Name: 코카나발린A에 의해 유도된 수성 결핍 안구 건조증의 토끼 모델: 약물 효능 연구에 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 토끼에서 초음파 유도 코카나발린A 주사를 이용한 수성 결핍 안구 건조증 모델을 만드는 방법입니다. 이 기법은 약물 효능 연구와 질병 기전 분석에 적합하며 반복 주사로 급성 및 만성 상태를 유도할 수 있습니다.

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모든 동물 연구는 모든 관련 규제 및 기관 지침을 준수하고 준수하여 완료되었습니다. 모든 연구는 스토니 브룩 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었고 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었습니다.
이 연구 결과는 스토니 브룩 대학 의과 대학 (그랜트 번호 1149271-1-82502)와 메디슨 제약, Inc., Setauket, NY에서 연구 교부금에서 표적으로 한 연구 기회 교부금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자들은 미셸 맥테넌에게 편집지원을 해주셔서 감사합니다.

모든 동물 연구는 스토니 브룩 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었고 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었습니다.
1. 동물 및 주택
<ol><li>2-3kg의 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼를 획득합니다.</li>
	<li>토끼를 엄격한 온도 (65 ± 5 ° F)와 습도 (45 ± 5 %)의 케이지에 단수로 보관하십시오. 컨트롤. 조명은 12시간 온/오프 사이클이 있어야 합니다.</li>
	<li>물과 표준 토끼 차우에 무제한 액세스를 제공합니다. 눈에 영향을 미치는 비타민 A를 함유할 수 있기 때문에 식이 농축을 제거하십시오.</li>
	<li>안구 건조의 기준선 측정 또는 유도 전에 적어도 2 주 동안 동물을 적응.</li>
</ol>2. 마취 및 안락사의 방법
참고 : 모든 절차는 적당한 축출을 필요로 하는 Con A 주입을 제외하고 온화한 과실을 요구합니다.
<ol><li>온화한 용 적 재 도에 대 한, 주입 acepromazine (1 mg/kg) 피하 26 게이지 바늘을 사용 하 여 어깨에. 온화한 침착을 위한 종점: 동물은 귀 엽이 더 이상 완전히 똑바로 서 있지 않은 편안한 머리 위치를 유지합니다. 참고: 적절한 엔드포인트에 도달하지 못하면 아세프로마진을 추가로 주입할 수 있습니다. 동물은 항상 깨어 있어야하며 수염을 만지는 데 반응해야하며 호흡이 느려지는 것을 절대로 보여주지 않아야합니다.</li>
	<li>적당한 속식을 위해, 먼저 위와 같이 동물 에게 아세프로마진을 준다. 엔드포인트에 도달한 후(위 참고 참조),O2 유량이 1L/min으로 설정된 방독면을 사용하여 이소플루란을 주고 이소플루란 전달을 5%로 설정하였다(그림2).</li>
	<li>토끼의 몸톤이 완전히 완화되고 귀가 완전히 부풀어 오릅니다 때까지 이소플루란을 관리하십시오. 참고: 동물의 옆구리를 돌때 보상근육 운동이 발생하지 않아야 합니다. 호흡은 항상 자발적으로 유지됩니다.</li>
	<li>자발적인 회복은 2-5 분 이내에 발생합니다 : 징후는 자발적인 머리 움직임과 증가 또는 정상적인 근육 톤을 포함합니다. 적당한 용신으로 실험 절차가 완료 된 후 약 30 분 동안 또는 행동이 정상으로 돌아올 때까지 토끼를 관찰하십시오. 참고: 안과 연고는 어느 형태의 침전물 동안에는 필요하지 않습니다. 1) 온화한 과식에서, 동물은 여전히 경고하고 깜박반사를 유지합니다. 적당한 침신에서, 깜박임 반사의 억제는 안구 표면이 위험하지 않다는 것을 너무 짧습니다. 2) 안구 표면에 안과 연고를 배치하면 테스트 중에 평가 된 구조의 시각화가 금지됩니다.</li>
	<li>안락사: 정맥 내 펜토바르비탈(100 mg/kg)을 과다 복용하십시오.</li>
</ol>3. 틈새 막의 제거
<ol><li>각막의 완전하고 정확한 평가를 허용하기 위해 적응 기간 (일반적으로 첫 주) 동안 제거를 수행합니다.</li>
	<li>
오른쪽 틈새 멤브레인에 주입 참고 : 두 눈의 틈새 멤브레인을 제거하려면 한 세션에서이 작업을 수행하는 것이 가장 간단합니다. 한쪽 눈으로 시작하여 설명된 대로 진행합니다. 설명의 명확성을 위해 이 메서드는 오른쪽 눈으로 시작합니다.<ol>
<li>토끼를 적절한 크기의 제지 백에 넣습니다.</li>
		<li>단계 2.1에 기재된 바와 같이 온화한 신분 유도.</li>
		<li>마이크로파이펫을 사용하여 오른쪽 눈에 방부제가 없는 리도카인 25 μL을 바르습니다.</li>
		<li>눈꺼풀 사이에 유연한 와이어 뚜껑 스페큘럼을 놓습니다.</li>
		<li>0.3 포셉 (또는 이에 상응하는)을 사용하여 정점에 있는 틈새 멤브레인을 잡고 각막 위로 확장하십시오.</li>
		<li>리도카인 1%를 1:100,000 에피네프린으로 26게이지 날카로운 바늘을 사용하여 틈새 멤브레인의 기저부로 주입합니다(그림3A). 적당한 bleb는 틈새 막 위에 형성되어야 합니다.</li>
		<li>스펙큘럼을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>왼쪽 틈새 멤브레인에 동일한 주입을 수행하십시오.</li>
	<li>
틈새 멤브레인 절단
	<ol>
<li>약 5분 후 뚜껑을 다시 오른쪽 눈에 놓습니다. 0.3 포셉(또는 이와 유사한)을 사용하여 정점에 있는 틈새 멤브레인을 잡고 철회합니다.</li>
		<li>Westcott 가위 또는 이에 상응하는 것을 사용하여 기지에서 틈새 멤브레인을 잘라냅니다(그림 3B). 참고: 출혈은 최소한이며 일반적으로 소작이 필요하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 고온 배터리 소작은 추가 적인 지혈이 필요한 경우에 항상 근처에 보관됩니다.</li>
		<li>스펙큘럼을 제거합니다.</li>
		<li>국소 항생제 연고를 눈에 놓습니다 (예 : 네오마이신, 폴리마이신, 바시트라신 및 하이드로 코르티손).</li>
	</ol>
</li>
