Name: 인간 배반포 생검 및 유리화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 인간 배반포 생검 및 유리화 기술을 통해 배아 유전자 검사를 수행하는 방법을. 이 기법은 영양외배엽 세포를 채취하여 유전 분석을 가능하게 하며, 배아에 대한 위험을 최소화합니다.

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AG와 RM은 데이터를 수집하고 원고를 작성했습니다. DC는 데이터를 분석하고, 대표 결과를 작성하고, 통계를 수행하고, 원고를 수정했습니다. FMU와 LR은 결과와 전체 원고에 대한 비판적 인 토론을 제공했습니다.

인간 배반세포 생검을 위한 프로토콜은, 여기에서 기술한, G.EN.E.R.A. 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
참고: 필요한 재료는 재료 표를 참조하십시오. 추가 필요한 재료는 실험실 신발과 의상, 수술 안면 마스크, 헤어 커버, 수술 장갑, 영구 무독성 마커, 집게 및 소독제를 수반한다. 외과 용 가운, 일회용 수술 장갑, 안면 마스크, 헤어 커버의 사용은 오염의 위험을 방지하기 위해 필수적입니다. 모든 작업 영역과 공정에 관련된 장비는 모든 절차를 시작하기 전에 실험실 소독제(예: Oosafe)로 철저히 세척해야 합니다. 사용되는 모든 소모품과 매체는 멸균되고 개별적으로 포장되거나 aliquoted되어야 합니다. 생검 및 튜브에 전용 워크스테이션을 사용하고 절차에 관련된 운영자 (배아 학자 및 증인)에게만 해당 영역의 액세스를 제한하는 것이 좋습니다.
1. 생검 절차 전날준비
<ol><li>
생검 문화 후 접시를 준비합니다.
	<ol>
<li>20 μL IVF 배양 배지6 방울을 IVF 배양 접시에 놓고 배아 배양용 프리웜 미네랄 오일 6 mL로 오버레이(재료표).</li>
		<li>각 방울에 IVF 배양 배지의 또 다른 10 μL을 추가합니다. 통제된 분위기에서 37°C에서 밤새 배양(5% O2, 6% CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
생검 후 배반포를 헹구기 위해 IVF 접시 4-well 접시를 준비합니다.
	<ol>
<li>처음 두 개의 우물에 IVF 배양 배지 600 μL을 놓고 배아 배양을 위해 미리 데운 미네랄 오일 300 μL을 겹쳐 놓습니다.</li>
		<li>통제된 분위기에서 37°C에서 밤새 배양(5% O2, 6% CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>TE 세포 튜브에 사용되는 각PCR 튜브에 1.5 μL의 로딩 용액 (재료 표)을 분배하고 회전시키고 4 °C로 유지하십시오.</li>
</ol>2. 생검 수속당일 준비
<ol><li>
생검 접시를 준비합니다.
	<ol>
<li>10 μL HEPES 완충배지 3 방울(인간 혈청 알부민보충제)을 IVF 배양 접시에 연속하여 놓습니다.</li>
		<li>사용 가능한 배반포 수(접시당 최대 4개의 배반포)에 따라 1.1.1단계를 반복하고 배아 배양을 위해 미리 데운 미네랄 오일 6 mL로 오버레이합니다.</li>
		<li>생검 절차를 수행하기 전에 적어도 1 시간 동안 37 °C에서 접시를 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 배반포 선택 및 채점
<ol><li>
ICM 및 TE의 팽창 및 형태학적 외관에 따라 배반포를 채점한다(그림 1). 참고 : 채점 기준은 가드너와 스쿨 크래프트에서 적응하고있다15 이전에 카팔보 등 및 Cimadomo 등4,11에의해 설명 .<ol>
<li>크기 및 팽창 등급을 다음과 같이 정의합니다: 완전히 부화된 배반포의 경우 A, 부화 배반포의 경우 B, 완전히 확장된 배반포의 경우 C, 확장되지 않은 배반포의 경우 D(이 배아는 7일까지 더 확장되지 않은 경우에만 생검됩니다).</li>
		<li>ICM 등급 정의: 엄격하게 포장된 여러 셀이 있는 눈에 띄는 ICM의 경우 1; 2 는 여러 개의 셀을 통해 식별 할 수 있습니다. 3 은 매우 적은 품질의 셀로 구별하기 어렵다.</li>
		<li>다음과 같이 TE 등급을 정의 : 여러 세포와 잘 조직 상피에 대한 1; 2 적은 세포와 느슨한 상피에 대한; 3 소수 및/또는 큰 저품질 셀용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 트로피토더생검 생검
<ol><li>모든 실행 가능한 완전히 확장 된 blastocysts에 TE 생검을 수행 (바람직하게는 크기와 확장을위한 C 등급).</li>
	<li>각 생검 절차에 대한 유지 및 생검 파이펫을 설정합니다. 생검 파이펫에 대한 권장 사항은 다음과 같습니다 : 30 μm 내부 직경, 35 ° 굽힘 각도, 굽힘 0.75mm 거리 팁.</li>
	<li>환자의 세부 사항 (여성의 이름과 성, 생년월일 및 신분증)으로 생검 접시에 라벨을 붙인 다음 배아 및 주기 ID로 각 방울에 번호를 매습니다. 영구적인 무독성 마커를 사용하십시오.</li>
	<li>300 μm 스트리핑 피펫으로 배반포를 생검 접시의 첫 번째 방울로 옮기고 배양 배지의 과잉을 제거하기 위해 헹구십시오. 그런 다음 생검 접시의 두 번째 방울에서 배반포를 옮기십시오.</li>
	<li>접시를 거꾸로 된 현미경으로 옮기고 생검 접시의 세 번째 방울에서 일부 배지를 흡인하는 생검 파이펫을 프라이밍합니다.</li>
	<li>20배 배율에서, 배반포를 배향하여 ICM을 명확하게 볼 수 있도록 한다. 7시 방향(TE 세포를 제거하기 위해 표적으로 하는 영역과 반대)에 시각화되면, 배아를 유지피펫 위에 고정한다(도 2a).</li>
