Name: 시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 시험관 내 전사된 RNA 기반 루시퍼라제 검정법으로 포크스바이러스 감염 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기법은 5'UTR과 3'UTR 같은 시스 요소의 역할을 분석하여 바이러스 번역 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 프로젝트는 지 부 및 존슨 암 연구 센터 (http://cancer.k-state.edu)에 의해 부분적으로 PD에 대학원 학생 여름 급여의 형태로 건강의 국립 연구소 (AI128406 www.nih.gov)에 의해 투자 되었다.

1. 시험관 내 전사 를 위한 PCR에의 한 DNA 템플릿 제조
<ol><li>PCR에 의해 DNA 템플릿을 제조 하기 위해, 프라이 머를 설계 하였다. 프라이 머를 설계 할 때 뇌관 길이, 어 닐 링 온도 (Tm), GC 내용, G 또는 C 등으로 3 끝과 같은 중요 한 특성을 고려 참고: 이들 문헌25,26,27에서 상세히 논의 한다.</li>
	<li>다음 원소를 포함 하는 PCR 앰 플 아이콘을 생성 하는 프라이 머를 설계 하 여 5 ' 내지 3 ' 방향: T7, 폴 리 (A) 리더, 반딧불 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (A) 꼬리는 T7_12A로 서 지칭 된다. 디자인 프라이 머 (정방향 및 역방향)는 템플릿 DNA에 존재 하지 않는 모든 부가적인 원소 들을 포괄 한다 (도 2a). 참고: 모든 요소의 시퀀스는 표 1 에서 찾을 수 있습니다.
</li>
	<li>앞으로 프라이 머 (5T7 ')28의 추가 뉴클레오티드를 포함 하 고, 상기 리포터 유전자의 5 ' 말단에 상응 하는, UTR 서 열 및 약 20 개 뉴클레오티드를 기준으로 하 여, tm에 기초 하 여 조정 된 다. Orf. 프라이 머에 상응 하는 영역이 유전자의 센스 가닥 (+ 가닥)과 동일한 지 확인 한다. 참고: 긴 5 '-UTR의 경우, 두 개의 DNA 단편을 합성 합니다: T7 프로모터를 가진 하나는 리포터 유전자의 ORF과 함께 긴 5 '-UTR 및 두 번째. 이 두 단편을 중첩 확장 PCR29를 사용 하 여 결합 합니다.</li>
	<li>폴 리 (A) 꼬리와 약 20 개의 뉴 클레 오타 이드를 포함 하는 역방향 프라이 머 (5M.3t)는 리포터 유전자의 ORF의 3 ' 말단에 상응 하는 Tm에 기초 하 여 조정 한다. 프라이 머에서 상응 하는 영역이 폴 리 (A) 꼬리에 존재 하는 유전자의 안티 센스 가닥 (가닥)과 동일한 인-프레임 정지 코 돈을 확인 한다. 참고: 폴 리 (A) 지시선 또는 폴 리 (A) 꼬리의 원하는 길이는 프라이 머에서 사용자 정의 할 수 있다. 예를 들어 폴 리 (A) 꼬리에 50 A를 추가 하려면 역방향 프라이 머가 50 T의 것을 수반 해야 합니다. 마찬가지로, 폴 리 (A) 리더에 20A의를 추가 하기 위해, 전방 프라이 머는 20 A의를 수반 한다.</li>
	<li>내부 제어를 위하여, 다음 원소 들을 5 ' 내지 3 ' 방향으로 포함 하는 또 다른 프라이 머 세트를 설계 한다: T7 프로모터, 코자크 서 열을 포함 하는 랜덤 한 5 '-UTR 코딩 서 열, 렌 딜 로 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (a) 꼬리는 하기에서 언급 되었다 T7_ 고 자크-루크.</li>
	<li>PCR 튜브에서 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase 자유 물, 2 배의 고 충실도 DNA 중 합 효소, 프라이 머 및 서 열 루시퍼 라 제 템플릿 DNA를 확인 하였다 (표 2). 참고: 혼합물 내의 개별 성분의 양은 반응 부피에 따라 조정 되어야 한다.</li>
	<li>표 3에 나타난 바와 같이 표준 3 단계 (변성, 어 닐 링, 연장) PCR 주기를 사용 하 여 DNA 템플릿을 생성 한다. 참고: 소 둔 온도 X ° c는 사용 되는 프라이 머 세트 및 연장 시간 T min에 의존 하 여 PCR 증폭 크기 및 사용 된 DNA 중 합 효소에 의존 한다.</li>
	<li>Pcr 산물의 5-10%를 상업적으로 이용 가능한 분자량 표준에 따라 1% 아가 로스 트리 스 아세테이트 EDTA (태) 겔 전기 영동으로 실행 하 여 pcr 생성 물을 검출 한다. UV 조명 아래에서 겔을 시각화 하 여 PCR 산물의 크기를 결정 한다.</li>
	<li>PCR 산물의 정확한 크기를 결정 한 후에, T7_12A-Fluc 및 T7_Kozak에 대해 1.0 kb에 대해 ~ 1.7 kb, 시판 되는 PCR 정제 키트를 사용 하 여이를 정제 한다. 100 µ L 뉴 클레 아 제 자유 물을 사용 하 여 DNA를 용 수 (그림 2b).</li>
	<li>일단 정제 되 면 분 광 광도 계를 이용 하 여 DNA의 농도를 확인 하 고 A260/A280 비율을 결정 한다 (~ 1.8-2.0은 허용 가능).</li>
	<li>정제 된 DNA를-20°c에서 저장 하거나 즉시 시험관 내 전사에 사용 한다.</li>
</ol>2. 시험관 내 전사에의 한 mRNA 생성
<ol><li>
시험관 내에서 PCR 산물 로부터 RNA를 합성 하 고, 시험관 내 전사 키트를 사용 한다 (도 3a). 참고: T7_12A-fluc 및 T7_Kozak-RLUC DNA 템플릿은 각각 12a-Fluc 및 코자크 Rluc mRNAs를 합성 하는 데 사용 됩니다.<ol>
