종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNA 기능과의 신경 microRNA 표적 상호 작용에 접근하는 것은 MicroRNAs가 건강하고 병들게 한 상태 둘 다에 있는 각종 생물학 프로세스를 통제하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 microRNA 표적및 기능 microRNA를 확인하는 전략을 통해 재현을 microRNAs의 직접 표적의 검증이 어렵기 때문에 기술합니다. 우리의 프로토콜은 개별 microRNAs의 기능 및 암 치료에 있는 microRNA의 연루에 통찰력을 제공할 수 있습니다.

반 최대 억제 농도의 계산은 microRNA 연구뿐만 아니라 다른 항암 제의 효과적인 평가를위한 중요한 방법입니다. 우리의 프로토콜은 우리가 세포에 있는 microRNAs의 수준을 이해하는 근본적인 방법을 기술했기 때문에 새로운 연구원에게 도움이 될 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 셀 카운터로 셀을 계산합니다.

96 웰 플레이트에 세포를 플레이트. 다음 날, 마이크로RNA 대조군 모방의 몇 가지 최종 농도에서 세포를 변형시키기 위해 일련의 형질 혼합물을 준비하고, microRNA-107 모방. 25 마이크로몰라 마이크로RNA 대조군 모방 또는 microRNA-107 모방의 주식에서, 마이크로 센심 분리튜브의 경질 시약과 함께 감소된 혈청 매체에서 모방한 대조군 또는 microRNA-107 모방을 희석및 첨가한다.

마이크로 피펫을 사용하여 올리고 함유 혼합물을 부드럽게 섞습니다. 세포 배양 후드에서 10 분 배양 후, 부드럽게 다시 올리고 함유 혼합물을 혼합 한 다음 각 우물에 혼합물의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에 감염된 세포를 유지하십시오.

조심스럽게 플레이트의 각 우물에서 세포 배양 매체를 흡인하고 즉시 10%의 10%의 트리클로로아세트산 또는 TCA의 100마이크로리터를 각 우물로 채웁니다. 1시간 동안 섭씨 4도에 10%TCA가 함유된 접시를 보관하십시오. 다음으로, 수돗물이 있는 욕조에 담가 접시를 여러 번 씻는다.

물이 남지 않도록 접시를 눌러 우물 내부에서 여분의 물을 제거하고 접시를 말리십시오. 0.4%SRB 용액의 파이펫 50 마이크로리터가 빈 우물을 포함한 각 우물에 들어갑니다. 0.4% SRB 용액이 우물 바닥을 균일하게 덮을 때까지 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.

그런 다음 접시를 40~60분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 무한염료가 완전히 씻겨질 때까지 1%의 아세트산으로 접시를 씻어내라. 10 밀리머 트리스 베이스 솔루션의 파이펫 100 마이크로리터는 빈 우물을 포함하여 해당 우물에 들어갑니다.

접시를 셰이커에 10분간 보관하십시오. 492 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. SRB 분석의 흡광도 값을 사용하여 평균 흡광도 의 백분율과 각 그룹의 표준 편차를 계산합니다.

데이터를 수직으로 정렬하여 처리 농도, 평균 흡광도 및 표준 편차를 포함한 원시 데이터를 소프트웨어에 가져옵니다. 그래프 만들기 탭을 클릭하고 간단한 분산 오류 막대를 선택합니다. 워크시트 열을 기호 값으로 선택하고 다음을 클릭합니다.

데이터 형식 패널에서 X-Y 쌍을 선택하고 다음을 클릭합니다. 데이터 선택 패널에서 해당 데이터 열을 선택합니다. 마무리를 클릭하여 플롯을 만듭니다.

X축을 두 번 클릭하여 축 배율 조정에서 축 유형을 수정합니다. 배율 유형을 선형에서 로그로 변경합니다. 시작 및 끝 범위 번호를 각각 0.01 및 200으로 수정합니다.

분산 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 곡선 맞춤을 선택하고 정의된 하위 범주 사용자로 이동합니다. 용량 응답 곡선을 선택합니다. 다음 단추를 클릭한 다음 마무리를 클릭합니다.

보고서 탭으로 이동한 다음 n, k 및 R 값을 확인합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 그런 다음 제한 효소 Exo1 및 Not1을 포함하는 반응 혼합물을 튜브에 결합하여 이중 소화로 이동합니다.

37도 의 수조에서 혼합물을 3 ~ 4 시간 동안 배양하십시오. 1%아가로즈 젤로 이중 소화 제품을 실행합니다. 그런 다음 UV 빛 아래에서 밴드를 잘라냅니다.