	<li>조나 펠루시다에 초점을 맞추고 파이펫과 배반포가 모두 같은 초점 면에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>레이저 대물(펄스 시간 0.3ms, 6.5 μm)으로 전환하고 레이저 포인터를 ICM의 반대쪽에 조나 펠루시다에 배치합니다. 2−3 레이저 펄스를 통해 조나 펠루시다를 드릴 (그림2b).</li>
	<li>조나 펠루시다에 대한 생검 피펫을 부드럽게 누르고 내부 표면에서 TE 세포를 분리하고 배반포 붕괴를 촉진하기 위해위반을 통해 일부 매체를 날려 보냅니다 (그림 2c).</li>
	<li>TE가 분리되면(그림 2d),구멍을 통해 입력 (필요한 경우, 마지막 레이저 펄스로 넓게) 몇 TE 세포 (이상적으로 7-813,16)부드러운 흡입과 생검 파이펫에 흡인 (그림2e).</li>
	<li>대상 세포를 스트레칭하기 위해 적당한 흡입을 적용하면서 생검 피펫을뒤로 약간 이동시다(도 2f).</li>
	<li>레이저를 흡인 세포의 가장 얇은 부분으로 향하게 하고 세포 사이의 접합부에서 2−5 레이저 펄스를 발사하여배아의 몸에서 표적 세포를 분리합니다(그림 2g). 레이저 펄스의 타이밍과 펄스의 수는 배반포의 품질에 따라 조정할 수 있습니다; 그러나, 세포 lysis를 피하기 위해 그들을 최소화 하려고.</li>
	<li>BLASTocyst (그림 2h)에서 TE단편을 분리 한 후, 배반포로부터 멀리 떨어진 동일한 생검 드롭으로 방출한다. 이것은 생검 파이펫으로 다시 흡입되는 것을 방지하기 위하여필요합니다 (그림 2i).</li>
	<li>홀딩 파이펫에서 배반포를 풀어주고 파편이 부착되지 않도록 두 파이펫을 즉시 올립니다.</li>
	<li>품질 관리 목적을 위해 생검 된 조각의사진을 찍습니다 (그림 3). 참고: 단일 배반포가 절차당 생검(생검 접시당 최대 4개)을 생검하는 경우, 배아 간 교차 오염을 방지하기 위해 생검 피펫을 새 파이펫으로 변경합니다.</li>
	<li>4.1-4.13단계를 반복한다.</li>
	<li>생검 접시를 층류 후드로 다시 옮습니다.</li>
	<li>생검 후 배양 접시에 부부 ID를 표시하고, 배아와 사이클 ID로 각 방울을 떨어뜨립니다.</li>
	<li>목격자가있는 경우 깨끗한 IVF 배지에서 배반을 헹구고 마지막으로 생검 후 접시의 해당 드롭으로 옮습니다.</li>
	<li>생검 후 접시를 조절된 분위기(37°C, 6% CO2, 5% O2)에서 유리화될 때까지 인큐베이터로 옮니다. 배반재 재팽창을 방지하기 위해 생검 절차에서 30 분 이내에 유리화를 수행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>5화 튜브
참고: 전체 절차는 증인의 존재와 실온에서 층류 후드 내부에서 수행되어야한다. 시술 중에 PCR 튜브를 얼음 위에 있는 차가운 튜브 랙에 보관하십시오(보조그림1).
<ol><li>PCR 튜브에 영구적인 무독성 마커로 라벨을 붙입니다. 참고: 라벨링은 유전 실험실의 요청에 따라 수행해야 합니다. 일반적으로, 환자의 이름과 성 (이니셜), 부부 ID, 배아 및 주기 ID (예를 들어: JD 12345 1.2 의 배아 N.1의 배아 N.1에 대한 그의 부부 ID는 12345입니다). 배아 ID는 또한 관의 바디에 편지에서 보고되어야 합니다.</li>
	<li>생검 배아의 아이디(보충그림1)와 함께 60 mm x 15mm 배양 접시(튜빙 접시)의 뚜껑을 라벨링하고 생검 세척용액 2개(재료표)를 준비합니다.</li>
	<li>140 μm 스트리핑 피펫(보충도1)을 튜브 접시의 두 번째 방울로부터 생검 세척 용액으로 프라임.</li>
	<li>스테레오현미경 아래에 생검 접시를 놓아 TE 단편을 쉽게 시각화합니다.</li>
	<li>TE 단편에 일부 생검 세척 용액을 부드럽게 풀어 놓습니다. 스트리핑 피펫에 로드합니다.</li>
	<li>TE 조각을 튜브 접시에 생검 세척 용액의 두 번째 방울로 옮기고 조심스럽게 2−3 회 헹구어 보입니다.</li>
	<li>TE 조각을 로딩 솔루션으로 PCR 튜브 의 바닥으로 옮기고 스트리핑 파이펫 끝으로 벽에 닿지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>각 TE 단편에 대해 5.3단계에서 5.7단계까지 절차를 반복하여 모든 TE 단편에 대해 새로운 모세관을 사용하는 데 주의를 기울입니다.</li>
	<li>튜브 절차가 끝나면 모든 PCR 튜브를 미니 원심 분리기에 넣고 몇 초 동안 회전시십시오.</li>
	<li>샘플을 -20°C에서 저장하여 검사를 위해 참조 유전 실험실로 배송합니다.</li>
</ol>6. 배반포 유리화
<ol><li>Vitrify는 TE 생검에서 30 분 이내에 배반포를 붕괴하여 재팽창을 방지합니다.</li>
	<li>유리화 판에 여성의 세부 사항과 유리화해야 하는 배반포의 아이디를 레이블로 지정합니다.</li>
	<li>여성의 이름과 성, 부부 ID, 태아의 신분증, 그리고 시술 날짜를 적어 정하는 유리화 지원서에 라벨을 붙입니다. 매우 낮은 온도(-196°C)에서도 무결성을 보존하는 특수 저온 라벨이 사용됩니다.</li>
	<li>실온에서 유리화될 각 배반포에 대해 0.3mL의 평형 용액(ES)(재료 표)을 분배합니다.</li>
	<li>목격자가있는 경우 300 μm 스트리핑 피펫을 사용하여 ES에서 배반포를 이동하십시오.</li>
	<li>13-15 분 동안 ES에 배반소를 둡니다. 부피의 초기 수축 후, 점진적인 재팽창이 관찰될 것이다.</li>
	<li>액체 질소 (LN 2)로작은 냉각 랙을 채우고 층류 후드 아래에 놓습니다.</li>
