용해야 합니다. 앞서 언급했듯이, genotyping은 임상 시험 프로토콜에서 중요한 예비 단계입니다. TRAP 기술을 사용하여 RNA를 분리하는 마우스가 TRAP 유전자에 대해 양성이지만, 적어도 TRAP 유전자에 대한 이상적으로 동질화구는 GFP 태그가 리보솜에 있는지 확인하는 것이 항원 항체 반응 및 항 GFP 비드를 사용하여 아래로 당겨야 하기 때문에 중요한 단계입니다.마우스에서 원하는 조직을 분리하고 밀리리터 사이클로헥사미드 용액당 100 마이크로그램으로 얼음 차가운 PBS에 즉시 넣습니다. 이렇게 하면 번역이 중지되고 전사체가 안락사 이전에 마우스를 정확하게 묘사할 수 있습니다. 모터 구동 균질화제를 사용하여 조직을 세포 현탁액으로 균질화하십시오.이상적인 타이밍 과 주파수 설정은 당신이 사용할 것입니다 특정 모터 구동 균질화제에 따라 개별 실험실에 의해 결정되어야한다. 주파수 설정이 너무 높게 사용하면 RNA 가 분해되고 나머지 프로토콜이 중단될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 준비해야 하는 리시스 버퍼 내에서 셀 펠릿을 일시 중단합니다.프로토콜의 나머지 부분을 진행하기 전에 적절한 균질화를 보장하기 위해이 혼합물을 더 균질화해야합니다. 원심 분리는 섭씨 4도 원심분리기에서 2, 000배 G에서 10분 동안 동형포를 발사합니다. 이것은 다운스트림 면역 침전 반응을 방해할 수 있는 핵 및 큰 세포 파편을 펠렛할 것입니다.이전 원심화 단계에서 상퍼에 DHPC 및 CA-630 지질을 추가합니다. 이 지질은 그밖 세포내 분대에서 단백질 위상을 분리하는 것을 도울 것입니다. 서스펜션을 얼음 위에 5분간 놓고 앉습니다.13, 000배 G에서 10분 동안 용해성 물질을 원심분리합니다. 향후 단계를 위해 명확한 lysate의 15%를 보관하십시오. 세포용액에 항-GFP 항체 바운드 구슬을 추가하고 30분 동안 엔드 오버 엔드 회전으로 4°C에서 혼합물을 배양한다.이것은 항 GFP 항체가 GFP 태그리보솜을 결합하여 이러한 리보솜으로부터 RNA를 더 격리할 수 있는 곳입니다. 마그네틱 랙에 구슬을 모으고 격리를 시작하기 전에 준비한 높은 소금 폴리섬 워시 버퍼를 사용하여 구슬을 5회 세척합니다. 즉시 RLT 버퍼에 구슬을 배치하는 다음 단계로 진행합니다.최대 속도로 3 분 동안 lysate원심을 원심 분리하고 상체를 조심스럽게 제거하고 새로운 미세 분리 튜브로 옮킵니다. 클리어된 용액에 70%에탄올 1부부로 넣고 파이펫팅으로 즉시 섞습니다. 형성되었을 수 있는 침전수를 포함하여 시료의 최대 700마이크로리터를 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 즉시 전송하는 다음 단계로 진행합니다.스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8, 000배 G보다 15초 동안 리세스를 원심분리합니다. 흐름을 버리고 다음 단계로 진행합니다. 스핀 컬럼에 버퍼 RW1 350 마이크로리터를 추가합니다.원심분리기는 8, 000배 G이상으로 15초 동안 스핀 컬럼 멤브레인을 세척하고 흐름을 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 버퍼 RW1의 또 다른 350 마이크로리터를 사용하여 이 단계를 반복합니다. 스핀 컬럼에 500마이크로리터의 버퍼 RPE를 추가합니다.스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8, 000 배 G보다 15 초 동안 원심 분리기. 흐름을 버리고 스핀 컬럼에 버퍼 RPE의 500 마이크로리터를 추가하여 이 단계를 반복합니다. 이번에는 스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8.000 배 G보다 큰 2 분 동안 원심 분리기를 합니다.흐름을 버리고 스핀 컬럼을 새로운 2 밀리리터 수집 튜브에 놓고 1분 동안 최대 속도로 원심분리기로 진행하여 스핀 컬럼에 존재할 수 있는 잔류 버퍼를 제거합니다. 흐름을 버리고 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 배치합니다. 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 RNase 프리 워터30~50마이크로리터를 추가합니다.스핀 컬럼 멤브레인에서 RNA를 엘로우기 위해 8, 000배 G보다 1분 동안 원심분리기. 이 시점에서 RNA는 RNase 무료 물에 용해되며 최대 1 년 동안 영하 80도에서 보관 할 수 있습니다. 분광광계를 사용하여 격리한 RNA의 순도를 정량화하고 확인하십시오.RNA를 포함한 핵산인 260 나노미터에서 최대 흡수를 찾고 있습니다. 양은 마이크로리터 당 나노그램으로 이미지의 오른쪽 아래 부분에 묘사된다. 품질은 260 230 비율로 추론될 수 있으며, 이는 화면의 오른쪽 아래 부분의 수량 보다 높은 한 항목을 나타내고 있다.우리의 접근은 우리가 심장 조직에서 또는 이전에 동결된 조직에서 mRNA를 정제할 때 특히 낮은 RNA 수율을 보여주었습니다. 따라서 우리는 수율을 높이기 위해 조건을 최적화해야합니다. 그러나, 우리는 EC 특이CD-36 결핍 마우스에서 관찰했었으며, 에프린 B2 와 DLL4의 수준은 대조군과 비교했을 때 폐와 심내도 모두에서 현저히 증가하였다.이러한 결과는 RNA 품질이 다운스트림 분석을 위해 충분하다는 것을 건의하는 우리의 이전 체외 연구 결과와 일치했습니다. 작업 영역의 엄격한 조건으로 인해 수율이 낮았습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해서는 RNase 무료 작업 영역을 설정하고 RNase로 오염되고 장갑을 자주 교체하여 품질 RNA를 추출하고 수율을 높일 수 있는 작업 표면 및 장비를 오염 제거하는 것이 중요합니다.또한 친화성 매트릭스에서 GFP 항체의 적절한 농도를 찾고 조직 용해 완충제에서 RNase 억제제의 적절한 농도를 사용하고 표적 조직의 내피성 리보솜에서 RNA 추출을 위한 RNase 무료 플라스틱 도자기 및 시약을 사용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 생체 내피 세포에서 리보솜 결합 mRNA를 정제하는 TRAP 방법을 이용한 혈관생성 연구 기법입니다. EGFP 태깅을 활용하여 마우스 뇌, 폐, 심장 조직의 전사체 분석이 가능합니다.

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

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