	<li>하디안 선은 그대로 둡니다. Harderian 동맥은 때때로 틈새 막이 철회될 때 보입니다. 참고 : 큰 백색 질량 또는 조직 고도가 nictitating 막이 제거 된 후 비강 또는 우수한 결막 영역에서 볼 경우, 멤브레인은 하디안 동맥이 자발적으로 탈출 할 수 있도록 베이스에 너무 가깝게 절제되었다. 후속 절차에서 이를 방지하기 위해, 기지에 틈새 멤브레인을 더 남겨 두십시오.</li>
	<li>추가 조작이 이루어지거나 안구 표면 이수행되기 전에 안구 표면이 적어도 1 주 동안 치유될 수 있도록 하십시오.</li>
</ol>4. 안구 건조 매개 변수 측정 및 눈물 샘플 수집
참고: 스터디 프로토콜 요구 사항(예: 기준선 및 그 이후 지정된 시간 점)을 기반으로 DED 매개 변수를 측정합니다. DED에 대한 측정은 매번 충실하게 복제하기 위해 엄격한 노력을 기울여 다음 순서로 수행해야 합니다. 일주기 변화를 최소화하기 위해 거의 같은 시간(±1시간)에 모든 동물을 테스트합니다. 이러한 측정은 일반적으로 두 명의 조사자의 팀이 필요합니다.
<ol><li>토끼를 제지 가방에 넣습니다. 온화한 과식을 유도하십시오.</li>
	<li>눈물 삼투압22<ol>
<li>눈꺼풀을 5-10회 수동으로 깜박여 눈표면에 눈물층을 고르게 분배합니다.</li>
		<li>아래 뚜껑을 부드럽게 닫습니다.</li>
		<li>아래 쪽축을 따라 palpebral 및 구근 결막의 접합부에서 TearLab Osmometer로 눈물을 흘리며, 잘린 틈새 멤브레인의 기저부 바로 뒤쪽을 따라 눈물을 흘립니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 TearLab 삼투압 테스트를 사용하여 삼투압을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>눈물 이별 시간 (TBUT)<ol>
<li>이 분석의 방을 어둡게 합니다.</li>
		<li>눈꺼풀 사이에 와이어 뚜껑 스페큘럼을 놓습니다.</li>
		<li>마이크로파이펫을 사용하여 각막 표면에 0.2% 플루오레세인의 50 μL 드롭을 적용합니다. 각막에 불소의 분포가 첫 번째 방울로 얻어지지 않으면 두 번째 방울을 놓습니다.</li>
		<li>즉시 타이머를 시작합니다.</li>
		<li>푸른 빛 아래 각막 전 눈물 필름을 관찰. TBUT는 검은 점, 라인 또는 불소 필름의 명백한 중단을 개발하는 데 걸린 시간으로 정의됩니다(그림 4). 필요한 경우, +1.50 배율을 제공하는 외과 용 루페를 사용하여 이별의 조기 징후를 더 잘 시각화하십시오. 최대 1분 동안 모니터링하십시오. 여기에 정의 된 대로 나누기 1 분 후에 발생하는 경우, 만 60 s에 대한 TBUT를 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>쉬르머의 눈물 테스트 (STT)<ol>
<li>안구 표면에 방부제가 없는 리도카인 25 μL 드롭을 적용합니다.</li>
		<li>Weck 세포 외과 창을 열등한 포닉스에 넣고 잔류 리도카인및 눈물 액을 흡수합니다. 필요한 경우, 아래 눈꺼풀을 사용하여 스폰지의 근위 쪽 끝을 덮어 제자리에 보관하십시오(그림 5A).</li>
		<li>약 30초 후에 Weck 스폰지를 제거합니다.</li>
		<li>즉시 아래층 뚜껑의 중간 지점에서 각막과 팔피브랄 결막 사이의 공간에 Schirmer의 눈물 테스트 스트립을 삽입합니다.</li>
		<li>즉시 타이머를 시작합니다(그림 5B).</li>
		<li>5 분 후, 스트립의 축축한 부분의 길이를 측정; STT 값입니다.</li>
		<li>세 배로 측정값을 수행하고 3개의 판독값의 평균을 STT 값으로 보고합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>눈물 샘플의 수집
	<ol>
<li>락토페린과 같은 다양한 골수의 수치를 위한 눈물 샘플을 수집하기 위해, STT 값이 5분에 기록된 후, 적어도 20 mm의 습윤이 얻어질 때까지 스트립을 제자리에 둡니다. 참고: DED가 유도된 후 적절한 습윤이 발생하지 않는 경우 스트립을 더 깊은 쪽으로 이동하여 적절한 시간에 이 종점에 도달할 수 있도록 하십시오.</li>
		<li>촉촉한 스트립을 자르고 즉시 490 μL의 차가운 눈물 수집 버퍼 (4% BSA, 1M NaCl, 0.1% 트웬-20-20)를 단백질 분해 억제제 칵테일과 함께 PBS에 넣습니다.</li>
		<li>샘플을 -80°C에서 보관할 수 있을 때까지 얼음 위에 보관하고 분석할 때까지 보관해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>로즈 벵골 염색 (RBS)<ol>
<li>마이크로 파이펫을 사용하여 각막에 1 % 방부제 프리 리도카인 50 μL을 적용하십시오.</li>
		<li>30s 후, 안구 표면에 25 μL의 장미 벵골을 놓고 눈꺼풀을 수동으로 깜박여 고르게 분배하십시오.</li>
		<li>즉시 타이머를 시작합니다.</li>
		<li>3.5분 후, 뚜껑 사이에 와이어 뚜껑을 놓습니다.</li>
		<li>4.0 분에서 우수한 결막과 각막 표면을 사진으로 촬영합니다(그림 6). 참고: 사용 중인 카메라 유형에 맞게 조정합니다. 일반적인 설정: 디지털 단일 렌즈 반사 카메라, 조리개 우선 모드(조리개 13개 이상), ISO 6000, 100mm 매크로 렌즈 2개가 부착된 12.5mm 확장 튜브, 수동 초점 모드, 최대 배율의 렌즈, 매크로/링 플래시에서 자동으로 설정된 매크로/링 플래시의 조명. 링 플래시의 초점 램프가 켜져 각막에 초점을 맞출 수 있습니다.</li>
		<li>1분 이내에 두 눈의 모든 사진을 완성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>NEI방법(23)을 이용하여 안구 표면 염색 점수는 다음과 같이 수정한다. 6 별도의 결막 영역을 채점하지 마십시오. 각 눈의 우수한 결막 점수를 매다. 이것은 지구를 조작하지 않고 쉽게 촬영 할 수있는 결막 표면의 부분입니다. 조작은 실제로 안구 표면의 얼룩을 바꿀 수 있습니다.</li>
	<li>눈물 락토페린 수준은 눈물 땀샘에서 눈물 생산의 대리 측정이다. 분해술은 제조자의 지시에 따라 효소 연계 면역흡착분석법24 키트를 이용하여 위와 같이 수집된 눈물의 래토페린을 찢어버린다.</li>
</ol>5. 안구 건조의 유도 및 치료
참고 : 궤도 물샘 시스템의 세 부분이 주입됩니다.
<ol><li>아세프로마진 0.2 mg/kg을 피하로 토끼를 진정시다.</li>
	<li>주변 및 두피 부위의 털을 전단하고 Nair를 사용하여 잔류 모피를 완전히 제거합니다. 해부학 적 특징의 더 나은 시각화와 concanavalin A의 미국 가이드 주입을 위해 피부를 완전히 부드럽게 둡니다(그림 7).</li>
