Name: 종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 miRNA 표적 식별 및 검증을 위한 시험관 내 프로토콜입니다. miRNA-107과 SNCG의 직접적 상호작용을 SRB 및 루시퍼레이스 분석으로 확인하여 암 세포 증식 조절 메커니즘을 규명합니다.

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이 연구는 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다(2017R1D1A3B03035662); 및 한림대학교 연구기금, 2017(HRF-201703-003)

<ol><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs-103%2F107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li>
<li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%2C+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li>
<li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+miR-155%2FFOXO3a+and+miR-222%2FPTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li>
<li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+miR-107%2C+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+%28pHGGs%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li>
<li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunting+of+targets%3A+challenge+in+miRNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis%3A+not+all+kits+are+created+equal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents%2C+5-Aza-CdR+and+FK228%2C+in+Human+Gastric+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li>
<li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li>
<li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47(2015).</li>
<li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202(2010).</li>
<li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+me+count+the+ways%3A+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li>
<li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li>
<li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li>
<li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li>
<li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+%28SRB%29+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li>
<li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li>
<li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li>
<li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li>
<li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

관심있는 miRNA의 기능을 가진 선의의 miRNA 표적의 결정을 위한 전략은 miRNA의 다중 역할의 이해를 위해 필수적입니다. miRNA 표적 유전자의 식별은 세포에서 miRNAs에 의해 변조된 세포 신호 이벤트를 해석하기 위한 지침일 수 있다. miRNA의 기능적으로 중요한 표적 유전자의 공개는 암에 있는 miRNA 기지를 둔 치료를 개발하기 위하여 근본적인 지식을 제공할 수 있습니다.
마이크로어레이, 소형 RNA 라이브러리 시퀀싱, 딥 시퀀싱, 시투 PCR의 역전사, 북부 블로팅과 같은 여러 가지 방법이 세포주 및 조직으로부터 분리된 총 RNA를 사용하여 miRNA 발현 수준을 탐구하기 위해 적용될 수 있다24, 25,26. miRNAs의 높은 처리량 프로파일링은 암 발달의 유전적 기초에 대한 귀중한 통찰...