	<li>제2 우물에서 300 μL의 유리화용액(VS)(재료 표)을 분배한다. blastocyst가 완전히 재팽창된 후, VS 용액에 1분 간 옮기고 헹구어 ES를 희석시다.</li>
	<li>목격자가 있는 경우, 배반포를 유리화 지지체에 적재하고 VS의 과잉을 제거하십시오. 솔루션의 미묘한 필름은 배반포를 둘러싸고 있어야합니다.</li>
	<li>유리화 지지체를 LN 2로 급락시키고 시편에 가까운 기포 형성의 위험을 줄이기 위해 힘차게 움직입니다.</li>
	<li>LN 2에 잠긴 유리화 지지체를 유지하면서 보호 캡을 놓습니다.
</li>
	<li>목격자가 있는 경우, 장기간 LN2 저장 탱크에서 유리화 지지체를 이동한다.</li>
</ol>7. 비생검배포의 인공수축
<ol><li>
TE 생검이 수행되지 않으면, 유리화 직전에 배반포를 인위적으로붕괴시다(그림 4).
	<ol>
<li>배양 접시를 인큐베이터에서 반전된 현미경으로 옮기고 선택된 배아에 초점을 맞춥니다.</li>
		<li>레이저 목표(사전 설정된 펄스: 0.3 ms, 6.5 μm)로 전환하고 ICM의 반대쪽에 있는 조나 펠루시다를 대상으로 한 다음 ICM에서 안전한 거리에서 TE 세포 사이의 접합부로 1-2개의 레이저 펄스를 직접 향합니다. 배반포는 5 분 이내에 붕괴해야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섹션 6에 설명된 바와 같이 붕괴된 배반포의 유리화를 진행한다.</li>
</ol>8. 양도 가능한 배반포 온난화
<ol><li>ET의 날에, 각 웰에 대해 600 μL의 미리 균형잡힌 IVF 배양 배지를 배치하여 ET 4-웰 플레이트를 준비한다. 변폭성 온난화를 수행하면서 제어 된 분위기(5 % O 2, 6 % CO 2)에서 37 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>따뜻하게 데우는 여성의 이름과 성, 커플 ID, 배아의 신분증으로 따뜻하게 하는 접시에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>해동용액(TS)의 1 mL을분주하여 체질 원웰 접시(보충도 1)에 17°C로 조절하여 시술을 시작하기 전에 적어도 1시간 동안 온도조절기에서 37°C로 데운다.</li>
	<li>LN 2로 작은 냉각 지지대를 채우고 작업 영역 가까이에 층류 후드에 놓습니다.</li>
	<li>절차를 시작하기 전에 유리화 지원에 보고된 배반포 정보를 확인하십시오. 모든 아이디는 유전 보고서와 일치해야하며 따뜻하게하는 배반포는 양도 할 수있는 것들 중에서 선택해야합니다. 절차 중에 증인이 필요합니다.</li>
	<li>온도 조절기에서 따뜻하게 데운 TS가 들어있는 원웰 접시를 스테레오현미경 아래 가열된 스테이지에 놓습니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 LN2 내의 보호 캡을 당깁니다.</li>
	<li>유리화 지지체의 팁을 37°C TS로 빠르게 플런지합니다.</li>
	<li>현미경 관찰하에 배반포가 끝에서 풀려나갈 때까지 유리화 지지체를 부드럽게 움직입니다.</li>
	<li>TS의 바닥에 그것을 유지하기 위해주의를 지불, TS에 총 1 분 동안 배반을 둡니다.</li>
	<li>실온에서 200 μL의 희석 액 (DS) (재료표)을유리화 판의 첫 번째 우물에 분배합니다.</li>
	<li>배반을 DS로 전송하고 그라데이션의 일종을 만들기 위해 그것의 상단에 일부 TS를 해제하는 동안 우물의 하단에 배치합니다. 3 분 동안 둡니다.</li>
	<li>2개의 다른 웰(WS1 및 WS2)에 200 μL의 세척 액(WS)을 분배합니다.</li>
	<li>WS1에 배반포를 전송하고 그것의 상단에 일부 DS 매체를 해제하면서 우물의 바닥에 배치합니다. 그런 다음 바포포리스트를 WS2로 옮기고 1분 동안 방해받지 않고 둡니다.</li>
	<li>여성의 이름과 성, 커플 ID, 배아의 신분증으로 온난화 후 ET 플레이트에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>증인이있는 경우, 온난화 된 배반포를 온난화 후 ET 플레이트에서 미리 균형 된 배양 매체로 옮김을 옮니다.</li>
	<li>ET 플레이트의 첫 번째 우물에서 배반포를 헹구고 두 번째 우물에 놓습니다.</li>
	<li>온난화 후 배양 접시를 조절된 분위기(37°C, 6% CO2, 5% O2)에서 인큐베이터로 옮기고 배반포를 적어도 1.5시간 동안 배양한 후 생존 및 재팽창을 확인한다. 참고: 그림 5는 퇴화된, 저온 생존하지만 다시 확장되지 않고 저온 생존및 완전히 확장된 배반포의 예를 보여줍니다.</li>
</ol>9. 배아 이동
<ol><li>ET를 수행하려면 접시를 층류 후드의 가열 단계에 놓아 배아가 낮은 배율로 현미경 으로 볼 수 있도록하십시오.</li>
	<li>IVF 배양 배지의 약 0.4 mL를 취합니다. 주사기 팁을 내부 카테터의 수신 단부로 단단히 고정한 다음 매체를 최대 0.1 mL까지 방출합니다.</li>
	<li>배양 배지는 카테터에 들어가는 배아를 관찰할 때까지(최소량의 배지: 10-15 μL).</li>
	<li>카테터를 플라스틱 케이스에 넣고 수술실로 가서 내부 카테터를 외부 가이드에 넣습니다.</li>
	<li>일단 자궁에 도달하면, 주사기 플런저를 밀어 배아를 풀어 놓습니다. 플런저가 0.1 mL를 읽을 때까지 매체를 매우 천천히 해제합니다.</li>
	<li>카테터를 다시 실험실로 가져가서 현미경으로 배아가 옮겨졌는지 확인하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