	<li>전술한 바와 같이 적당한 과식을 유도한다.</li>
	<li>우수한 상구선의 팔피브랄 부분의 주입 (PSLG) 참고 : 먼저 PSLG의 주입을 수행합니다.<ol>
<li>적절한 눈25 μL의 방부제 프리 리도카인 1%를 마이크로파이펫으로 바랄 수 있습니다.</li>
		<li>위 눈꺼풀을 에버트하고 동맥의 점액 부위를 표시하는 protuberance가 보일 때까지 후방 궤도 림에 부드러운 내측 압력을 가합니다. PSLG는 상부 뚜껑의 후방(측두체) 부분에 작은 구근 고도로 나타납니다. 참고 : 학습 과정에서 선 조직을 보려면 5 % 플루오레세인을 부위에 적용하십시오(그림 8A). 눈물은 구근 PSLG에서 스트리밍 볼 수 있습니다. Con A의 투여를 위해 플루오레세인의 적용이 필요하지 않다; 그것은 단지 선 조직을 보여주기 위해 그림 목적을 위해 수행됩니다.</li>
		<li>결핵 주사기에 미세 톱니 집게와 27 게이지 바늘을 사용하여, 직접 트랜스 콘추시발 접근 방식을 사용하여 동맥을 관통. 바늘을 조직에 2mm 를 전진시키고 0.1 mL의 부피에서 500 μg의 Con A를 주입합니다(그림 8B). 참고 : 이 주사는 때때로 고통스러울 수 있습니다. 필요한 경우, 이 주사가 완료 될 때까지 이소플루란 아래에 동물을 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>궤도 우수한 상구선 (OSLG)의 주입 참고: OSLG는 연속적으로 진행됩니다.<ol>
<li>OSLG가 후방 에서 튀어 나오게하는 세계에 내측 압력을 적용하십시오 (필요한 경우 해부학의 경우 ref25 참조). 후방 에서 OSLG의 protuberance와 함께 지구(그림 9, 빨간색 화살표)에내측 압력을 적용합니다. protuberance는 후방 인장을 찾기 위해 총 국소화 역할을합니다.</li>
		<li>두개골의 뼈 구멍이 느껴질 때까지 영역을 들여쓰기 위해 닫힌 팁이있는 곡선 집게를 사용합니다. 이것은 전방 / 후방 방향과 슬릿처럼 될 것입니다.</li>
		<li>포셉으로 적당한 압력을 가하여 피부에 들여쓰기를 남기고 바늘 배치의 랜드 마크 역할을합니다(그림 10A).</li>
		<li>삽입 표시를 통해 피부에 수직 바늘 (27 게이지, 5/8 인치 바늘 튜버 쿨린 주사기) 삽입 마크에 수직(그림 10B)~ 1/4 인치 를 삽입, 다음 주사 사이트와 뼈 궤도 림 사이의 중간 점을 목표로 측면 캔디를 향해 측면 캔디를 향해 바늘을 리디렉션. 참고 : 인자가 바늘로 정확하게 표적으로하지 않으면 두개골이 발전을 막습니다.</li>
		<li>바늘의 허브에 도달하면 0.2 mL(그림 10C)의 부피에서 1000 μg의 Con A를 천천히주입합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 분 이내에 PSLG와 OSLG 모두의 주입을 완료합니다.</li>
	<li>이소플루란 진정제에서 동물을 제거하십시오 (아직 하지 않은 경우). 열등한 상구선(ILG)의 주입은 일반적으로 추가 적인 주사 없이 완료될 수 있다.</li>
	<li>열등한 상아 동맥 의 주입
	<ol>
<li>옆에서 동물을 볼 수 있습니다. ILG의 돌출부는 궤도의 하부 전방 부를 따라 볼 수있다(도 11A).</li>
		<li>수술 마킹 펜 또는 ILG 선의 표면 부분이 zygomatic 뼈의 표면 (더 많은 외부) 휴식 장소에서 궤도의 더 많은 중간 위치로 전환하는 피부에 적합한 영구 마커를 사용하여 수직 선을 그립니다. 이는 전형적으로 전방 사지보다 열등하다(그림11A).</li>
		<li>피부에이 라인을 가로 질러 수직으로 개최 미국 프로브를 청소하여 zygomatic 뼈의 끝을 식별합니다. ILG 전환은 선상 이미지가 명확하게 외경된 (zygomatic bone의 과반향 선이 이미지에서 선의 아래쪽 가장자리를 따라 보입니다)에서 인식 가능한 내측 테두리가없는 것으로 바뀌는 경우에 발생합니다 (zygomatic 골격 에코는 더 이상 존재하지 않습니다, 그림 1).</li>
		<li>미국 화면에서 이러한 변경 사항을 표시하면 피부에 그려진 선에 대한 핸드피스의 상대적 위치를 관찰합니다. 이것은 Con A를 주어야하는 "사출 사이트"입니다.</li>
		<li>주사의 깊이를 제어하여 Con A를 선내로 배치하여 zygomatic 아치 뼈에 내측하는 지점에 놓습니다.</li>
		<li>다음과 같이 주입의 깊이를 결정: zygomatic 뼈의 깊이로 주입의 원하는 깊이를 설정 (hyperechoic 신호) 플러스 1 mm. 바늘의 알려진 길이에서이 값을 뺍니다 (이 예에서 15 mm).</li>
		<li>"주사 부위"~12 mm에서 선에 바늘을 삽입한 다음, 노출된 바늘의 길이가 신체 외부(수술용 캘리퍼스로 측정됨)가 5.8.6(도12)으로계산된 차이와 같을 때까지 천천히 철회한다. 0.2 mL에 콘 A 1000 μg를 주입하십시오. 참고 : 땀샘의 캡슐이 관통되고 단순히 바늘에 의해 밀려되지 않도록하기 위해 바늘은 철수가 시작되기 전에 ~ 12mm 또는 거의 허브에 삽입해야합니다.</li>
		<li>주사의 성공을 확인 하려면 미국을 반복. ILG는 특징적인 저반향 공간을 표시해야합니다(그림 1). 참고 : ILG 주입은 동물(26)에 의해 가장 잘 용납하나, 따라서, 마지막으로 수행된다.</li>
	</ol></li>
	<li>전체 절차를 완료하여 10 분 이내에 두 눈의 모든 땀샘을 주입하십시오. 이를 위해서는 절차에서 역량을 달성해야 합니다. 참고: 2 궤도 해경 땀샘에 주사의 단일 세트는 급성 DED 지속 을 유도합니다 1-2 주.</li>
	<li>더 긴 기간의 DED에 대 한, 정확 하 게 위의 Con A를 주입 7 일. 최대 6 개의 주사가 성공적으로 수행되었습니다.</li>
</ol>6. 시술 후 진료
<ol><li>Con A를 주입한 후, 적어도 10-20분 동안 또는 마취 효과가 벗겨질 때까지 동물을 제지 봉투에 담아 모니터링하십시오.</li>
	<li>동물들이 흉골 의전성을 유지하기에 충분한 의식을 되찾을 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 개별 케이지로 되돌리지 마십시오.</li>
	<li>시술 후 통증은 일반적으로 온화하고 48 시간 미만 지속됩니다. 필요한 경우 피하 케토롤락 (5 mg / kg)을 한 번 복용하십시오. 더 심한 통증에 대 한, 피하 buprenorphine를 제공 0.1 mg/kg 매 8 시간.</li>
</ol>