<li>이를 위해 마이크로 원심 분리기 튜브를가지고 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase-RNase가 없는 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, 템플릿 PCR 제품, T7-RNA 중 합 효소 혼합물 (표 4). 참고: 다른 캡 핑 시스템은 또한 제조자의 지시에 따라 시험관 내 전사 후에 RNA를 순차적으로 캡으로 사용할 수 있다.</li>
		<li>2 시간 동안 37 ° c에서 철저히 혼합 하 고 배양 하십시오.</li>
		<li>RNA 정제 키트를 이용 하 여 합성 된 RNA의 정제를 진행 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정제 된 RNA를 1.5%의 스 트리 보 레이트-EDTA (TBE) 젤 (0.5 µ)으로 실행 하 여 RNA를 확인 하였다. UV 조명 아래에서 젤을 시각화 합니다 (그림 3b).</li>
	<li>분 광 광도 계를 이용 하 여 RNA의 농도를 확인 하 고 A260/A280 비율 (~ 1.8-2.0은 허용 가능)을 확인 한다.</li>
	<li>정제 된 RNA를 분 취 하 고-80 ° c에서 저장 한다.</li>
</ol>3. 세포에 형질 주입 mRNA
<ol><li>24 웰 플레이트에 있는 종자 헬 라 세포 (약 ~ 80-90%의 콘 유창 다음 날) 및 5% CO2로 37 ° c에서 인큐베이터에서 밤새 배양 한다.</li>
	<li>감염의 다중성에 (VACV) 백 시 니 아 바이러스로 헬 라 세포를 감염 (MOI) 5 또는 비교를 위한 감염 되지 않은 헬 라 세포를 유지. 참고: MOI는 세포 당 전염 성 바이러스 입자의 수입니다.</li>
	<li>X의 모이 (세포 수 * X)/바이러스 역가 1000} µ 바이러스의 1 mL 배지 당.</li>
	<li>
바람직한 h 사후 감염 (hpi) (10-12 hpi에서 본 실험에서), 도 3c에 도시 된 바와 같이 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 사용 하 여 형질 주입 mrna (24 웰 플레이트의 웰 당 총 mrna의 500 ng).
	<ol>
<li>24 웰 플레이트의 웰에 대해서는, 1 개의 마이크로 원심 분리기 튜브에 루시퍼 라 제의 12A 시퀀스 베어링 반딧불이 및 20 ng의 코자크 서 열 베어링 Renilla 루시퍼 라 제 (kozak-rluc) mrna를 혼합 480 ng. 또 다른 마이크로 원심 분리기 튜브에는 양이온 성 지질 형질 감염 시 약의 1.1 µ L을 추가 합니다.</li>
		<li>두 튜브에 55 µ L의 감소 된 혈 청 배지를 추가 합니다. 상 온에서 5 분간 혼합 하 여 배양 한다.</li>
		<li>인큐베이션의 5 분 후에, 55 µ L 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 포함 하는 mRNA에서 감소 된 혈 청 배지를 함유 하는 튜브를 첨가 한다.</li>
		<li>부드럽게 하지만 철저히 혼합 하 고 실 온에서 15 분간 배양 합니다.</li>
		<li>배양 동안, 세포 배양 액을 제거 하 고 24 웰 플레이트의 웰 당 감소 된 혈 청 배지를 400 µ L을 첨가 한다.</li>
		<li>배양 후, 혼합물의 100 µ L을 24 웰 플레이트의 웰에 고르게가 하 여 첨가 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 루시퍼 라 제 활동 측정
<ol><li>5 시간 후 12A-Fluc 및 Kozak-Rluc mRNA의 공동 형질 전환-2 개의 리포터 분석 (예컨대, 이중 루시퍼 라 제 리포터 분석 키트)을 수행할 수 있는 루시퍼 라 제 분석 시스템을 사용 하 여 루시퍼 라 제 활성을 측정 한다.</li>
	<li>감소 된 혈 청 배지를 제거 하 고 150 µ L 1x 용 해 완충 액을 추가 하 여 세포를 lyse, 루시퍼 라 제 분석 키트의 구성 요소.</li>
	<li>실 온에서 10 분간 인큐베이션 한 후, 세포를 스크 래핑 하 여 파쇄 물을 수집 하 고 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>파쇄 물을 12000 x g 에서 4°c에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛 세포 파편으로 한다.</li>
	<li>고체 바닥으로 불투명 벽 96 잘 흰색 분석 판에 상층 액의 30 µ L을 추가 합니다.</li>
	<li>루시퍼 라 제 분석 키트 및 다중 모드 플레이트 리더 루미 노 미터를 사용 하 여 이중 발광을 측정 하십시오.</li>
	<li>표 5에 설명 된 설정을 사용 하 여 역학 기능 (well 기준)을 사용 하 여 측정을 수행 합니다. 참고: 독서는 또한 수동 루미 노 미터를 사용 하 여 촬영 할 수 있습니다. 큐 벳에 Fluc에 대 한 용 해물과 기질을 동량 추가 합니다. 2 초 동안 기다렸다가 루미 노 미터를 사용 하 여 10 초 동안 측정 합니다. Fluc 측정에 따라 루미 노 미터에서 큐 벳을 빠르게 꺼내 수동으로 Rluc 용 기판의 동량을 추가 합니다. 다시, 2 s를 기다린 루미 노 미터를 사용 하 여 10 s에 대 한 측정 합니다.</li>
	<li>형광 판독 데이터를 바람직한 파일 형식으로 내보냅니다.</li>
	<li>내부 대조 Rluc 값에 의해 Fluc 값을 분할 하 여 감염 되지 않은 및 VACV 감염 된 헬 라 세포에서 12A-Fluc mRNA 로부터 상대적인 번역 속도를 결정 한다. 참고: 보충 그림 1 은 상대적인 fluc 활동을 얻기 위해 원시 데이터의 단계별 분석을 보여줍니다.</li>
</ol>