훈련 기간을 마친 숙련된 숙련된 배아학자만이 TE 생검과 배반포 유리화를 모두 수행해야 합니다. 또한, 생검 접시에서 생검 된 배반포의 움직임을 시술 을 모니터링하고 효율적인 추적성을 보장하기 위해 증인이 필요합니다 (보충그림1) 생검 후 접시에 (보충그림 1) ), 다음 유리화 판(보충 도1) 및 마지막으로 유리화 지지체 (보조도1); ii) 생검접시로부터 PCR관으로 의생TE세포의이송(보충체도1); iii) 온난화 및 전사 단계 사후 진단. 모든 감시 단계에 대한 자세한 설명은 이전에 게시된 실패 모드 및 효과 분석(FMEA)을 참조하십시오14.
이 백서에 설명된 모든 방법은 현지 규정(이탈리아 법 40/2004)을 존중합니다. 법에 따르면, 사실, 부부는 IVF 주기 동안 생산 된 ...

현대 인간 발생학의 주요 목표는 자극된 주기 당 출생 수를 최대화하고 임신을 달성하기 위하여 비용, 시간 및 노력을 감소시키는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위하여는, 태아 선택을 위한 검증된 접근은 IVF 주기 도중 장악된 코호트 내의 생식 유능한 태아를 확인하기 위하여 이용되어야 합니다. 최신 증거에 따르면, blastocyst 배양 1은 포괄적인 염색체 검사 및 유리화 온난화 된 유엽태아 전달 (ET)과 결합되어 IVF 효율을 높이는 가장 효율적인 프레임 워크2이다. 분명히, 이수성 검사는 현재 주로 trophectoderm (TE)에서 검색 된 몇 가지 세포에서 표현되는 배아 표본을 필요로, 즉, 임신 중 배아 부속서 (예를 들어, 태반)에 기원을 제공하는 배반포의 섹션 . karyotype 분석을 넘어, 또한 단 하나 유전자 돌연변이는 착상 전 유전 시험으로 알려져 있는 임상 전략의 한 부분으로 TE 생검에서 평가될 수 있습니다 (PGT; -A 는 이수화에 대한, 구조 염색체 재배열을 위한 -SR, 단조로운 질병을 위한 -M). 그밖 난모세포/배아 생검 방법은 지난 십년간, 즉 극성 바디 생검 및 blastomere 생검을 통해 임상으로 이론화되고 채택되었습니다. 그러나, 그들의 사용은 그들의 절차적 단점 (예를 들어, 더 높은 워크로드 및 생식 영향에 대한 위험) 및 진단 한계 (예를 들어, 단일 세포 분석 문제)가 암시적으로 비용, 위험 및 및 사이의 충분한 균형을 방해하기 때문에 요즘 감소됩니다. (리뷰는3참조).
이 백서에서 TE 생검을 위한 주요 프로토콜 중 하나는 필요한 후속 유리화, 온난화 및 전달 절차와 함께 철저히 설명됩니다. 여기에 설명된 워크플로는 바쁜 PGT 장치에 이상적입니다.
이미 우리 그룹4,5에의해 이전에 설명한 바와 같이, 절차는 완전히 확장 된 배반포의 조나 펠루시다의 순차적 개방과 몇 가지 TE 세포의 제거를 포함한다 (평균 7-8). 3 일 레이저 보조 부화 기반 배반 포동 생검 방법6에비해,이 절차는 배반 세포 생검 및 유리화와 같은 섬세한 절차가 적시에 수행되어야하는 IVF 장치의 일일 일정을 완화 할 수 있습니다. 배반포가 완전한 확장에 도달하자마자, 생검은 제거하는 TE 세포를 선택하여 수행될 수 있고, 따라서 그렇지 않으면 절차를 도전하게 하는 내부 세포 질량 (ICM)의 탈장의 리스크를 방지합니다. 문헌에서, 배반포 생검의 제 3 프로토콜은 또한 설명되었습니다, 이는 배아가 이미 배반포 단계에 도달하면 수행되는 레이저보조 부화포함, 절차 5,7전에 몇 시간. 그러나, 이 접근법은 시간이 더 많이 소요되며 주로 제한된 숙련된 운영자의 손에 TE 생검을 구현하는 IVF 단위에 적합하며, 이는 보통 낮음의 일일 워크로드를 고려할 때 입니다.
Intracytoplasmatic 정액 주입 (ICSI)8 는 IVF에 있는 유전 분석을 실행하기 위하여 겨냥하는 경우에 통합한 기술이어야 합니다. 유사하게, 배아를 배반포 단계로 안전하게 수확하는 적절한 배양 시스템은 TE 생검 전략의 구현에 매우 중요하다. 적절한 수의 인큐베이터뿐만 아니라 낮은 산소 장력의 사용은 배반포 속도 9를 손상시키지 않는이 단원의 주요 전제 조건입니다. 동시에 PGT 주기를 안전하게 관리하기 위해서는 효율적인 냉동 보존 프로그램이 필요합니다. 지난 10 년간, 유리화의 구현은 배아 극저온 생존율을 >99%10,11까지증폭시켰습니다. 이것은 유전자 검사를 수행하고 다음 생리주기로 배아 전달을 연기하기에 충분한 시간을 제공, 비 자극 아마 더 수용 자궁 내막에12.
TE 생검과 유리화 는 엄격한 기술을 요구하는 작업을 요구하고 있으며 그 효과는 경험이없는 운영자에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 각 작업자가 이러한 절차를 임상적으로 수행할 수 있도록 하기 전에 특정 교육 기간이 주어지며, 또한, 냉동 보존 및 생검 절차에 대한 핵심 성과 지표(KPI)를 모니터링하여 운영자의 기술 유지를 주기적으로 평가해야 합니다. 각 IVF 클리닉은 내부 KPI를 이를 위해 설정해야 하며, 이는 국제 컨소시엄이 발표한 KPI 및/또는 참조 실험실에서 발표한 결과를 근사화해야 합니다.
TE 생검, 유리화 온난화 및 목격 절차는 3개의 이전 간행물11,13,14에 보고된 대로 관련된 모든 사업자에 걸쳐 표준화된 우리의 단위에 있는 기술을 검증됩니다 .