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저자는 메디슨 제약, Inc. 및 Apis Therapeutics, LLC에서 지분 지위를 가진 BR을 제외하고는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다. 그리고 LH, 메디콘 제약의 직원, 아피스 치료, LLC의 지분 위치와 Inc..

토끼는 DED의 연구에 매우 매력적이다. 그들의 각막과 결막은 마우스와 쥐에 비해 인간의 그것에 가까운 표면적을 가지고; 에스테르와 같은 약물 대사 효소와 눈물 샘의 발기 선연성은 인간과 유사하며, 그들의 눈은 유익한 약동학 연구를 위해 충분히 큽합니다. 돼지와 원숭이에 비해, 그들은 유사한 기능을 공유하는, 그들은 적은 비용과 실험 조작이 더 쉽습니다. 기계론적 연구가 고려되는 경우, 토끼의 상대적 단점은 마우스에 비해, 더 적은 시약 (예를 들어, 단일 클론 항체)을 사용할 수 있다는 것입니다. 다른 한편으로는, 토끼는 개별 조직이 쉽게 해부되고 분석 작업을 위한 충분한 크기의 때문에 약동학 및 생물 분배 연구 결과를 위한 마우스에 훨씬 우수합니다, 피하기 "견본 풀링."
중요한 일반적인 매개 변수는 토끼의 적응 기간입니다. 동물은 종종 적절한 온도 또는 습도의 운송 환경을 보장하지 않는 조건하에서 공급 업체에서 배송됩니다. 일부 동물은 도착 시 이미 안구 건조를 일으켰을 수 있습니다. 2주 간의 적응 기간을 권장합니다. 마찬가지로 중요한 연구 토끼가 사육장에 보관되는 공간의 습도와 온도에 세심한주의이다. 어느 조건의 편차는 그들의 눈 상태에 있는 거대한 변이를 유도할 수 있습니다. 백업 가습기와 제습기를 손에 가지고 있습니다. 중앙 시스템이 고장나면 백업 장비를 사용하여 주변 습도를 신속하게 복원하십시오. 이러한 불행한 발전은 여름철에 더 일반적이라는 것을 명심하십시오. 그러나 토끼에서 DED를 성공적으로 유도하기 위한 세 가지 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 미국 이미징을 능숙하게 사용하여 ILG를 식별하고 Con A의 주입을 직접 및 확인합니다. 2) ILG와 SLG의 두 부분 모두의 주입을 보장; 및 3) DED의 매개 변수를 안정적으로 재현가능하게 시상합니다.
필요한 실험 기술을 개발하는 것은 사소한 것이 아니라 심각한 조사자도 억제해서는 안됩니다. 5번의 반복으로 학습 곡선이 완료될 것으로 예상합니다. 합리적인 품질의 미국 이미징 시스템은 필수적입니다. 미국에 의한 해부학적 특징을 인식하는 것이 중요하므로 조사원은 토끼 해부학을 검토해야합니다. 데이비스(25)에의해 토끼 해부학의 우수한 설명, 고전, 대단히 도움이 될 수 있습니다. 또한 ILG 의 크기의 변화를 염두에 두십시오. 이에 대한 결론은 Con A의 성공은 항상 후속 이미징으로 확인되어야한다는 것입니다. 토끼의 그룹에서 Con A에 대한 반응의 변화는 가장 자주 주사 기술 (실패 또는 부분적으로 성공적인 주입) 또는 눈물의 과잉 생산을 보상하기 위해 잔류 눈물 선 조직의 용량을 무시하기 때문입니다. 주입 기술을 마스터하고자하는 사람들을 위해, 신속한 해부학 해부에 선행 메틸렌 블루주입하는 것이 도움이 될 수 있습니다; 그것은 근해 동맥에 도달하거나 이웃 조직에 유출하는 경우 시각화가 달성된다. 현재까지, 이 주입 방법은 단 하나 합병증 없이 저자에 의해 270 번 이상 수행되었습니다.
위에 제시된 DED의 5개의 매개변수를 말하는 것은 임상 사례에 있는 그들의 결정같이 까다로울 수 있습니다. circadian 변이는 아직 그 중 어느 것에도 공식적으로 문서화되지 않았지만, 특히 반복 분석이 수행되고 서로 비교되어야 할 때 눈(28)에서 이러한 현상의 충분한 배경 증거가 있습니다. 이러한 검사를 수행하는 일관성은 필수적입니다. 두 팀으로 구성된 팀이 필요합니다. 몇 가지 단계에 엄격한 타이밍이 필요하다는 점을 감안할 때, 같은 방에 있는 4명 이상의 조사자가 실험에 참여하는 것은 파괴적일 수 있습니다. 적절하고 고품질의 사진 문서가 중요한 경우.
이 모델은 약물 개발 연구에 이상적입니다. 동물 모델 및 분석 기술의 숙달은 효능 및 안전성 연구의 우수한 재현성19를 보장하였다.
이는 이전 모델의 혼란스러운 가변성을 제거하고 동물 모델을 간소화하고 DED의 5가지 매개 변수를 본질적으로 표준화하기 때문에 강력한 실험 접근법입니다. 후보 치료제의 연구에이 모델의 성공적인 응용 프로그램은 새로운 에이전트의 절실한 필요와 그 병인의 깊은 이해의 질병에 대한 유익한 동물 모델로서의 실용적인 유틸리티를 확인했다.