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<li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862(2018).</li>
<li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁 금융 이익을 선언 하 고 싶습니다.

모든 4-코어 단계는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 성공에 매우 중요 합니다. 특히 T7 프로모터 서 열에 대 한 프라이 머 디자인에 특별 한 주의가 주어져야 한다. T7 RNA 중 합 효소는 T7 프로모터의 밑줄이 그어진 첫 번째 G (gGG-5'-UTR) 로부터 전사를 시작 하 여 5 ' UTR 서 열 전에 첨가 하였다. 전사 개시 사이트 (TSS)는 5 ' 말단에서 제 1 G 로부터 시작 하지만, T7 프로모터 영역에서의 G의 3 미만의 수를 감소 시키면 RNA를 시험관 내 전사에서 수율/산출 하였다. 실험 동안, 우리는 젤 정제 된 DNA 생성물이 수율과 RNA의 질이 더 낮 았 기 때문에 시험관 내 전사에 대 한 최고가 아니었다는 것을 관찰 했습니다. 우리는 1% 아가 로스 겔 전기 영동에서 PCR 반응의 5-10%만을 실행 하 여 나머지 90-95%를 정제 하 고, PCR 정제 키트를 사용 하 여, 시험관 내 전사에 사용 될 수 있다. PCR 로부터 비 특이 적 증폭의 경우,...