MicroRNAs (miRNAs)는 주로 선의의 표적 유전자에서 3'번역되지 않은 영역 (3' UTR)에 반응하여 메신저 RNA (mRNAs)의 번역 및 분해 과정을조절하는 작은 조절 RNA이다 1. miRNAs의 발현은 전사 및 전사 후 메커니즘에 의해 조절될 수 있다. 이러한 규제 메커니즘의 불균형은 암을 포함한 수많은 질병에서 통제되지 않고독특한 miRNAs 발현 수준을 가져온다 2. 단일 miRNA는 다양한 mRNA와 다중 상호작용을 가질 수 있다. 그에 상응하여, 개별 mRNA는 다양한 miRNA에 의해 제어될 수 있다. 따라서 세포내 신호 네트워크는 생리적 장애 및 질병이 시작되고 악화될 수 있는 특유의 발현 된 miRNAs에 의해 복잡하게 영향을 받습니다2,3,4. 5개 , 6. miRNAs의 변경된 표현이 암의 각종 모형에서 관찰되었더라도, miRNAs와 함께 암세포의 매너를 조절하는 분자 기계장치는 아직도 크게 알려지지 않았습니다.
축적 된 증거는 miRNAs의 종양 억제 역할이 암의 유형에 달려 있음을 보여주고있다. 예를 들어, 지게차 상자 o3(FOXO3)를 표적화함으로써, miR-155는 대장암의 세포 증식, 전이 및 화학저항성을 촉진한다7,8. 대조적으로, 신경교종 세포 침입의 제한은 신경발생성 궤적 노치 호몰로그 단백질 2(NOTCH2) 발현9의 조절을 통해 miR-107에 의해 유도된다. miRNA 기능과 관련하여 miRNA 표적 상호 작용의 평가는 miRNAs가 건강하고 병들인 상태 둘 다에 있는 각종 생물학 프로세스를 통제하는 방법을 더 잘 이해하는 필수 불가결한 부분입니다10. 또한, miRNA의 선의의 표적(들)의 발견은 다양한 항암약물을 가진 miRNA 기반 치료에 대한 미세 조정 된 전략을 더욱 제공할 수 있다. 그러나 miRNA 분야의 주요 과제는 miRNA의 직접 표적을 식별하는 것입니다. 여기서, 상세한 방법은 miRNA 표적 유전자 측정을 위한 재현가능한 실험 접근법으로서 제시된다. miRNA 표적 식별을 위한 성공적인 실험 설계는다양한 단계 및 고려사항을 수반한다(도 1). 종양 세포 및 정상 세포에서 성숙한 miRNA 수준의 비교는 관심있는 miRNA를선택하는 일반적인 절차 중 하나일 수 있다(도 1A). 세포 증식에 대한 miRNA의 효과를 검출하기 위해 선택된 miRNA의 기능적 연구는 관심 있는 miRNA의가장 적합한 후보 표적의 목록을 좁히는 것이 중요하다(도 1B). miRNA의 실험적으로 검증된 기능에 기초하여, miRNA 표적 예측 프로그램과 함께 회사내 문헌 및 데이터베이스의 체계적인 검토가 유전자기능에 대한 가장 관련성이 있는 정보를 검색하는 데 요구된다(도 1C). 관심 있는 miRNA의 실제 표적 유전자의 식별은 유전자의 3' UTR의 복제와 함께 루시퍼라아제 분석실험과 같은 실험을 구현함으로써 달성될 수있으며, 실시간 PCR 및 웨스턴 블로팅(도 1D). 현재 프로토콜의 목적은 miRNA 모방 형질감염, 투여량-반응 곡선 생성, 및 프로브 기반 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석법의 포괄적인 방법을 제공하는 것이다. 유전자의 3' UTR의 복제와 함께 루시퍼라제 분석. 현재 프로토콜은 개별 miRNA의 기능 및 암 치료에서 miRNA의 의미를 더 잘 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA 로딩 염료</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>RD006</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>8-cap 스트립</td><td>적용 Biosystems</td><td>N8010535</td><td>cDNA 합성용</td></tr><tr><td>8-튜브 스트립</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010580</td><td>cDNA 합성용</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Agarose A</td><td>Bio Basic</td><td>D0012</td><td>500 g</td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>바이오 베이직 Canada Inc</td><td>AB0028</td><td>25 g</td></tr><tr><td>AriaMx 96 튜브 스트립</td><td>Agilent Technologies</td><td>401493</td><td>실시간 PCR</td></tr><tr><td>AriaMx real-time PCR 시스템 Agilent</td><td>Technologies</td><td>G8830A</td><td>qPCR 증폭, 검출 및 데이터 분석</td></tr><tr><td>AsiSI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0630</td><td>10,000 units/mL</td></tr><tr><td>CAPAN-1 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-79</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 후드</td><td>Labtech</td><td></td><td>모델: LCB-1203B-A2</td></tr><tr><td>V-슬래시가 있는 계수 챔버</td><td>Paul Marienfeld</td><td>650010</td><td>세포 카운터</td></tr><tr><td>CutSmart 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>10X 농도</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>500mL</td></tr><tr><td>DNA 겔 추출 키트</td><td>생체 공학</td><td>DN30200</td><td>200 prep</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>NIPPON Genetics EUROPE</td><td>MWD1</td><td>1 Kb ladder</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>100 units</td></tr><tr><td>Dual-luciferase reporter assay system</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>100 assay</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HIT competent cells</td><td>Real Biotech Corporation(RBC)</td><td>RH617</td><td>유능한 세포</td></tr><tr><td>HPNE 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-4023</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 국물</td><td>Bio Basic</td><td>SD7003</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>0.75 mL</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td>0.75 mL</td></tr><tr><td>광도계</td><td>Promega</td><td></td><td>모델 : E5311</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>TECAN</td><td></td><td>Infinite F50</td></tr><tr><td>miRNA control mimic</td><td>Ambion</td><td>4464058</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNA-107 mimic</td><td>Ambion</td><td>4464066</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>50 prep</td></tr><tr><td>Mupid-2plus (전기영동 시스템)</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>모델: AD110</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td>20,000 units/mL</td></tr><tr><td>Oligo 탐색기 프로그램</td><td>GeneLink</td><td></td><td>프라이머 설계용</td></tr><tr><td>광학 튜브 스트립 캡(8x 스트립)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td>실시간 PCR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>500 Ml</td></tr><tr><td>PANC-1 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100mL</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수</td><td>Gibco</td><td>14040117</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>플라스미드 DNA miniprep S& V kit</td><td>Bionics</td><td>DN10200</td><td>200 prep</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA 중합효소</td><td>TaKaRa</td><td>R050A</td><td>250 단위</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TECAN</td><td></td><td>쉐이킹 플랫폼</td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>랩텍</td><td></td><td>모델: LSI-3016A</td></tr><tr><td>Sigmaplot 14 소프트웨어</td><td>Systat Software Inc</td><td></td><td>용량 반응 곡선 생성용</td></tr><tr><td>Sulforhodamine B 분말</td><td>Sigma</td><td>S1402-5G</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SYBR 그린 마스터 믹스</td><td>Smobio</td><td>TQ12001805401-3</td> dsDNA T4 DNA 리가제<td>용 결합 형광 염료</td></tr><tr><td></td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td>25,000 U</td></tr><tr><td>TaqMan 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>200회 반응, AmpErase UNG</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA assay (has-miR-107)</td> <td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA assay (has-miR-301)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>TaqMan miR RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>4366597 1,000 reactions</td></tr><tr><td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>37 &deg; C 및 5% CO2 배양</td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td>100g</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T4661-100G</td><td>100g</td></tr><tr><td>초순수</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>500mL</td></tr><tr><td>Veriti 96 well thermal cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>DNA(또는 cDNA) 증폭용</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>20,000개/mL</td></tr></tbody></table>