안구건조증(DED)은 유병률이 높고이환율이높은 만성 질환으로1, 2,3,4. 염증은 병인5,6의발병기전에 중요한 역할을 한다. DED의 병리생리학은 과소 생산 또는 눈물의 과잉 증발에서 파생으로 개념화됩니다; 전자는 수성 결핍 DED7로도알려져 있습니다. Sjögren의 증후군, DED의 광범위하게 연구 된 프로토 타입 원인은 주로 배분 (LGs)에 영향을 미치며 DED의 병인에서 중요성의 놀라운 예입니다. DED는 종종 일시적인 완화를 제공하는 인공 눈물로 치료되거나 안구 염증을 억제하는 사이클로스포린 또는 리피테그라스트로 치료됩니다. DED에 사용할 수있는 치료법 중 어느 것도 최적이지 않으며 새로운 에이전트8,9의개발을 필요로합니다.
DED를 위한 새로운 치료에이전트를 위한 검색은 3개의 중요한 도전으로 방해됩니다: DED의 병리생리학적 복잡성을 감안할 때 애매할 지도 모르다 인식한 약질 분자 표적의 부족; 유망한 에이전트의 희소성; DED의 주요 기능을 다시 요약하는 동물 모델의 부족.
대부분의 약물 개발 노력과 마찬가지로, DED의 유익한 동물 모델은 어떤 동물 모델도 인간 질병을 완전히 재현하지 않는다는 축세포적 진술에도 불구하고 중요한 조사 도구입니다. DED의 마우스, 쥐 및 토끼 모델은 가장 일반적으로 사용되는 반면 개와 영장류는 자주10,11. 12개 이상의 토끼 DED 모델의 대부분은 LG를 제거하거나 그 기능을 방해하여 눈물 생산을 줄이려는 시도를 현재까지 보고했으며12,13,14,15,16. 이러한 접근법은 ILG의 외과 적 절제술을 포함한다; 배설 덕트의 폐쇄; 활성화 된 림프구, 미토겐, 보툴리눔 독소, 아트로핀 또는 벤잘클로늄 중 하나의 방사선 조사 또는 주입에 의해 LG 기능을 손상시다. 이러한 방법의 주요 제한 사항은 불일치와 눈물 생산의 빈번한 부분 억제입니다.
Concanavalin A (Con A), 식물 기원의 렉틴, 강력한 자극제 T 세포 하위 세트이며, 간염의 실험 모델에 사용되어왔다17 및 DED18. 원래 Con A 기반 모델은 상대적 단순성을 포함하여 상당한 이점을 제공하는 것으로 보고되었습니다. LGs에 염증 세포 유입, 쇼그렌과 같은 질병을 모방; 전염증성 사이토카인의 자극IL-1β, IL-8, 및 TGF-β1; 눈물 플루오레세인 클리어런스와 눈물 이별 시간 (TBUT)을 측정하여 모니터링 된 눈물 기능 감소; 항 염증 성 코르 티 코 스테로이드에 대 한 표시 약물 응답성.
이 유망한 방법이 적용되었을 때, 그 장점 외에도 전반적인 개정과 과감한 개선이 필요하다는 한계가 확인되었습니다. 메서드의 세 가지 중요한 단점을 문서화합니다. 첫째, 모델은 급성이었다; 유도 된 DED는 약 1 주 후에 가라 앉았다. 둘째, 동물의 반응은 일치하지 않았다. 입증된 바와 같이, 열등한 LG(ILG)에 대한 "블라인드" 경피 주사에서, Con A는 표적 선에 무작위로만 전달되었다. ILG의 해부학의 상세한 연구는 그것의 크기가 4 배19로 다변할 수 있다는 것을 밝혔습니다 그 같은 주사를 만드는 "히트 또는 미스" 노력. 마지막으로, ILG가 주입된 경우에도 우수한 LG(SLG)는 눈물 흐름 감소에 대해 자주 보상하여 모델에 문제가 발생했습니다.
이러한 주요 제한은 DED의 우수한 동물 모델을 생성하는 방법에 대한 세 가지 수정을 도입함으로써 극복되었다. 첫째, ILG에 Con A를 주입하는 것은 초음파 (미국) 지침하에 수행되어 Con A가 선에 들어갔도록했습니다. 도 1에도시된 바와 같이 주사 후 미국 이미지를 획득함으로써 주사의 성공이 확인되었다. 둘째, SLG의 보상 눈물 기여를 제거하기 위해, 이 선의 팔모및 궤도 부분 모두 Con A를 주입했다. 마지막으로, DED의 이 급성 모델은 7-10일마다 Con A의 반복주사에 의해 만성으로 전환되었다. 2 개월의 기간의 DED는 이 토끼에서 쉽게 달성됩니다. 이 방법의 성공은19.
이미 언급했듯이, DED의 동물 모델의 중요한 적용은 후보 치료제의 효능 및 안전도를 결정하는 것이다. 이 모델의 유용성은 안약으로 투여된 새로운 항염증소분자20,21인 인산린다액(OXT-328)의 연구에 의해 입증되었다. 그 효능은 DED19의매개 변수 패널을 기반으로 입증되었습니다. 이 모델의 상대적 단순성과 유익한 특성은 또한 DED, 사이클로스포린 및 리피테그라스트에 대한 두 개의 FDA 승인 약물에 인산린다크의 나란히 비교를 허용하여 강력한 전임상 우수성을 입증했습니다.

<table><tbody><tr><td>100mm 매크로 렌즈</td><td>Canon EF 100mm f/2.8L IS USM</td><td>3554B002</td><td></td></tr><tr><td>26 게이지 바늘 (5/8)</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ</td><td>305115</td><td>눈물샘에 ConA를 주입하기 위한 바늘</td></tr><tr><td>27 게이지 바늘 (5/8)</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ</td><td>305921</td><td>눈물샘에 ConA를 주입하기 위한 바늘</td></tr><tr><td>Aceproinj (acepromazine)</td><td>Henry Schein Animal Health, Dublin, OH</td><td>NDC11695-0079-8</td><td>토끼 진정제</td></tr><tr><td>마취 기화기</td><td>VetEquip, Pleasanton, CA</td><td>항목 #911103</td><td></td></tr><tr><td>Bishop Harmon 겸자</td><td>Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ</td><td>E1500-C</td><td>조직 겸자</td></tr><tr><td>캘리퍼스</td><td>Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ</td><td>E-2404</td><td>ConA 주입 중 바늘의 길이를 측정하는 데 사용되는 캘리퍼스</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>C2010</td><td>토끼 눈물샘에 주입하기 위해 PBS에서 5mg/ml 만들기</td></tr><tr><td>DSLR 카메라</td><td>Canon EOS 7D DSLR</td><td>3814B004</td><td>디지털 일안 반사식 카메라</td></tr><tr><td>플루오레세인</td><td>AKRON, 레이크 포레스트, IL</td><td>NDC17478-253</td> TBUT Isoflurane<td>을 측정하기 위해 PBS로 0.2%로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Henry Schein, Melville, NY</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>락토페린 ELISA 키트</td><td>MyBiosource, San Diego, CA</td><td>MBS032049</td><td>눈물 락토페린 수치</td></tr><tr><td>측정 리도카인</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>L5647</td><td>1% PBS에서 마취제</td></tr><tr><td>매크로/링 플래시</td><td>Canon Macro Ring Lite MR-14EXII</td><td>9389B002AA</td><td></td></tr><tr><td>삼투압 팁</td><td>TearLab Corp., San Diego, CA</td><td>#100003 REV R</td><td>눈물 삼투압</td></tr> 측정 <tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)</td><td>Mediatech, Inc. Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (텍스트에 설명 된대로)</td> <td>Charles River Labs, Waltham, MA</td><td>2-3 kg</td><td>연구 동물</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO</td><td>NDC51801-004-40</td><td>PBS에서 1 %, 안구 표면</td></tr><tr><td>Schirmer 염색 스트립</td><td>Eaglevision, Katena 제품. Denville, NJ</td><td>AX13613</td><td>눈물 생산 측정</td></tr><tr><td>수술 루페 +1.50</td><td>시력, 보헤미아, 뉴욕</td><td>전문 품목</td><td>눈물 분해를 관찰하고 Concanavalin A 주사를 수행하는 동안 안구 표면의 magnificantion을 제공합니다.</td></tr><tr><td>TearLab Osmometer</td><td>TearLab Corp., San Diego, CA</td><td>Model #200000W REV A</td><td>측정 눈물 삼투압</td></tr><tr><td>초음파 프로브</td><td>VisualSonics Toronto,</td><td>Ont MX 550 S</td><td>Untrasonography-guide Con A inferior lacrimal gland 주사</td></tr></tbody></table>