중앙 교리에 따르면, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 그리고 마침내 단백질1,2로 흐릅니다. 유전 정보의이 흐름은 mRNA 번역3을포함 하 여 많은 수준에서 높게 통제 됩니다,4. 유전자 발현 조절을 측정 하기 위한 리포터 분석의 개발은이 과정에 관여 하는 규제 메커니즘의 이해를 용이 하 게 한다. 여기서 우리는 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법을 사용 하 여 mRNA 번역을 연구 하는 프로토콜을 설명 한다.
폭스 바이러스는 많은 매우 위험한 인간과 동물 병원 균을 포함 한다5. 다른 모든 바이러스 처럼, 폭스 바이러스 독점적으로 단백질 합성에 대 한 호스트 세포 기계에 의존6,7,8. 바이러스 성 단백질을 효율적으로 합성 하기 위해 바이러스는 세포 중개 기계를 납치 하 여 바이러스 mrnas7,8의 번역을 위해이를 리디렉션하는 많은 전략을 진화 시켰습니다. 바이러스에 의해 일반적으로 채택 되는 기계 장치는 그들의 전사체에 있는 cis행동 요소를 사용 하는 것입니다. 주목할 만한 예로는 내부 리보솜 진입 부위 (에 어) 및 캡 독립적인 번역 증강 인자 (인용),11등이 있다. 이러한 cis요소는 다양 한 기 작12,13,14를 통해 중개 기계를 유치 함으로써 번역 적 우위를 바이러스 전사체를 렌더링 한다. 100 폭스 바이러스 mrnas는 5 ' 미 번역 지역 (UTR)에서 진화 하 여 보존 된 시스-작동 소자를가지고 있으며,이러한 mrnas15의 5 ' 말단에서 5 ' 폴 리 (a) 리더입니다. 이러한 5 '-폴 리 (A) 지도자의 길이는 이종 이며 전사 동안 폭스 바이러스 부호화 RNA 중 합 효소17,18의 미 끄 러 짐에 의해 생성 된다. 우리와 다른 사람들은 최근 5 '-폴 리 (A) 지도자가 백 시 니 아 바이러스 (vacv)에 감염 된 세포에서 mRNA에 번역 이점을 부여 한다는 것을 발견 하였으며,이는 폭스 바이러스19,20의 프로토 타입 부재 이다.
시험관 내 전사 된 RNA 계 루시퍼 라 제 리포터 분석은 처음에 폭스 바이러스 감염19,21동안 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 이해 하기 위하여 개발 되었다. 플라스 미드 DNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법이 널리 사용 되 고 있지만, 폭스 바이러스 감염 세포에서의 결과 해석을 복잡 하 게 하는 몇 가지 단점이 있다. 먼저, 플라스 미드는 VACV 감염 세포 (22)에서 복제할 수 있다. 둘째, 암호화 된 전사는 플라스 미드 DNA18,23,24에서 종종 발생 한다. 셋째, VACV 프로모터 구동 전사는 불균일 한 길이의 폴 리 (A) 리더를 생성 하 여 일부 실험18에서 폴 리 (a) 지시선 길이를 제어 하기 어렵게 한다. 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 이러한 문제를 회피 하 고 데이터 해석은 간단 합니다.
이 방법에는 4 가지 주요 단계가 있습니다. (1) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성 하는 단계; (2) 시험관 내 전사 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 세포에 mRNA를 전달 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출 (그림 1) 얻어진 PCR 증폭은 5 ' ~ 3 ' 방향으로 다음과 같은 요소를 포함 합니다: T7, 폴 리 (a) 리더 또는 원하는 5 ' UTR 서 열, 반딧불 루시퍼 라 제 오픈 리딩 프레임 (ORF) 뒤에 폴 리 (a) 꼬리. PCR 증폭은 T7 중 합 효소를 사용 하 여 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 합성 하는 템플릿으로 사용 된다. 시험관 내 전사 동안, m7G 캡 또는 다른 캡 아날로그는 새로 합성 된 mRNA에 혼 입 된다. 캡 핑 된 전사체는 감염 되지 않은 또는 VACV 감염 된 세포로 형질 전환 된다. 세포 파쇄 액은 형질 감염 후 원하는 시간에 수집 되어 mRNA 로부터 단백질 생산을 나타내는 루시퍼 라 제 활동을 측정 한다. 이 리포터 분석 법은 mRNA의 5 '-UTR, 3 '-UTR 또는 그밖 지구에 있는 cis원소 존재에 의해 번역 규칙을 공부 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 더욱이, 시험관 내 전사 된 RNA-기반 어 세이는 캡 의존적 개시, 캡 독립적 개시, 재 개시 및 아 스와 같은 내부 개시를 포함 하는 번역 개시의 상이한 메커니즘을 연구 하는데 사용 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 마스터 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 구조 아날로그</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>안티 리버스 캡 아날로그 또는 ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 웰 하프 영역 흰색 평면 바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>불투명 벽 96웰 흰색 플레이트(단단한 바닥</td></tr> <tr><td>포함)듀얼 루시페라제 리포터 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>듀얼 루시페라제 분석 키트(DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 사이클 퓨어 키트</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>PCR 정제 키트</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>다중 모드 플레이트 리더 광도계라고 함</td></tr><tr><td>HiScribe T7 빠른 고수율 RNA 합성 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In 체외 전사 키트</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>양이온성 지질 형질주입 시약</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>DNA 및 RNA 농도 측정에 사용</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>저혈청 배지</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA 정제 키트</td></tr><tr><td>Vaccinia 캡핑 시스템</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080</td><td>캡핑 시스템</td></tr></tbody></table>