종양 세포에서 microrna 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs)는 암을 포함하여 몇몇 질병에 있는 수많은 세포내 신호 통로를 조절하기 위하여 인식되는 작은 규정하는 RNA입니다. 이 작은 조절 RNA는 주로 그들의 표적 메신저 RNA (mRNA)의 3' 번역되지 않은 지구 (3' UTR)와 궁극적으로 mRNA의 디코딩 프로세스의 억제 및 표적 mRNA 분해의 확대의 결과로 상호 작용합니다. 발현 수준 및 세포내 기능에 기초하여, miRNA는 종양발생 및 종양 억제 mRNA의 조절 인자로 작용할 수 있다. 수백 또는 수천 개의 계산 예측 표적 중에서 miRNA의 선의의 표적 유전자를 식별하는 것은 관심 있는 miRNA의 역할 및 기본 분자 메커니즘을 분별하는 중요한 단계이다. 다양한 miRNA 표적 예측 프로그램은 가능한 miRNA-mRNA 상호작용을 검색할 수 있다. 그러나, 가장 어려운 질문은 관심의 miRNA의 직접적인 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 이 프로토콜은 miRNA의 기능과 관련된 miRNA 표적을 식별하는 방법에 대한 주요 방법의 재현 가능한 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 miRNA 모방 형질감염에 따른 프로브 기반 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석사를 사용하여 miRNA 수준, 기능 및 관련 표적 mRNA를 밝히기 위한 단계별 절차에 대한 실용적인 가이드를 제시합니다. , 투여 량 -응답 곡선 생성, 및 루시 퍼래스 분석 유전자의 3'UTR의 복제와 함께, 이는 개별 miRNAs의 역할의 적절한 이해에 필요하다.

miRNA 수준의 성공적이고 정확한 확인은 질병의 발달 및 진행에서 miRNA의 예상 역할에 기초하여 miRNA의 분류가 가능한 데이터의 해석에 중요합니다. miRNA-107 및 miRNA-301의 수준은 프로브 기반 정량적 PCR을 사용하여 3개의 췌장 세포주에서 측정되었다. 특정 miRNA 및 동일한 반응에서 기준 유전자 모두의 cdNAs의 합성은 데이터의 재현성을 증가시킬 수 있다. PANC-1 및 CAPAN-1은 인간 췌장 덕트 선암 세포주이며, HPNE는 인간 텔로머라아제 역전사(hTERT) 유전자를 항하는 레트로바이러스 발현 벡터로 트랜스화된 불멸의 췌장 덕트 세포주이다. miRNA-107은 HPNE 세포와 비교하여 PANC-1 및 CAPAN-1 세포에서 현저히 감소하였다(도2C). miRNA-301의 수준은 HPNE 세포와 비교하여 PANC-1 및 CAPAN-1 세포에서 현저하게 상승 조절되었다. 이러한 결과는 miRNA-107이 췌장암 세포에서 후생유전학적으로 불활성화되고 miRNA-...

