인간 배반포 생검 및 유리화

배아세포 생검과 병신은 IVF의 혁명이었으며, 체외 수정은 전 세계의 배아학자들이 태아에 대한 최소한의 위험으로 인간 배아에 대한 사전 이식 유전자 검사를 수행할 수 있게 해 주었으며, 이는 전 세계의 배아학자들이 태아에 대한 최소한의 위험으로 인간 배아에 대한 사전 이식 유전자 검사를 수행할 수 있게 해주였습니다. 트로페토더럼 생검은 완전히 자란 배아에서 약 7개의 세포를 회수할 수 있게 하여 강력한 다운스트림 유전 분석을 가능하게 합니다. 또한, 이 접근 방식에 대한 영향은 현재까지 표시되지 않았습니다.

이 워크플로우의 임상 효율성을 통해 단조로운 상태와 발동구 내 의 염색체 이상이 발생할 위험이 증가한 모든 환자가 이식 전 유전자 검사의 혜택을 누릴 수 있습니다. 배아 선택의 현재 전략을 개선하기위한 여지가 여전히있다. 예를 들면, miRNomic 및 proteomic 프로파일링은 단 하나 trophectoderm 생검에 전 이식 유전자 시험을 보완하기 위하여 흥미로운 선택권을 나타냅니다.

경험이 없는 운영자는 종종 조나 펠루치다를 열고 관통하는 데 어려움을 겪습니다. 그것은 단지 초점의 문제입니다. 배반체, 레이저 목표 및 파이펫은 동일한 초점 평면에 있어야합니다.

생검 접시를 환자의 세부 사항으로 표시한 후, 영구, 무독성 마커로, 배아와 사이클 ID를 가진 HEPES 완충 배지의 각 10 마이크로리터 드롭을 배아 및 사이클 ID로 번호.300 마이크로미터 스트리핑 파이펫을 사용하여, 생검 접시의 첫 번째 드롭으로 실행 가능하고 완전히 확장된 blastocyst를 생검 접시의 첫 번째 드롭으로 옮기고, 제2의 배설물을 제거하기 전에 배수를 제거하는 데 사용할 수 있다. 반전 된 현미경 아래에 접시를 놓고 생검 접시의 세 번째 방울에서 배지로 생검 파이펫을 프라임합니다. 배율의 20배 하에서, 7시에 내세포 질량의 명확한 시야를 얻고, 지주 파이펫상 배아를 고정시키기 위해 배반제를 지향한다.

피펫과 배반구가 모두 같은 초점 평면에 있도록 조나 펠루치다에 초점을 맞춥니다. 레이저 목표로 전환하고, 내부 세포 질량의 반대쪽에 조나 펠루시다에 레이저 포인터를 배치합니다. 조나 펠루치다를 2~3개의 레이저 펄스로 드릴링하고, 조나 펠루시다에 대한 생검 파이펫을 부드럽게 눌러 내부 표면에서 트로페토데름 세포를 분리하는 위반을 통해 배지를 날려버릴 수 있도록 합니다.

트로페토더름이 분리되면 구멍을 통해 들어가 7-8개의 트로페토데름 세포를 부드러운 흡입으로 생검 파이펫으로 흡인시합니다. 적당한 흡입기를 적용하여 표적 세포를 스트레칭하는 동안 생검 파이펫을 뒤로 이동하고 레이저를 흡인 세포의 가장 얇은 부분을 향해 지시합니다. 태아의 몸에서 표적 세포를 분리하기 위하여 세포 사이 접합에 2 5 개의 레이저 펄스를 발사합니다.

트로페토더럼 파편이 배반세포에서 분리되었을 때, 파편이 생검 파이펫으로 다시 빨려 들어가는 것을 방지하기 위해 발아세포에서 멀리 떨어진 동일한 생검 드롭으로 조각을 방출하십시오. 포스팅 파이펫에서 배반구를 풀어주면 즉시 두 파이펫을 올려 조각이 파이펫에 달라붙지 않도록 합니다. 그런 다음 품질 관리 목적으로 생검 조각을 이미지화하십시오.

모든 배반체가 방금 입증된 대로 생검을 생검할 때 생검 접시를 라미나르 흐름 후드로 옮기고 생검 후 문화 요리를 부부 ID로 표시하고 배아및 주기 ID로 각 방울을 표시합니다. 증인이있는 경우 깨끗한 IVF 배지에서 배반구를 헹구고 배반구를 생검 후 접시에 해당하는 드롭으로 옮습니다. 그런 다음 생검 후 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 6%, 산소 인큐베이터 5%에 놓습니다.