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold tube rack</td><td>Biocision</td><td>XTPCR96</td><td></td></tr><tr><td>Electronic pipette controller</td><td>Fisher Scientific</td><td>710931</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 조절 가능한 핸들 세트</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>스트리퍼 홀더</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>IVF 전자 증인 시스템</td><td>CooperSurgical Fertility & 게놈 솔루션</td><td></td><td>RI Witness ART 관리 시스템</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>등급 A 공기 흐름</td></tr><tr><td>레이저 대물</td>렌즈 <td>RI</td><td>Saturn 5</td><td></td></tr><tr><td>Microinjectors</td><td>Nikon Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브용 미니 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>CSLQSPIN</td><td>0.2 mLl PCR 튜브용</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5AC-PE</td><td></td></tr><tr><td>트라이 가스 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsy pipette</td><td>RI</td><td>7-71-30FB35720</td><td>30 &micro; m ID, 플랫 35 &deg; C</td></tr><tr><td></td><td>Cryolock Cryolock</td><td>CL-R-CT</td><td></td></tr><tr><td>CSCM complete</td><td>Irvine Scientific</td><td>90165</td> HSA 배아 이식 카테터<td>가 보충된 IVF 배양 배지</td></tr><tr><td></td><td>Cook</td><td>G17934</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 피펫</td><td>Cook</td><td>G26712</td><td>140&micro; m 스트리핑 피펫 팁</td></tr><tr><td>Flexipet 피펫</td><td>Cook</td><td>G46020</td><td>300&micro; m 피펫 팁</td></tr><tr><td>고정 피펫</td><td>RI</td><td>7-71-IH35/20</td><td>30 &micro; m ID, 플랫 35 &deg; C</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>IVF 배</td>아 배양을 위한 하나의 우물 접시 <td>Falcon</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Modified HTF Medium</td><td>Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>Hepes-Buffered medium</td></tr><tr><td>Nuclon Delta Surface</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>176740</td><td>IVF dish 4- 슬라이딩 뚜껑이 있는 웰 플레이트</td></tr><tr><td>Primaria 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>60 mm x15 mm</td></tr><tr><td>Reproplate</td><td>Kitazato</td><td>83016</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>10ml</td></tr><tr><td>멸균 일회용 Gilson 팁</td><td>Eppendorf</td><td>0030 075.021</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>유전자 실험실</td><td></td><td>PCR 튜브(0.2mL)에서 제공하는 튜빙 키트, 로딩 용액, 생검 세척 용액</td><td></td></tr><tr><td>유리화 매체</td><td>Kitazato</td><td>VT801</td><td>평형 및 유리화 용액</td></tr><tr><td>온난화 매체</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>해동 및 희석 용액</td></tr></tbody></table>