시험관 내 전사 된 rna-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

바이러스 DNA 복제 후에 전사 된 모든 폭스 바이러스 mRNA는 5 '-UTR의 진화 적으로 보존 된 비 템플릿 기반 5 ' 폴 리 (A) 선두 주자입니다. 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 해 하는 우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 검정을 개발 했습니다. 이 리포터 검정은 4 개의 핵심 단계를 포함 한다: (1) 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 증폭 하는 PCR; (2) 시험관 내 전사 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 시험관 내에서 세포 내로 전사 된 mRNA를 도입 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출. 여기에 설명 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 플라스 미드 로부터 폭스 바이러스에 감염 된 세포 및 비밀 전사의 플라스 미드 복제의 문제를 회피 한다. 이 프로토콜은 폭스 바이러스에 감염 된 세포가 아닌 시스템에서 5 '-UTR 및 3 '-UTR를 포함 한 mRNA의 cis원소에의 한 번역 조절을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 또한이 방법을 사용 하 여 cap 종속, cap 독립적, 다시 시작 및 내부 시작과 같은 다양 한 번역 시작 모드를 조사할 수 있습니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 4 단계: 시험관 내 기록 체에 대 한 DNA 템플릿 생성 PCR, mRNA 트랜스 펙 션 및 루시퍼 라 제 측정을 생성 하는 생체 외 전사, 개략도에서 볼 수 있다 ( 그림 1). DNA 템플릿 (Fluc 및 Rluc) 모두를 위한 프라이 머의 설계 및 오버행 확장 PCR의 일반적인 계획은 도식 적으로 예시 된다 (도 2a). PCR 후, 정확한 크기의 PCR 산물을 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 검출 하였다 (도 2b). 이어서, PCR 산물은 시험관 내에서 RNA를 합성 하는 템플릿으로 서 사용 된다 (도 3a),이는 정제 되 고 tbe 겔 전기 영동으로 실행 되어 크기를 확인 한다 (<str...