코카나발린a에 의해 유도된 수성 결핍 안구 건조증의 토끼 모델: 약물 효능 연구에 적용

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

안구 표면의 다인성 염증 성 질환인 안구 건조증(DED)은 전 세계 6명 중 1명이 삶의 질과 건강 관리 비용에 엄청난 영향을 미칩니다. 그것의 주요 특징을 되풀이하는 유익한 동물 모형의 부족은 DED를 위한 새로운 치료에이전트를 위한 검색을 방해합니다. 사용 가능한 DED 동물 모델은 재현성과 효능이 제한적입니다. 모델은 DED가 토끼의 궤도 배땀샘에 미토겐 concanavalin A (Con A)를 주입하여 유도되는 여기에서 제시된다. 이 모델의 혁신적인 측면은 초음파 (미국) 지침의 사용은 열등한 상아 선에 Con A의 최적이고 재현 가능한 주입을 보장하기 위해; 눈물의 보상 생산을 제한 하는 모든 궤도 눈물 땀 샘에 Con A의 주입; 그리고 의지에 DED의 상태를 연장 Con A의 정기적 인 반복 주사의 사용. DED와 테스트 에이전트에 대한 반응은 눈물 생산, 눈물 필름의 안정성 및 각막 및 결막 점막의 상태를 평가하는 매개 변수 패널로 모니터링됩니다. 그(것)들은 눈물 삼투압, 눈물 이별 시간, Schirmer의 눈물 시험, 장미 벵골 염색 및 눈물 락토페린 수준을 포함합니다. DED의 유도 및 해당 매개 변수의 모니터링에 대해 자세히 설명합니다. 이 모델은 간단하고 견고하며 재현 가능하며 유익합니다. 이 동물 모델은 눈물 생리학 및 DED의 병리생리학의 연구뿐만 아니라 DED의 치료를 위한 후보제제의 효능 및 안전성의 평가에 적합하다.