인간 배반포 생검 및 유리화

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Blastocyst 생검은 착상 전 유전 시험을 가진 IVF 주기 도중 믿을 수 있는 유전 진단을 얻기 위하여 실행됩니다. 그런 다음, 이상적인 워크플로우에는 진단 기술의 처리 시간으로 인해 안전하고 효율적인 유리화 프로토콜이 수반되고, 선택된 배아를 다음과 같은 자연 주기에서 생리적 자궁 내막상으로 이송한다. 조나 펠루시다의 순차적 개방과 5-10 개의 영양 토내 세포 (이상적으로 7-8)의 검색을 포괄하는 생검 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 환경 조건에 모두 제한합니다. 적절한 훈련 후, 이 기술은 생검의 타이밍 (~8 분, 접시 당 생검에 대한 배아의 수에 따라 3-22 분 범위), 최종 진단을 얻은 (~ 97.5 %)에 걸쳐 다른 운영자에 걸쳐 재현 가능했다 그리고 생생한 출산율은 유혈모세포 전이(>40%)입니다. 생검, 유리화 및 온난화 후 생존율은 99.8%로 높았다. 온난화에서 1.5 h에서 재 팽창 속도 는 97%로 높았다, 주로 생검과 유리화 사이의 타이밍에 의존 (이상적으로 ≤30 분), 배반 세포 형태학적 품질과 생검의 날. 일반적으로 붕괴 된 배반포를 vitrify하는 것이 좋습니다. 따라서, 비 PGT 주기에서, 레이저 지원 인공 수축 은 동결 보존 전에 배아 붕괴를 유도하기 위해 수행 될 수있다. 가장 유망한 미래 관점은 배아 DNA의 가증한 근원으로서 배반포 배양 후 IVF 배양 배지의 비침습적 분석이다. 그러나 이 잠재적아방가르드는 아직 조사 중이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 정의하고 검증해야 합니다.

도 6은 프로토콜을 표준화하고 각 작업자의 성능을 모니터링하기 위해 채택될 수 있는 생검 절차의 모든 결과의 체계를 나타낸다. 주요 절차 결과는 생검 / 생검을 완료하는 타이밍입니다; 주요 기술적 인 결과는 결정적 이거나 결정적인 진단을 초래할 수있는 유전자 검사 후 생성 된 플롯의 품질이며, 후자는 진단되지 않은 배반포의 재생검을 필요로합니다. 주요 생물학적 결과는 온난화 후 저온 생존 및 재팽창 대 변성의 속도; 마지막으로, 주요 임상 결과는 유리화 된 배반포 전달 후 의 출생 률입니다. 3개의 이전 연구 결과에서는 기술, 생물학 및 임상 결과를 위한 중앙에 정의된 KPI를보고했습니다 11,13,16. 여기서는 생검 시기에 대한 KPI가 어떻게 정의...