이중 소화PCR 제품과 소비된 대역에서 루시파아제 벡터를 정화합니다. DNA 리개진을 포함한 20개의 마이크로리터의 결찰 반응 혼합물을 준비하여 PCR 제품을 루시파아제 벡터로 결찰하여 계속한다. 튜브를 10~15초 간 간략하게 원심분리합니다.

열 사이클러를 사용하여 하룻밤 동안 16도에서 결찰을 배양합니다. 다음 날, 유능한 세포를 포함하는 관에 결찰 혼합물을 추가하여 변환을 수행합니다. 튜브를 부드럽게 누르고 20 분 동안 얼음에 보관하십시오.

튜브를 섭씨 42도에서 30초에서 1분간 빠르게 가열블록으로 옮기습니다. 열 충격에 따라 튜브를 얼음 위에 20분 간 놓습니다. LB 한천 접시에 유능한 세포를 퍼뜨리습니다.

하룻밤 사이에 37도에서 인큐베이터에서 유능한 세포를 성장시다. 다음 날, 개별 식민지를 선택하고 초순수수를 포함하는 8스트립 튜브 중 하나에서 대장균을 재차 중단하고, 이 단계를 반복하여 무작위로 선택된 4개에서 8개의 무작위로 선택된 콜로니에서 대장균을 재보편하게 한다. E.coli 서스펜션 25마이크로리터를 다른 8스트립 튜브 세트로 옮기.

대장균 서스펜션을 사용하여 콜로니 PCR을 수행합니다. 24 웰 플레이트에 루시파라제 분석체를 준비합니다. 각 웰에 대해 500 마이크로리터 세포 배양 배지에서 4개의 세포에 1~2회 10회 추가합니다.

하룻밤 잠복 후, 트랜스펙트 50 나노그램의 루시파래아제 벡터는 대조군 모방 또는 특정 마이크로RNA 모방을 사용하여 세포로 배분 시약을 사용하여 모방하였다. 다음 날, 인산염 완충식식염을 사용하여 우물 내부를 두 번 씻으세요. 200 개의 리시리 시약을 우물에 적용하고 루시파아제 활성을 측정하기 전에 세포 리시스를 충분히 수행하십시오.

플레이트가 15분 이상 흔들리십시오. 5~10마이크로리터의 셀 용액을 새로운 튜브로 옮기고, 시약 1개 100마이크로리터를 추가하고, 파이펫팅을 통해 용액을 즉시 혼합한다. 그런 다음 10~15초 동안 일루미노미터를 사용하여 반딧불 루시파라제 활동을 읽습니다.

동일한 튜브에 시약 2개 100마이크로리터를 추가한 다음 두 번 배관을 통해 섞습니다. 마지막으로, 일루미노미터를 사용하여 10~15초 동안 레닐라 루시파라제 활동을 읽어보십시오. RTPCR은 HPNE 세포와 비교하여 마이크로RNA-107 및 PANC-1 및 CAPAN-1 세포의 현저한 감소를 나타낸다.

microRNA-301의 수준은 HPNE 세포와 비교하여 PANC-1 및 CAPAN-1 세포에서 현저하게 강화되었습니다. 이 연구에서 SRB 분석은 PANC-1 세포의 증식이 microRNA-107모방 전환에 따라 감소했음을 명확하게 보여줍니다. microRNA-107의 11개의 잠재적 예측 표적의 검열은 명확하게 단지 synuclein 감마, 또는 SNCG, 종양 세포 성장의 긍정적인 레귤레이터가 microRNA-107 및 PANC-1 세포와 직접 상호 작용한다는 것을 명확하게 보여줍니다, microRNA-107가 SNCG 발현을 변조해서 PANC-1 세포의 증식을 부정적으로 통제할 수 있다는 것을 나타내는.

테트라 하이드로레움 계열 의 실체 및 CFSE를 사용하는 성인 세포 증식 작용체는 세포 유형에 따라 마이크로RNA 모방등의 효과를 선별할 수 있다. microRNAs의 실험적으로 검증된 기능에 기초하여, 루시파라기 애사 전에 후보 대상 목록을 좁히기 위해서는 데이터베이스 및 표적 예측 프로그램의 체계적인 검토가 필요합니다. 항암제와 microRNA의 조합 효율 평가를 위해, 조합 지수 평가를 위한 당사의 프로토콜에 따라 조정된 IC 값을 계산하는 것이 유리하다.