상온에서 증인이 있고 라미나르 유동 후드 내부에 는 PCR 튜브에 영구적이고 독성이 없는 마커로 라벨을 붙입니다. 생검 배아 아이디와 함께 60 x 15mm 튜브 배양 접시의 뚜껑을 라벨, 접시에 생검 세척 용액의 두 방울을 추가합니다. 스테레오 현미경 아래 튜브 접시의 두 번째 드롭에서 생검 세척 솔루션으로 140 마이크로 미터 스트리핑 파이펫을 프라임 트로페토데름 조각을 시각화합니다.

트류페토데름 조각에 일부 생검 세척 용액을 부드럽게 방출하고 조각을 스트리핑 파이펫에 적재합니다. 생검 세척 용액의 두 번째 방울로 조각을 이동하고 조심스럽게 조직을 2 ~ 3 번 헹. 트로페토데름 조각을 로딩 용액으로 적절하게 표지된 PCR 튜브의 바닥으로 옮기고, 스트리핑 파이펫 끝으로 튜브의 벽을 만지지 않도록 주의하십시오.

모든 조각이 튜브에 추가되면, 조각을 퇴적시키기 위해 몇 초 동안 작은 원심분리기에서 모든 튜브를 회전시. 그런 다음 시험을 위해 참조 유전 실험실로 배송 될 때까지 샘플을 영하 20도에서 저장합니다. 트로페토더럼 생검의 30 분 이내에, 환자의 세부 사항과 유리화되어야 하는 배반신낭의 아이디와 함께 유리화 판을 라벨.

특수 한 온도 방지 냉동 라벨을 사용 하 여, 유리화 는 환자의 이름과 성, 커플 ID, 그것에 로드 될 태아의 ID, 그리고 절차의 날짜와 함께 지원 레이블. 실온에서, 각 blastocyst에 대한 평형 솔루션300 마이크로리터를 분배하고, 증인이 있을 때, 300 마이크로미터 스트리핑 파이펫을 사용하여 발아구를 한 부피액으로 이동시합니다. 13~15분 동안 포스팅제를 평형 용액에 둡니다.

볼륨의 초기 축소 후, 점진적 재확장이 관찰될 것입니다. 평형의 끝에서, 진동 판의 두 번째 우물에 300 마이크로 리터의 유리화 용액을 추가하고 1 분 동안 유리화 용액에 완전히 다시 확장 된 blastocyst를 전송합니다. 인큐베이션의 끝에서, 포다이스트를 헹구어 평형 용액을 희석시키고, 증인이 있는 경우, 발아제를 유리화 지지에 적재한다.

바이트로피케이션 의 과잉을 제거합니다. 미묘한 용액 필름은 배반물을 둘러싸고 있어야합니다. 유리화 지지체를 액체 질소로 급락시키고, 시편에 가까운 기포 형성위험을 줄이기 위해 지지체를 적극적으로 이동한다.

그런 다음 유리화 지지체가 여전히 액체 질소에 잠긴 상태에서 보호 캡을 지지에 놓습니다. 1의, 544 trophectoderm 생검 절차는 이 대표적인 2 년 기간 동안, 1 에서 4 개의 blastocysts 사이 절차 당 3 에서 22 분 사이 생검했다. 이 플롯에서, 연구 삼보격을 따라 각 연산자의 생검의 평균 타이밍이 8.24 분의 평균 전체 값으로 표시됩니다.

결정적 진단의 원인이 단편의 치수 및/또는 품질, 튜브, 또는 유전 실험실에서 샘플의 처리에 있는 몇몇 문제점에 부과되는지 평가하기 위하여 품질 관리를 위한 각 생검 단편의 심상을 취득하는 것이 도움이 됩니다. 이 연구에서는, 572 유스포이드 블라토사이클리스트는 유청증의 진단 후 배아 이식을 받기 위해 따뜻해졌다. 모든 배반구는 30분 이내에 진동했으며, 배반구의 2.4%는 31분에서 90분 사이로 다시 확장되지 않고 4.9%는 재동에서 90분을 넘어 다시 확장되지 않았습니다.

특히 품질이 좋지 않거나 7일째에 생검과 병용성 사이의 타이밍이 온난화 후 재확장을 달성하는 데 매우 중요한 것으로 보입니다. 트로페토데름 세포와 발사 사이의 접합부를 노출할 때 조나 펠루치다를 열기 전에 초점을 맞추고, 또한 발아세포재확장을 방지하여 진동하기 전에 주의를 기울인다. 두 개의 다른 배반성 생검 접근이 존재, 모두 조나 펠루치다 개방을 수반하고 트로페토데름 세포의 자발적인 아치를 기다리고.

이러한 접근 방식은 더 쉽지만 더 많은 조작이 필요하며 시간이 많이 걸립니다. 이 워크플로우의 효능은 배아 전이 전에 이식할 가능성이 가장 높은 배반구를 선택하기 위해 IVF에서 분자 기술의 구현을 가능하게 합니다. 배아에 독성이 있을 수 있는 장치나 용액을 사용하지 말고 DNA가 없는 물질을 사용하여 DNA 오염을 방지하십시오.