우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

시험관 내 전사 RNA 기반 루시파라제 분석법에 대한 당사의 프로토콜은 두우스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구하는 데 도움이 됩니다. 또한 Poly(A) 리터의 사용자 지정 길이를 사용하면 번역에 대한 규제 효과를 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 mRNA의 5'UTR 및 3'UTR 및 광범위한 번역 개시와 같은 Cis 요소에 의한 번역 조절연구를 허용한다는 것입니다.시험관 내 전사 RNA 기반 루시파라제 기자 분석은 캡 및 기타 수정에 대한 수정을 통합하도록 조정되어 번역에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 시작하려면 앞으로 의 선상 및 역방향 프라이머를 설계하여 5'to 3'direction:T7-Promoter에서 다음 요소를 포함하는 PCR 앰플리션을 생성합니다. 폴리(A)리터, T7_12A-Fluc라고 불리는 폴리(A) 꼬리의 반딧불 루시파제 ORF는 앞으로 프라이머에 몇 가지 추가 뉴클레오티드를 포함하고 있으며, 그 다음으로 T7-Promoter Poly(A) 리터 또는 원하는 5'UTR 서열 및 약 20개의 뉴클레오티드가 리포터 유전자의 ORF의 5엔드에 대응하는 것을 포함한다. 리포터 유전자의 ORF의 5엔드에 해당하는 용융 온도에 기초하여 프라이머 길이를 조정하여 프라이머내의 해당 영역이 유전자의 감각 가닥과 동일하도록 한다.그런 다음 폴리(A)꼬리와 약 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 역프라이머를 설계한다. 리포터 유전자의 ORF의 3엔드에 해당하는 용융 온도에 기초하여 조정하여 프라이머의 해당 영역이 유전자의 안티센스 가닥과 동일하고 프레임 내 스톱 코돈이 폴리(A) 꼬리 앞에 존재하도록 한다. 내부 제어를 위해 5'to 3'direction:T7-Promoter, 코작 시퀀스를 포함하는 무작위 5'UTR 코딩 시퀀스, 레닐라 루시파아제 ORF 및 폴리(A)꼬리의 다음 요소를 포함하는 다른 프라이머 세트를 설계하여 T7_Kozak-Rluc라고 합니다.반응을 설정하려면, PCR 튜브에 다음 순서로 시약을 추가: DNase 무료 물, 2배 높은 충실도 DNA 폴리머라제, 프라이머 및 서열 확인 루시포어 템플릿 DNA. 표준 3단계 PCR 주기후 DNA 템플릿을 생성한 후, 분자량 표준과 함께 1%아가로산 TAE 겔 전기포광에서 PCR 반응의 5-10%를 실행하여 PCR 제품을 검출한다. PCR 제품의 크기를 확인하려면 UV 조명기 아래에서 젤을 시각화합니다.PCR 제품의 정확한 크기를 결정한 후, DNA를 용해시키기 위해 100 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 시판되는 PCR 정화 키트를 사용하여 정제한다. 분광광계를 사용하여 정제 된 DNA의 농도를 확인하고 즉시 체외 전사에 사용하기 위해 영하 20도에서 저장하십시오. PCR 제품으로부터 RNA를 합성하기 위해, 마이크로센심분리기 튜브에 다음과 같은 시약을 추가하십시오: DNase-RNase 무료 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, PCR 제품 템플릿 및 시험관 내 전사 키트의 T7-RNA 폴리머라제 믹스.완전히 섞으세요. 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양한 다음 RNA 정화 키트를 사용하여 합성된 RNA의 정제를 진행한다. 정제된 RNA를 확인하려면 RNA를 5분 동안 70도에서 가열하여 이차 구조를 제거하고 1.5 아가로즈 TBE 젤로 실행합니다.그런 다음 UV 조명기 아래에서 젤을 시각화합니다. 분광광계를 사용하여 정제 된 RNA의 농도를 확인하십시오. 알리쿼트하고 영하 80도에 보관하십시오.24개의 웰 플레이트에 있는 종자 HeLa 세포는 다음 날 80-90%의 합류를 달성하고 이산화탄소 5%의 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 하룻밤을 배양합니다. 