이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

MicroRNA 기능과의 신경 microRNA 표적 상호 작용에 접근하는 것은 MicroRNAs가 건강하고 병들게 한 상태 둘 다에 있는 각종 생물학 프로세스를 통제하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 microRNA 표적및 기능 microRNA를 확인하는 전략을 통해 재현을 microRNAs의 직접 표적의 검증이 어렵기 때문에 기술합니다. 우리의 프로토콜은 개별 microRNAs의 기능 및 암 치료에 있는 microRNA의 연루에 통찰력을 제공할 수 있습니다.반 최대 억제 농도의 계산은 microRNA 연구뿐만 아니라 다른 항암 제의 효과적인 평가를위한 중요한 방법입니다. 우리의 프로토콜은 우리가 세포에 있는 microRNAs의 수준을 이해하는 근본적인 방법을 기술했기 때문에 새로운 연구원에게 도움이 될 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 셀 카운터로 셀을 계산합니다.96 웰 플레이트에 세포를 플레이트. 다음 날, 마이크로RNA 대조군 모방의 몇 가지 최종 농도에서 세포를 변형시키기 위해 일련의 형질 혼합물을 준비하고, microRNA-107 모방. 25 마이크로몰라 마이크로RNA 대조군 모방 또는 microRNA-107 모방의 주식에서, 마이크로 센심 분리튜브의 경질 시약과 함께 감소된 혈청 매체에서 모방한 대조군 또는 microRNA-107 모방을 희석및 첨가한다.마이크로 피펫을 사용하여 올리고 함유 혼합물을 부드럽게 섞습니다. 세포 배양 후드에서 10 분 배양 후, 부드럽게 다시 올리고 함유 혼합물을 혼합 한 다음 각 우물에 혼합물의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에 감염된 세포를 유지하십시오.조심스럽게 플레이트의 각 우물에서 세포 배양 매체를 흡인하고 즉시 10%의 10%의 트리클로로아세트산 또는 TCA의 100마이크로리터를 각 우물로 채웁니다. 1시간 동안 섭씨 4도에 10%TCA가 함유된 접시를 보관하십시오. 다음으로, 수돗물이 있는 욕조에 담가 접시를 여러 번 씻는다.물이 남지 않도록 접시를 눌러 우물 내부에서 여분의 물을 제거하고 접시를 말리십시오. 0.4%SRB 용액의 파이펫 50 마이크로리터가 빈 우물을 포함한 각 우물에 들어갑니다. 0.4% SRB 용액이 우물 바닥을 균일하게 덮을 때까지 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.그런 다음 접시를 40~60분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 무한염료가 완전히 씻겨질 때까지 1%의 아세트산으로 접시를 씻어내라. 10 밀리머 트리스 베이스 솔루션의 파이펫 100 마이크로리터는 빈 우물을 포함하여 해당 우물에 들어갑니다.접시를 셰이커에 10분간 보관하십시오. 492 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. SRB 분석의 흡광도 값을 사용하여 평균 흡광도 의 백분율과 각 그룹의 표준 편차를 계산합니다.데이터를 수직으로 정렬하여 처리 농도, 평균 흡광도 및 표준 편차를 포함한 원시 데이터를 소프트웨어에 가져옵니다. 그래프 만들기 탭을 클릭하고 간단한 분산 오류 막대를 선택합니다. 워크시트 열을 기호 값으로 선택하고 다음을 클릭합니다.데이터 형식 패널에서 X-Y 쌍을 선택하고 다음을 클릭합니다. 데이터 선택 패널에서 해당 데이터 열을 선택합니다. 마무리를 클릭하여 플롯을 만듭니다.X축을 두 번 클릭하여 축 배율 조정에서 축 유형을 수정합니다. 배율 유형을 선형에서 로그로 변경합니다. 시작 및 끝 범위 번호를 각각 0.01 및 200으로 수정합니다.분산 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 곡선 맞춤을 선택하고 정의된 하위 범주 사용자로 이동합니다. 용량 응답 곡선을 선택합니다. 다음 단추를 클릭한 다음 마무리를 클릭합니다.보고서 탭으로 이동한 다음 n, k 및 R 값을 확인합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 그런 다음 제한 효소 Exo1 및 Not1을 포함하는 반응 혼합물을 튜브에 결합하여 이중 소화로 이동합니다.37도 의 수조에서 혼합물을 3 ~ 4 시간 동안 배양하십시오. 