Name: 세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 종양 미세환경에서 혈관 투과성을 평가하는 세포 내 이미징 및 고정 조직 분석 방법을. 고분자량 덱스트란을 사용하여 암 세포 전이 가능성을 측정하고 실시간 종양 역학을 연구할 수 있습니다.

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우리는 화상 진찰 지원을 위한 알버트 아인슈타인 의과 대학에 있는 분석 화상 진찰 시설 (AIF)에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NCI (P30CA013330, CA150344, CA150324, CA216248), SIG 1S10OD019961-01, 그루스 -리퍼 바이오 포토닉스 센터 및 통합 이미징 프로그램, 몬테피오레의 루스 L Kirsch 2 의 교육에서 보조금에 의해 지원되었다. 종양 미세 환경 연구 (CA200561).

GSK는 원고를 공동 작성하고, 도 면 1C 및 3B에 대한 이미징을 수행하고, 고정 조직 분석 프로토콜을 개발하고, 모든 데이터를 분석하고 해석합니다. JMP는 원고를 공동 작성하고, 도 1B,2C 및 3A에 대한 수술 및 사내 영상을 수행; LB & AC는 도 2B에 대한 수술 및 인바이탈 이미징을 수행; RJ는 도 2A에 대한 수술 및 활력 내 이미징을 수행; JSC는 원고를 공동 작성하여 모든 데이터를 분석하고 해석했습니다. MHO는 원고를 공동 작성하여 모든 데이터를 분석하고 해석했습니다. DE는 도 2D를 위한 수술 및 활력 내 이미징을 수행하고, 원고를 공동 작성하고, 고정 조직 분석 및 활력 내 이미징 프로토콜을 개발하고, 모든 데이터를 분석하고 해석했다.

저자는 이해 관계의 충돌을 공개하지 않습니다.

여기에서는 TMEM 출입구에 존재하고 혈관 이체의 중단과 연관된 특정 유형의 혈관 투과성을 시각화하고 정량화하기 위해 적용할 수 있는 두 가지 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 혈관 투과성의 이 모형은5위에 설명된 것과 같이 삼자 TMEM 세포 복합체에 의해 일시적이고 통제됩니다. TMEM 관련 혈관 투과성을 확인하고 정량화하는 능력은 종양에 대한 기존의 세포 독성 요법의 효과를 조사하는 전이성 암 세포 미세 환경의 평가뿐만 아니라 전임상 연구에 매우 중요합니다. 미세 환경뿐만 아니라 표적 및 비 표적 치료의 전이성 전이성 잠재력. 중요한 것은, 우리는 이 평가가 고정된 조직에 있는 선인 화상 진찰 또는 면역 형광에 의해 행해질 수 있다는 것을 여기에서 설명했습니다. 두 방법 모두 장점과 단점이 있습니다. 혈관 투과성의 동적 프로세스를 직접 시각화 할 수 있지만 전문 장비와 훈련이 필요합니다. 한편, 고정 조직에서 수행되는 면역형광은 정적 이미지만을 제공하지만 대부분의 실험실에서 일상적으...