5의 감염의 복합성에 Vaccinia 바이러스로 HeLa 세포를 감염하고 비교를 위해 감염되지 않은 HeLa 세포를 유지합니다. 그런 다음 10~12시간 동안 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다.원하는 시간 후 감염 후, 혼합 480 12A 서열 베어링 반딧불 루시파제 mRNA와 코자크 서열 베어링 코자크 서열의 20 나노그램 한 마이크로 센트심분리기 튜브에. 또 다른 미세 원심 분리관에서 양이온 지질 경질 시약의 1.1 마이크로 리터를 추가하십시오. 55 마이크로리터의 감소된 혈청 매체를 두 튜브에 넣고 실온에서 5분간 배양합니다.그런 다음 튜브를 포함하는 mRNA에 감소된 혈청 매체를 포함하는 55개의 마이크로리터 양이온 지질 경질 시약을 추가합니다. 피펫과 부드럽게 섞고 실온에서 15분간 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 세포 배양 배지를 세포로부터 제거하고 잘 당 감소된 혈청 배지의 400 마이크로리터를 추가한다.인큐베이션이 완료되면, 혼합물의 100 마이크로리터를 넣고 24웰 플레이트의 웰당 현명하고 균등하게 떨어뜨립니다. 12A Fluc 및 Kozak Rluc mRNA와 5시간 후 의 결합 후, 세포로부터 감소된 혈청 배지를 제거하고 2개의 리포터 분석제를 수행할 수 있는 루시파아제 분석 키트로부터 150마이크로리터 1X 리시스 버퍼를 추가하여 세포를 용해시킨다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 고무와 멸균 주사기를 사용하여 세포를 긁어 내고 미세 원심분리기 튜브로 옮김합니다.세포 파편을 펠릿하기 위해, 12, 000 배 g에서 4섭씨에서 10 분 동안 lysate을 원심분리합니다. 불투명한 벽으로 둘러싸인 96의 웰당 30 마이크로리터를 단단한 바닥으로 옮기는 흰색 분석 플레이트. 루시파라제 분석 키트와 다중 모드 플레이트 판독기 조명계를 사용하여 원고에 설명된 바와 같이 운동 기능을 사용하여 이중 발광을 측정합니다.발광 판독 데이터를 바람직한 파일 형식으로 내보낸 후, 플루크 값을 내부 제어 Rluc 값으로 나누어 감염되지 않은 및 VACV 감염 된 HeLA 세포에서 12A Fluc mRNA에서 상대 적 번역 속도를 결정합니다. 이 분석은 감염되지 않은 및 VACV 감염 된 세포에 5'Poly (A) 리터를 포함하는 Fluc mRNA의 번역 효율을 테스트하는 데 사용되었다. 감염되지 않은 및 VACV 감염된 세포는 모두 성공적으로 Fluc 및 Rluc mRNA와 공동 으로 감염되었습니다.Rluc에 의해 Fluc를 분할하면 세포의 RNA 안정성에서 형질 전환 효율을 정규화했습니다. mRNA를 함유하는 5'Poly(A) 리터는 감염되지 않은 세포에 비해 VACV 감염 시 번역이 이점이 있다. 이는 RNA 수준이 감염되지 않은 및 VACV 감염 세포에서 5시간 후 mRNA 경질 후 유사했기 때문에 차분성 경피 효율 또는 mRNA 안정성 때문이 아니었다.이는 PCR 반응 효율뿐만 아니라 증폭된 DNA를 요구하는 모든 다운스트림 프로세스에도 영향을 줄 수 있기 때문에 프라이머를 설계할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이 방법은 Cis 요소에 의한 번역 규정을 신속하게 테스트하는 중요한 분석입니다. 가능하면 이 메서드는 다른 보완 실험에 의해 확증되어야 합니다.예방 조치는 바치니아 바이러스를 사용하는 동안 취해야하며 에디듐 브로마이드및 페놀과 같은 화학 물질에 노출되지 않아야합니다.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Gaussia 루시페라아제 (GLuc) 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드로부터 캡핑 및 비캡핑 mRNA를 모두 고수율로 in vitro 합성하는 방법을 설명합니다. 합성된 RNA를 정제하고, 비캡핑 RNA의 일부를 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 캡핑합니다. 마지막 단계로, mRNA를 HeLa 세포에 형질전환하고 세포 배양 상청액의 루시페라아제 활성을 측정합니다.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