1%아가로즈 젤로 이중 소화 제품을 실행합니다. 그런 다음 UV 빛 아래에서 밴드를 잘라냅니다.이중 소화PCR 제품과 소비된 대역에서 루시파아제 벡터를 정화합니다. DNA 리개진을 포함한 20개의 마이크로리터의 결찰 반응 혼합물을 준비하여 PCR 제품을 루시파아제 벡터로 결찰하여 계속한다. 튜브를 10~15초 간 간략하게 원심분리합니다.열 사이클러를 사용하여 하룻밤 동안 16도에서 결찰을 배양합니다. 다음 날, 유능한 세포를 포함하는 관에 결찰 혼합물을 추가하여 변환을 수행합니다. 튜브를 부드럽게 누르고 20 분 동안 얼음에 보관하십시오.튜브를 섭씨 42도에서 30초에서 1분간 빠르게 가열블록으로 옮기습니다. 열 충격에 따라 튜브를 얼음 위에 20분 간 놓습니다. LB 한천 접시에 유능한 세포를 퍼뜨리습니다.하룻밤 사이에 37도에서 인큐베이터에서 유능한 세포를 성장시다. 다음 날, 개별 식민지를 선택하고 초순수수를 포함하는 8스트립 튜브 중 하나에서 대장균을 재차 중단하고, 이 단계를 반복하여 무작위로 선택된 4개에서 8개의 무작위로 선택된 콜로니에서 대장균을 재보편하게 한다. E.coli 서스펜션 25마이크로리터를 다른 8스트립 튜브 세트로 옮기.대장균 서스펜션을 사용하여 콜로니 PCR을 수행합니다. 24 웰 플레이트에 루시파라제 분석체를 준비합니다. 각 웰에 대해 500 마이크로리터 세포 배양 배지에서 4개의 세포에 1~2회 10회 추가합니다.하룻밤 잠복 후, 트랜스펙트 50 나노그램의 루시파래아제 벡터는 대조군 모방 또는 특정 마이크로RNA 모방을 사용하여 세포로 배분 시약을 사용하여 모방하였다. 다음 날, 인산염 완충식식염을 사용하여 우물 내부를 두 번 씻으세요. 200 개의 리시리 시약을 우물에 적용하고 루시파아제 활성을 측정하기 전에 세포 리시스를 충분히 수행하십시오.플레이트가 15분 이상 흔들리십시오. 5~10마이크로리터의 셀 용액을 새로운 튜브로 옮기고, 시약 1개 100마이크로리터를 추가하고, 파이펫팅을 통해 용액을 즉시 혼합한다. 그런 다음 10~15초 동안 일루미노미터를 사용하여 반딧불 루시파라제 활동을 읽습니다.동일한 튜브에 시약 2개 100마이크로리터를 추가한 다음 두 번 배관을 통해 섞습니다. 마지막으로, 일루미노미터를 사용하여 10~15초 동안 레닐라 루시파라제 활동을 읽어보십시오. RTPCR은 HPNE 세포와 비교하여 마이크로RNA-107 및 PANC-1 및 CAPAN-1 세포의 현저한 감소를 나타낸다.microRNA-301의 수준은 HPNE 세포와 비교하여 PANC-1 및 CAPAN-1 세포에서 현저하게 강화되었습니다. 이 연구에서 SRB 분석은 PANC-1 세포의 증식이 microRNA-107모방 전환에 따라 감소했음을 명확하게 보여줍니다. microRNA-107의 11개의 잠재적 예측 표적의 검열은 명확하게 단지 synuclein 감마, 또는 SNCG, 종양 세포 성장의 긍정적인 레귤레이터가 microRNA-107 및 PANC-1 세포와 직접 상호 작용한다는 것을 명확하게 보여줍니다, microRNA-107가 SNCG 발현을 변조해서 PANC-1 세포의 증식을 부정적으로 통제할 수 있다는 것을 나타내는.테트라 하이드로레움 계열 의 실체 및 CFSE를 사용하는 성인 세포 증식 작용체는 세포 유형에 따라 마이크로RNA 모방등의 효과를 선별할 수 있다. microRNAs의 실험적으로 검증된 기능에 기초하여, 루시파라기 애사 전에 후보 대상 목록을 좁히기 위해서는 데이터베이스 및 표적 예측 프로그램의 체계적인 검토가 필요합니다. 항암제와 microRNA의 조합 효율 평가를 위해, 조합 지수 평가를 위한 당사의 프로토콜에 따라 조정된 IC 값을 계산하는 것이 유리하다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

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학습하세요 miRNA 표적 식별 및 검증을 위한 시험관 내 프로토콜입니다. miRNA-107과 SNCG의 직접적 상호작용을 SRB 및 루시퍼레이스 분석으로 확인하여 암 세포 증식 조절 메커니즘을 규명합니다.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

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