배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

배아세포 생검과 병신은 IVF의 혁명이었으며, 체외 수정은 전 세계의 배아학자들이 태아에 대한 최소한의 위험으로 인간 배아에 대한 사전 이식 유전자 검사를 수행할 수 있게 해 주었으며, 이는 전 세계의 배아학자들이 태아에 대한 최소한의 위험으로 인간 배아에 대한 사전 이식 유전자 검사를 수행할 수 있게 해주였습니다. 트로페토더럼 생검은 완전히 자란 배아에서 약 7개의 세포를 회수할 수 있게 하여 강력한 다운스트림 유전 분석을 가능하게 합니다. 또한, 이 접근 방식에 대한 영향은 현재까지 표시되지 않았습니다.이 워크플로우의 임상 효율성을 통해 단조로운 상태와 발동구 내 의 염색체 이상이 발생할 위험이 증가한 모든 환자가 이식 전 유전자 검사의 혜택을 누릴 수 있습니다. 배아 선택의 현재 전략을 개선하기위한 여지가 여전히있다. 예를 들면, miRNomic 및 proteomic 프로파일링은 단 하나 trophectoderm 생검에 전 이식 유전자 시험을 보완하기 위하여 흥미로운 선택권을 나타냅니다.경험이 없는 운영자는 종종 조나 펠루치다를 열고 관통하는 데 어려움을 겪습니다. 그것은 단지 초점의 문제입니다. 배반체, 레이저 목표 및 파이펫은 동일한 초점 평면에 있어야합니다.생검 접시를 환자의 세부 사항으로 표시한 후, 영구, 무독성 마커로, 배아와 사이클 ID를 가진 HEPES 완충 배지의 각 10 마이크로리터 드롭을 배아 및 사이클 ID로 번호.300 마이크로미터 스트리핑 파이펫을 사용하여, 생검 접시의 첫 번째 드롭으로 실행 가능하고 완전히 확장된 blastocyst를 생검 접시의 첫 번째 드롭으로 옮기고, 제2의 배설물을 제거하기 전에 배수를 제거하는 데 사용할 수 있다. 반전 된 현미경 아래에 접시를 놓고 생검 접시의 세 번째 방울에서 배지로 생검 파이펫을 프라임합니다. 배율의 20배 하에서, 7시에 내세포 질량의 명확한 시야를 얻고, 지주 파이펫상 배아를 고정시키기 위해 배반제를 지향한다.피펫과 배반구가 모두 같은 초점 평면에 있도록 조나 펠루치다에 초점을 맞춥니다. 레이저 목표로 전환하고, 내부 세포 질량의 반대쪽에 조나 펠루시다에 레이저 포인터를 배치합니다. 조나 펠루치다를 2~3개의 레이저 펄스로 드릴링하고, 조나 펠루시다에 대한 생검 파이펫을 부드럽게 눌러 내부 표면에서 트로페토데름 세포를 분리하는 위반을 통해 배지를 날려버릴 수 있도록 합니다.트로페토더름이 분리되면 구멍을 통해 들어가 7-8개의 트로페토데름 세포를 부드러운 흡입으로 생검 파이펫으로 흡인시합니다. 적당한 흡입기를 적용하여 표적 세포를 스트레칭하는 동안 생검 파이펫을 뒤로 이동하고 레이저를 흡인 세포의 가장 얇은 부분을 향해 지시합니다. 태아의 몸에서 표적 세포를 분리하기 위하여 세포 사이 접합에 2 5 개의 레이저 펄스를 발사합니다.트로페토더럼 파편이 배반세포에서 분리되었을 때, 파편이 생검 파이펫으로 다시 빨려 들어가는 것을 방지하기 위해 발아세포에서 멀리 떨어진 동일한 생검 드롭으로 조각을 방출하십시오. 포스팅 파이펫에서 배반구를 풀어주면 즉시 두 파이펫을 올려 조각이 파이펫에 달라붙지 않도록 합니다. 그런 다음 품질 관리 목적으로 생검 조각을 이미지화하십시오.모든 배반체가 방금 입증된 대로 생검을 생검할 때 생검 접시를 라미나르 흐름 후드로 옮기고 생검 후 문화 요리를 부부 ID로 표시하고 배아및 주기 ID로 각 방울을 표시합니다. 증인이있는 경우 깨끗한 IVF 배지에서 배반구를 헹구고 배반구를 생검 후 접시에 해당하는 드롭으로 옮습니다. 그런 다음 생검 후 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 6%, 산소 인큐베이터 5%에 놓습니다.상온에서 증인이 있고 라미나르 유동 후드 내부에 는 PCR 튜브에 영구적이고 독성이 없는 마커로 라벨을 붙입니다. 생검 배아 아이디와 함께 60 x 15mm 튜브 배양 접시의 뚜껑을 라벨, 접시에 생검 세척 용액의 두 방울을 추가합니다. 스테레오 현미경 아래 튜브 접시의 두 번째 드롭에서 생검 세척 솔루션으로 140 마이크로 미터 스트리핑 파이펫을 프라임 트로페토데름 조각을 시각화합니다.트류페토데름 조각에 일부 생검 세척 용액을 부드럽게 방출하고 조각을 스트리핑 파이펫에 적재합니다. 생검 세척 용액의 두 번째 방울로 조각을 이동하고 조심스럽게 조직을 2 ~ 3 번 헹. 트로페토데름 조각을 로딩 용액으로 적절하게 표지된 PCR 튜브의 바닥으로 옮기고, 스트리핑 파이펫 끝으로 튜브의 벽을 만지지 않도록 주의하십시오.모든 조각이 튜브에 추가되면, 조각을 퇴적시키기 위해 몇 초 동안 작은 원심분리기에서 모든 튜브를 회전시. 그런 다음 시험을 위해 참조 유전 실험실로 배송 될 때까지 샘플을 영하 20도에서 저장합니다. 트로페토더럼 생검의 30 분 이내에, 환자의 세부 사항과 유리화되어야 하는 배반신낭의 아이디와 함께 유리화 판을 라벨.특수 한 온도 방지 냉동 라벨을 사용 하 여, 유리화 는 환자의 이름과 성, 커플 ID, 그것에 로드 될 태아의 ID, 그리고 절차의 날짜와 함께 지원 레이블. 실온에서, 각 blastocyst에 대한 평형 솔루션300 마이크로리터를 분배하고, 증인이 있을 때, 300 마이크로미터 스트리핑 파이펫을 사용하여 발아구를 한 부피액으로 이동시합니다. 13~15분 동안 포스팅제를 평형 용액에 둡니다.볼륨의 초기 축소 후, 점진적 재확장이 관찰될 것입니다. 평형의 끝에서, 진동 판의 두 번째 우물에 300 마이크로 리터의 유리화 용액을 추가하고 1 분 동안 유리화 용액에 완전히 다시 확장 된 blastocyst를 전송합니다. 인큐베이션의 끝에서, 포다이스트를 헹구어 평형 용액을 희석시키고, 증인이 있는 경우, 발아제를 유리화 지지에 적재한다.바이트로피케이션 의 과잉을 제거합니다. 미묘한 용액 필름은 배반물을 둘러싸고 있어야합니다. 유리화 지지체를 액체 질소로 급락시키고, 시편에 가까운 기포 형성위험을 줄이기 위해 지지체를 적극적으로 이동한다.그런 다음 유리화 지지체가 여전히 액체 질소에 잠긴 상태에서 보호 캡을 지지에 놓습니다. 1의, 544 trophectoderm 생검 절차는 이 대표적인 2 년 기간 동안, 1 에서 4 개의 blastocysts 사이 절차 당 3 에서 22 분 사이 생검했다. 이 플롯에서, 연구 삼보격을 따라 각 연산자의 생검의 평균 타이밍이 8.24 분의 평균 전체 값으로 표시됩니다.결정적 진단의 원인이 단편의 치수 및/또는 품질, 튜브, 또는 유전 실험실에서 샘플의 처리에 있는 몇몇 문제점에 부과되는지 평가하기 위하여 품질 관리를 위한 각 생검 단편의 심상을 취득하는 것이 도움이 됩니다. 이 연구에서는, 572 유스포이드 블라토사이클리스트는 유청증의 진단 후 배아 이식을 받기 위해 따뜻해졌다. 모든 배반구는 30분 이내에 진동했으며, 배반구의 2.4%는 31분에서 90분 사이로 다시 확장되지 않고 4.9%는 재동에서 90분을 넘어 다시 확장되지 않았습니다.특히 품질이 좋지 않거나 7일째에 생검과 병용성 사이의 타이밍이 온난화 후 재확장을 달성하는 데 매우 중요한 것으로 보입니다. 트로페토데름 세포와 발사 사이의 접합부를 노출할 때 조나 펠루치다를 열기 전에 초점을 맞추고, 또한 발아세포재확장을 방지하여 진동하기 전에 주의를 기울인다. 두 개의 다른 배반성 생검 접근이 존재, 모두 조나 펠루치다 개방을 수반하고 트로페토데름 세포의 자발적인 아치를 기다리고.이러한 접근 방식은 더 쉽지만 더 많은 조작이 필요하며 시간이 많이 걸립니다. 이 워크플로우의 효능은 배아 전이 전에 이식할 가능성이 가장 높은 배반구를 선택하기 위해 IVF에서 분자 기술의 구현을 가능하게 합니다. 배아에 독성이 있을 수 있는 장치나 용액을 사용하지 말고 DNA가 없는 물질을 사용하여 DNA 오염을 방지하십시오.