Con A 주사는 조밀한 림프구성 침윤을 특징으로 하는 눈물샘에서 강한 염증 반응을 유도하였다(도13),눈물 생성 감소를 수반한다. 모든 눈물 매개변수가 현저하게 변경되었습니다(표1 및 표 2). 또한, 눈물 락토페린 수준을 억제하였다(대조군 = 3.1±0.45 대 Con A 주입 = 2.7±0.02 ng/mg 단백질(평균±SEM); p&amp;0.03). 최종 결과는 손상된 각막과 결막 상피, 증가 장미 벵골 염색에 의해 입증되었다(그림 6).
3개의 궤도 LG 조직의 주입은 이전 방법18,27에의해 달성된 상태와 는 달리 일관되고 균일한 DED 상태를 생성했다. 이 결과에 주요 기여는 ILG의 미국 유도 주입 및 OSLG의 주입이었다. 표 1은 이 메서드의 두드러진 결과를 요약합니다. 모든 변경 사항은 심각한 DED와 일치합니다.
콘 A 주사의 단일 세트에 대 한 지속 DED를 생산 1 주; 모든 임상 매개 변수는 10일까지 정규화됩니다(표2). 순차적 Con A 주사에 대 한 1 주 간격으로 그에 따라 DED의 기간을 연장. 예를 들어, 7일째에 Con A 주사의 두 번째 세트는 DED를 2주 동안 유지합니다. 주사의 약 5 세트 후, DED 상태는 종종 추가 주사에 대 한 필요 없이 영구 된다.
Con A-유도 DED를 가진 토끼를 신규제 인산린다크로 처리했을 때, 현저하게 질병을 억제하였다. 예를 들어, 이 에이전트 TBUT를 사용하여 1 주일 의 처리에 따라 비히클 처리 된 동물에 비해 현저하게 증가 (43.6 ±4.0 vs. 12.2±2.8 s; p&amp;0.001; 평균 ± SEM 각각, 이 및 다음 값에 대한) 눈물 삼투압이 정규화된 동안 (294±4.6 vs. 311±2.0.0m, 0.0m). 기계론적으로, 포스포슬린다크는 두 가지 중요한 인터류신, IL-1β(8.4±1.2 vs 21.2±6.6 pg/mg 단백질, p&amp;0.03) 및 IL-8(4.9±1.7 대 13.5±5.0 pg/mg 단백질,p&amp;0.05)의 수준을 감소시였습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig1a.jpg"> 그림 1 : 열등한 상어 선의 초음파 이미지. 상부 패널: ILG는 궤도 에서 더 깊게 움직여 지고매틱 아치 아래에 놓여 있습니다. 파선은 미국 프로브가 휩쓸리는 스킨의 선을 나타냅니다. 중간 패널: 수공예품이 이 선을 가로질러 휩쓸리면, 심사관은 왼쪽이미지(화살표)에있는 zygomatic 골격 에코의 손실을 찾고 오른쪽에 사라집니다. 하부 패널: 전(왼쪽)과후(오른쪽)주사 후 의 ILG의 이미지는 선 내의 큰 낭포 공간의 발달을 통해 적절한 전달을 확인한다. 권한19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig02.jpg"> 그림 2: 방독면 방독. 이 사진은 방독면을 통해 이소플루란과 함께 짧은 중간 정도의 매립을 제공하는 모습을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig3a.jpg"> 그림 3: 틈새 멤브레인 제거. (A) 리도카인 /피네프린 주입. (B) 웨스트 콧 가위로 베이스에 틈새 멤브레인의 잘림. (C) 안구 표면은 틈새 멤브레인을 제거 한 후 더 쉽게 시각화되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig03.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig4a.jpg"> 그림 4: 끊기 시간 측정. (A) 플루오레세인 방울을 바르자마자 청색광 아래 각막 표면의 균일한 녹색 눈물 막 이나타났다. (B) 이미 여러 다크 서클과 플루오레세인의 선형 줄무늬에 의해 입증 된 현저한 분해를 겪은 각막 표면. 이별 시간은 첫 번째 다크 스팟이나 선이 발생하자마자 기록됩니다. 두 개의 밝은 파란색 원은 각막에서 벗어난 광원의 반사입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig5a.jpg"> 그림 5: 쉬르머의 눈물 테스트. (A) 하부 포닉스에 Weck-Cel 스폰지의 적절한 배치는 임의의 잔류 국소 리도카인 용액 및 기준선 눈물을 제거한다. 삼각형 스폰지의 후방 가장자리를 하부 뚜껑 마진 아래에 배치함으로써, 눈물 스트립을 배치하기 전에 안구 표면을 건조하는 매우 균일 한 기술을 유지할 수 있습니다. (B) 눈물 스트립은 지구와 하부 뚜껑 사이의 하부 뚜껑의 중간 위치에 적절하게 배치됩니다 (palpebral 결막). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig06.jpg"> 그림 6: 장미 벵골 염색. 어퍼: 각막 표면의 사진. 왼쪽: Con A로 치료하기 전에 장미 벵골 염색이 존재하지 않습니다. 오른쪽: 확산 각막과 결막 염색은 주사 후 상부 (오른쪽 상단)에서 볼 수 있습니다. 낮은: 우수한 구근 결막에서 결막 인상 세포학. 왼쪽: 수많은 잔 세포는 치료 전에 존재. 오른쪽: 상피 세포가 존재하지만 잔 세포는 치료 후 결석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig7a.jpg"> 그림 7: concanavalin A 주사를 위한 토끼의 준비. (A) 작은 가위는 모피를 제거하는 데 사용되며, 랜드 마크의 시각화를 쉽게 하여 궤도 우수한 물참조 동맥을 식별 할 수 있습니다. (B) 나이르는 전단 후 남아있는 모발을 제거하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig07.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig8a.jpg"> 그림 8: 팔피브라알 상아동맥 주사. (A) 상피골 상하동맥은 상부 뚜껑의 후방 측두부에 구근 으로 나타난다. 눈물은 2 % 플루오레세인의 방울을 적용 한 후이 동맥의 표면에서 스트리밍 볼 수 있습니다. (B) 토끼가 적당한 주사를 받는 동안 점피골 상하동맥이 주입되고 있다. 한 조사자가 눈꺼풀을 철회하고, 동맥 노출을 최적화하고, 두 번째 조사자가 동맥을 주입하는 동안 마스크를 고정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig09.jpg"> 그림 9: 궤도 우수한 상구선의 국소화. 피부 윤곽의 변화는 OSLG가 후방 을 통해 돌출될 때 의 위치를 나타냅니다. 지구상에 내측 압력을 번갈아 가며(큰 화살표)피부의 작은 고도로 보이는 우수한 궤도 선이 탈출하게합니다. 이 고도는 압력이 적용될 때마다 크기가증가합니다(작은 화살표). 이 선의 위치는 일반적으로 후방 궤도 테두리와 일치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig10a.jpg"> 그림 10: 궤도 우수한 상어 동맥의 주입. (A) 그림 9에서와같이 피한 부위에 미세 한 톱니 집게로 두개골에 부드러운 압력을 가합니다. 두개골의 얇은 슬릿 모양의 구멍이 만져질 수 있습니다. 집게와 작은 들여 쓰기 마크를 떠나 크게 주입 하는 동안 바늘의 배치를 에이즈. (B) 바늘이 인큐어를 통해 수직으로 삽입되고 있다. 잘못 배치하면 뼈 두개골에 의해 통로가 멈습니다. (C) 바늘은 측면 캔투스를 향해 기울어진 최종 위치에 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig10.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig11a.jpg"> 그림 11: 열등한 상어선의 국소화. (A) 하부 뚜껑을 통해 본 ILG의 표면 부분의 돌출부. 곡선형 펜 마크는 글랜드의 낮은 위치를 나타냅니다. 비강 사지 아래의 수직 선은 ILG가 궤도 내의 더 깊은 위치로 전환하고 미국에 대한 시각적 참조 역할을 하는 대략적인 위치를 나타냅니다. (B) 미국 핸드피스가 수직선 영역을 가로질러 스위핑; 미국 모니터는 zygomatic 뼈가 끝나는 곳을 표시합니다, 어디 ILG 전환 및 Con A 주입을 주어야한다 ("주입 사이트"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig12.jpg"> 그림 12: 열등한 상수 동맥의 주입. ILG의 주입은 미국에 의해 확인된 위치에서 행해진다. 주입 깊이는 텍스트에 설명된 대로 계산됩니다(단계 5.8.6). 캘리퍼스 (바늘 뒤에 보이는)는 바늘이 주입하기 전에 적절한 깊이에 놓여 있는지 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig13.jpg"> 그림 13: 배땀샘의 학문. 전형적인 tubulo-폐포 구조 (A)와 콘 A (B)의다음 주입과 정상적인 열등한 폐골 동맥의 조직 섹션, 구조의 effacement와 함께 현저한 림프구성 침투를 보여주는. 유사한 염증성 침윤제는 우수한 물기 땀샘에서 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig13large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="3">주입 방법</td>
			<td colspan="2">TBUT, 초</td>
			<td colspan="2">눈물 Osmolality, Osm /L</td>
			<td colspan="2">STT, mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>기준선</td>
			<td>사후 주입</td>
			<td>기준선</td>
			<td>사후 주입</td>
			<td>기준선</td>
			<td>사후 주입</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">평균 ± SEM, % 변화</td>
		</tr>
<tr>
<td>미국의 지도가 없는 ILG</td>
			<td rowspan="3">58.5 ± 1.5</td>
			<td>44.5 ± 7.7</td>
			<td rowspan="3">297 ± 4.9</td>
			<td>300 ± 3.8</td>
			<td rowspan="3">15.2 ± 0.9</td>
			<td>12.9 ± 2.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>%변경</td>
			<td>-23%</td>
			<td>1%</td>
			<td>-15%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.05</td>
			<td>p=0.36</td>
			<td>p=0.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>미국 가이드 ILG + PSLG</td>
			<td rowspan="3">59.4 ± 0.6</td>
			<td>11.4 ± 4.2</td>
			<td rowspan="3">296 ± 4.7</td>
			<td>326 ± 3.7</td>
			<td rowspan="3">15.1 ± 1.3</td>
			<td>10.7 ± 1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 변경</td>
			<td>-81%</td>
			<td>10%</td>
			<td>-29%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p&amp;0.0001</td>
			<td>p&amp;0.0001</td>
			<td>p&amp;0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>미국 가이드 ILG + PSLG + OSLG</td>
			<td rowspan="3">60 ± 0.0</td>
			<td>6.2 ± 1.3</td>
			<td rowspan="3">299 ± 2.9</td>
			<td>309 ± 2.8</td>
			<td rowspan="3">14.6 ± 0.9</td>
			<td>9.9 ± 1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 변경</td>
			<td>-90%</td>
			<td>3%</td>
			<td>-32%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p&amp;0.0001</td>
			<td>p&amp;0.008</td>
			<td>p&amp;0.002</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">모든 값은 나열된 땀샘에 Con A를 단일 주입한 후 6일째에 측정되었습니다. 모든 비교는 기준선에 만들어졌습니다. * ILG, 열등 한 물상 동맥; PSLG, 우수한 상구선의 팔피브랄 부분; OSLG, 우수한 상구선의 궤도 부분; 미국, 초음파.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 안구 건조 증험에 대한 주사 기술의 효과 및 주사 부위 수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">기준선</td>
			<td>제 6일</td>
			<td>제 13일</td>
			<td>제 21일</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 회 주입</td>
			<td>주사 2회</td>
			<td>3 회 주사</td>
		</tr>
<tr>
<td>TBUT, 초</td>
			<td rowspan="3">58.5 ± 1.5</td>
			<td>44.5 ± 7.7</td>
			<td>29.2 ± 7.8</td>
			<td>12.8 ± 3.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 변경</td>
			<td>-24%</td>
			<td>-50%</td>
			<td>-78%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.17</td>
			<td>p=0.001</td>
			<td>p&amp;0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>토즘, 오즘 /L</td>
			<td rowspan="3">297 ± 4.9</td>
			<td>300 ± 3.9</td>
			<td>308 ± 4.9</td>
			<td>313 ± 2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 변경</td>
			<td>1%</td>
			<td>4%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.36</td>
			<td>p=0.04</td>
			<td>p=0.003</td>
		</tr>
<tr>
<td>STT, mm</td>
			<td rowspan="3">15.2 ± 0.9</td>
			<td>9.3 ± 1.6</td>
			<td>12.9 ± 1.6</td>
			<td>7.4 ± 1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 변경</td>
			<td>-39%</td>
			<td>-15%</td>
			<td>-51%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.17</td>
			<td>p=0.13</td>
			<td>p=0.008</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">기준선을 비교했습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: DED의 기간에 ILG에 반복 된 Con A 주사의 효과.

이 기사에서는 궤도 해구 시스템의 모든 부분에 concanavalin A를 주입하여 토끼에서 급성 또는 만성 안구 건조 증을 유도하는 방법의 개발을 설명합니다. 이미 보고된 방법보다 우수한 이 방법은 약리학 적 제제의 연구에 적합한 안구 건조증의 재현 가능하고 안정적인 모델을 생성합니다.