이 비디오는 재조합 루시페라아제와 형광 단백질 발현 바이리포터 인플루엔자 A 바이러스를 사용하여 마우스 모델에서 바이러스 감염을 추적하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 생체 내 및 생체 외 연구를 모두 가능하게 하여 연구자가 바이러스 역학 및 중재의 효과에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.

바이러스 감염을 추적하기 위한 Luciferase-Fluorescent Reporter 인플루엔자 바이러스

이 비디오는 폭스 바이러스에 감염된 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 감염되지 않은 세포와 바이러스에 감염된 세포를 반딧불이 루시퍼라제(Fluc) 및 레닐라 루시퍼라제(Rluc)를 암호화하는 mRNA와 함께 형질주입했으며, Fluc mRNA는 5' 폴리(A) 리더 염기서열을 포함했습니다. 용해된 세포에 생물 발광 기질을 추가할 때 두 루시퍼라제의 신호를 측정하여 리더 염기서열에 의해 부여되는 바이러스 감염 세포에서 Fluc mRNA의 번역 이점을 식별합니다.

폭스바이러스 감염 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 Luciferase Reporter 분석

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

대식세포 세포주 RAW264.7로의 형질주입은 이물질에 대한 세포의 자연적인 반응으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 루시퍼라제 리포터 유전자를 RAW264.7 세포에 transfection하기 위한 부드럽지만 강력한 절차를 설명했습니다.

루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

배우세요 시험관 내 전사된 RNA 기반 루시퍼라제 검정법으로 포크스바이러스 감염 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기법은 5'UTR과 3'UTR 같은 시스 요소의 역할을 분석하여 바이러스 번역 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

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