human-blastocyst-biopsy-and-vitrification

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

보조 생식 기술 (ARTs)은 결과를 개선 하 고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가를 하 고 있습니다. 이 원고는 인간 재생의 이상적인 동물 모델로 서 토끼의 사용을 허용 하는 효율적인 냉동 보존 프로토콜을 가진 최소 침 습 배아 전달 절차를 설명 합니다.

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.

Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

본 연구는 배아 생검을 피하고 NGS를 사용하여 염색체 ploidy 식별을 가능하게 하는 폐배양 배지를 사용하는 인간 배아의 염색체 스크리닝 프로토콜을 보고합니다. 본 논문에서는 배양액 제조, 전장 유전체 증폭(WGA), 차세대 염기서열분석(NGS) 라이브러리 준비, 데이터 분석 등 자세한 절차를 제시한다.

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.

제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

여기에서는 홈메이드 주걱으로 구성되고 홈메이드 솔루션을 활용하여 마우스와 양의 착상 전 배아를 유리화하기 위한 Spatula Montevideo 프로토콜을 제시합니다. 배아는 농도가 증가하는 두 개의 동결 보호 용액에서 빠르게 평형을 이루고, 주걱에 적재되고, 액체 질소에 담근 다음, 최종적으로 0.5mL 빨대로 밀봉됩니다.

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

다음은 기존의 생물 안전성 캐비닛 및 인큐베이터를 대체하여 최대한의 무균성과 재현성을 허용하는 밀폐된 세포 배양 시스템에서 만능 줄기 세포(PSC) 및 신경 줄기 세포(NSC)를 성장시키는 프로토콜입니다. 이 장비는 cGMP(Clinical Good Manufacturing Practice) 및 cGLP(Clinical Good Lab Practice) 지침을 충족합니다.

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

배우세요 인간 배반포 생검 및 유리화 기술을 통해 배아 유전자 검사를 수행하는 방법을. 이 기법은 영양외배엽 세포를 채취하여 유전 분석을 가능하게 하며, 배아에 대한 위험을 최소화합니다.

인간 배반포 생검 및 유리화

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