코카나발린A에 의해 유도된 수성 결핍 안구 건조증의 토끼 모델: 약물 효능 연구에 적용

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

우리의 방법은 모든 홍엽 땀샘을 주입하고 주사를 반복하는 우리의 방법에 급성 또는 만성 수 있는 안구 건조 증의 누락된 신뢰할 수 있는 동물 모델을 제공합니다. 이 기술은 널리 변하는 크기의 땀샘과 우수한 홍추선까지 초음파 지침을 사용하여 열등한 lacrimal 선에 Concanavalin A를 안정적으로 전달하여이 방법을 완전한 접근법으로 만듭니다. 이 모델은 수성 결핍 안구건조증을 유발하는 간단하고 최적화된 비수술적 수단을 제공합니다.그것은 약물 효능 및 질병 병리생리학을 연구하는 데 적합합니다. 후방 부신을 식별하고 초음파 국소화를 활용하는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다. 모든 모피를 제거하는 것은 이 두 단계에 대한 초음파 현지화를 돕는 데 중요합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 웨이 황 (Wei Huang)이 될 것입니다. 이어 로브가 더 이상 완전히 똑바로 똑바로 있지 않은 편안한 헤드 위치를 관찰하여 가벼운 진정효과를 확인한 후 마이크로파이프를 사용하여 방부제 프리 리도카인 25마이크로리터를 첫 눈에 바르고 눈꺼풀 사이에 유연한 와이어 뚜껑 스펙큘럼을 배치합니다. 0.3 개의 집게를 사용하여 정점에 틈새 멤브레인을 잡고 각막 위로 확장하십시오.26 게이지 날카로운 바늘을 사용하여, 1:100, 000번째 피네프린으로 리도카인을 1%를 틈새 막의 기지에 미묘하게 주입한다. 적당한 흠은 멤브레인 위에 형성되어야 합니다. 그런 다음 스펙큘럼을 제거하고 왼쪽 틈새 막에 동일한 주사를 내십시오.약 5분 후 뚜껑 을 다시 동료 눈에 넣고 0.3 개의 집게를 사용하여 정점에 있는 틈새 막을 철회하십시오. Westcott 가위를 사용하여 틈새 멤브레인을 기지에서 자르고 스펙큘럼을 제거합니다. 그런 다음 국소 항생제 연고를 눈에 놓습니다.우수한 홍엽 동맥 주입의 palpebral 분배의 경우, 퇴적을 확인한 후, 전 궤도 및 두피 영역에서 모피를 전단하고 탈필 크림을 사용하여 잔류 털을 완전히 제거합니다. 2 분 후 크림을 제거하고 적절한 눈에 1 % 방부제무료 리도카인의 25 마이크로 리터를 적용합니다. 상부 눈꺼풀에 에버트하고 선의 팔페브랄 부분을 표시하는 프로튜브랜스가 보일 때까지 후방 궤도 림에 부드러운 내측 압력을 가한다.27 게이지 바늘이 장착된 미세톱 집게와 결핵 주사기를 사용하여, 직접 조직에 바늘 2 밀리미터를 진행 하는 변전 하는 방법을 통해 동맥을 관통 하 고 주입 후 Concanavalin A 또는 Con A.의 500 마이크로 그램 솔루션의 100 마이크로 리터를 주입, 궤도 우수한 lacrimal 동맥 후부에서 돌출 하는 궤도 우수한 lacrimal 동맥을 일으킬 세계에 내측 압력을 적용. 닫힌 곡선 포셉을 사용하여 두개골의 뼈 개구부가 느껴질 때까지 부위를 들여쓰기하고 바늘 배치의 랜드마크역할을 하기 위해 피부에 들여쓰기를 남기기 위해 집게로 더 겸손한 압력을 가합니다. 27 게이지 바늘을 장착한 결핵 주사기를 삽입하여 27게이지 바늘을 피부에 수직으로 삽입하여 절개 부위에 약 1분기 인치 를 삽입하고 주사 부위와 뼈 궤도 림 사이의 중간점을 목표로 하는 측면 캔투스쪽으로 바늘을 후방 및 외부로 리디렉션합니다.바늘의 허브에 도달하면, 천천히 0.2 밀리리터의 1, 000 마이크로그램 용액을 Con A.For ILG 주사에 대고, 궤도의 하부 전방 부분을 따라 ILG의 우위를 찾기 위해 옆에서 동물을 본다. 외과 마킹 펜을 사용하여 ILG 선의 피상적 인 부분이 zygomatic 뼈의 피상적 인 휴식 장소에서 궤도의 더 많은 내측 위치로 이동하는 피부에 수직 선을 그립니다. 지고성 뼈의 끝을 확인하기 위해 피부의 라인을 가로 질러 수직으로 개최 된 초음파 프로브를 쓸어.ILG 전환은 선의 이미지가 인식 가능한 내측 테두리없이 둘레의 고초 선에서 하나로 변경되는 곳에서 발생합니다. 이러한 변화가 관찰될 때 피부에 그려진 선에 핸드피스의 상대적 위치는 사출 부위가 될 것이다. 콘 A를 zygomatic 아치 뼈에 내다식하는 지점에서 선에 배치하려면, zygomatic 뼈 초반향 신호의 깊이와 바늘의 알려진 길이를 뺀 1 밀리미터로 원하는 주입 깊이를 설정합니다.체내에 약 12밀리미터의 바늘을 삽입한 후 체내의 노출바늘길이가 계산된 차이와 같을 때까지 천천히 철수한다. 그런 다음 Con A 용액의 1, 000 마이크로그램의 0.2 밀리리터를 주입하고 초음파에 의한 주사의 성공을 확인합니다. ILG는 특징적인 초반향 공간을 전시해야 합니다.Con A 주사는 눈물 생성감소를 동반하는 조밀한 림프구성 침투를 특징으로 하는 눈물 선상에서 강한 염증 반응을 유도한다. 눈물 유산부페린 수준은 절각과 결막 상피및 증가된 장미 벵골 염색의 결과로 억압됩니다. 3개의 궤도 LG 조직의 주사는 일관되고 균일한 안구건조증 상태를 생성합니다.Con A 주사의 한 세트는 10일까지 정상화되는 모든 임상 파라미터와 함께 약 1주일 동안 지속되는 안구건조증 질환을 일으킵니다. 순차콘 A 주사는 약 1주일 간격으로 안구건조증질환의 지속시간을 이에 따라 연장한다. 주사의 대략 5 세트 후에, 안구 건조 병 상태는 수시로 추가 주사를 위한 필요 없이 영구하게 됩니다.절기 동맥 구조를 최적으로 지역화하는 것이 가장 중요합니다. 두개골 해부학에 친숙하고 초음파를 이용한 기술과 함께 모피제거를 포함한 미세한 디테일에 대한 주의가 모두 결과를 향상시킨다. 이 간단한 기술은 날카로운 사용을 필요로하기 때문에, 조사는 바늘 스틱 부상을 방지하기 위해 적절한 예방 조치를 취해야한다.

a-rabbit-model-aqueous-deficient-dry-eye-disease-induced-concanavalin

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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, 분리의 재현성 및 유지 높이 실험 망막 박리를 작성하고, 망막 하 출혈없이하는 망막 질환의 광 수용체 세포 손실의 병태 생리를 공부하고 잠재적 인 치료 개입을 평가하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 세부 사항에 이러한 방법을보고한다.

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