암 전이에 대한 우리의 이해에 있는 최근 어드밴스는 상피-중간엽 전이 (EMT) 및 철새/침략적인 암 세포 소집단의 유도가, 그 자체로, 혈류 보급을 위해 충분하지 않다는 것을 발견했습니다 1. 실제로, 종양 관절이 종종 낮은 pericyte 커버리지를 특징으로하기 때문에 암 관련 내피의 전체를 통해 암 세포를 전이하는 것은 매우 투과성이 고도로 투과성이 있다고 생각되었다. 불안정한2,3,4. 종양 내의 불완전한 기능의 높게 암시하더라도, 발암 도중 혈관 수정은 종양 세포가 통제되지 않는 방식으로 혈관을 쉽게 관통할 수 있다는 것을 se 당 증거를 제공하지 않습니다. 종양 세포가 형광 태그가 부착되고 혈관 구조가 형광 프로브의 정맥 주사를 통해 표지되는 Intravital 이미징 (IVI) 연구에서 얻은 통찰력은 종양 혈관이 균일하게 진행되는 동안 형광 프로브 (예 : dextran 또는 양자점)의 정맥 주사를 통해 표지됩니다. 낮은 분자량 덱스 트랜스 (예를 들어 70 kD), 고분자 덱스 트랜스 (155 kD) 및 종양 세포에 투과성 혈관 분기 점에 우선적으로 위치한 내화의 전문 부위에서만 내피를 교차 할 수 있습니다5, 6개 , 7.동물 모델과 인간 환자 유래 물질을 사용한 면역성 화학 (IHC) 분석은 이러한 사이트가 혈관 투과성을 국부적으로 및 일시적으로 조절하는 "출입구"임을 보여주었습니다. 순환을 입력 하는 철새/침략적인 암 세포에 대 한 기회. 이러한 출입구는 "전이의 종양 미세 환경"또는 "TMEM"이라고하며, 예상대로, 그들의 밀도는 유방암 환자에서 전이성 질환을 개발할위험이 증가와 상관 관계 8,9, 10.
각 TMEM 출입구는 세 가지 유형의 세포로 구성되어 있습니다: 시막 대식세포, 액틴 조절 단백질 포유류 를 과도하게 발현하는 종양 세포(Mena), 및 내피 세포, 모두 서로 직접 적인접촉1, 5,9,10,11,12,13. TMEM이 내막통로로서의 기능을 위한 주요 이벤트는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 근간 대식세포(14)에 의해 기본 혈관상에국지화방출하는 것이다. VEGF는 내피 세포15,16,17,18,19,일시적인 혈관 누설을 초래하는 현상, 또한 사이의 상모 접합을 방해 할 수 있습니다. IVI 연구에 설명 된 대로 "파열"투과성으로 알려진 5. TMEM 대식세포는 VEGF 매개 TMEM 기능 및 이러한 대식세포의 호밍에 필요한 티로신 키나아제 수용체 TIE2를 경측틈새 시장5,20,21로 발현하는 것으로 나타났다. , 22. 암 세포 보급 및 전이를 조절하는 것 외에도 TIE2+ 대식세포는 종양 혈관 신생의 중심 조절자로 나타났습니다21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. 이와 같이, TIE2+ 대식세포는 종양 미세환경 및 전이성 캐스케이드의 주요 조절제의 중요한 성분을 나타낸다.
TMEM 매개 혈관 투과성 (즉, "파열")을 더 잘 개념화하려면 내피 세포 - 세포 접합의 용해와 관련이없는 다른 혈관 투과성 모드와 구별하는 것이 매우 중요합니다. 손상되지 않은 내피 (단단하고 접합 접합이 중단되지 않는 혈관 투과성)의 세 가지 주요 유형이 있습니다 : (a) 섭취 된 물질의 트랜스 시토시스에 결합 될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. (b) 내피페네스트라를 통한 물질의 수송; (c) 내피 단단한 접합부15,16,17,18,19,32에 의해 조절되는 파라셀룰러 통로를 통한 물질의 수송 , 33세 , 34. 비록 많은 종양에서 조절되었지만, 앞서 언급한 혈관 투과성 모드는 정상 조직 생리학 및 항상성의 맥락에서 주로 기술되어 왔으며, 그 중 극단은 제한된 투과성을 가진 조직이다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽, 혈액-고환 장벽), 또는 풍부한 투과성(예를 들어, 신장 사구체 장치의 페네스티드 모세혈관)34,35,36,37.
다광체 내 화상 진찰 및 다중면역형 광형 현미경 검사법을 사용하여, 우리는 유방 종양에 있는 TMEM 중재한 관 투과성 ("파열") 및 유방 종양에 있는 관 투과성의 그밖 모드 사이에서 구별할 수 있습니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 마우스에서 고분자, 형광 표지 프로브의 단일 정맥 주입을 수행합니다. 자발적인 파열 이벤트는 다음 라이브 마우스에서 활력 내 이미징을 사용하여 캡처 할 수 있습니다; 또는 대안적으로, 프로브의 외삽은 혈액 혈관 구조 (예를 들어 CD31+ 또는 Endomucin +) 및 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 TMEM 출입구와 공동 국소화 연구에 의해 정량화 될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 독립적으로 또는 서로 함께 사용할 수 있는 이러한 기술을 모두 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>안티 토끼 IgG (Alexa 488)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>안티 랫트 IgG (Alexa 647)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>염 Eng Scientific Inc</td><td>9770</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 슬립</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72296-08</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>헨켈 접착제</td><td>1647358</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1490</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란-테트라메틸-로다민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T1287</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>엔도무신(1차 항체)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td></td></tr><tr><td>엔로플록사신</td><td>바이엘</td><td>84753076 V-06/2015</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마 알드리치</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>피쉬 스킨 젤라틴</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>벡톤 디킨슨</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>이소플루오란</td><td>헨리 샤인</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>마트리겔</td><td>코닝</td><td>CB40234</td><td>인공 세포 외 매트릭스</td></tr><tr><td>바늘 (30 G)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>PBS</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>맥박 산소 농도계</td><td>Kent Scientific</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Dots</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>Q21561MP</td><td></td></tr><tr><td>Rubber</td><td>McMaster Carr</td><td>1310N14</td><td></td></tr><tr><td>TMR (primary antibody)</td><td>Invitrogen</td><td>A6397</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biologicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>184835</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

암 관련 사망의 가장 흔한 원인은 전이이며, 1 차 종양에서 이차 부위로 암세포를 보급해야하는 과정입니다. 최근에, 우리는 1 차적인 유방암에 있는 암 세포 보급이 폐에 있는 전이성 사이트에 전이의 종양 MicroEnvironment에게 불린 출입구에서만 발생한다는 것을 설치했습니다 (TMEM). TMEM 출입구 번호는 유방암 환자에서 전이성 질환의 먼 재발에 대한 예후입니다. TMEM 출입구는 이 두 세포가 혈액에 단단히 결합되어 있는 TIE2및 VEGF의 상부를 발현하는 경막, proangiogenic 대식세포와 직접 접촉하여 액틴 조절 단백질 Mena를 과발현하는 암세포로 구성됩니다. 혈관 내피 세포. 암세포는 TMEM 관련 대식세포 및 TMEM 관련 메나 발현 암 세포의 관절 활성에 의해 조율된 일시적인 혈관 투과성으로 인해 TMEM 출입구를 통해 인트라스타시화할 수 있다. 이 원고에서, 우리는 TMEM 중재한 과도 혈관 투과성의 평가를 위한 2개의 방법을 기술합니다: 활력 화상 진찰 및 고정된 조직 면역 형광. 두 방법 모두 장점과 단점을 가지고 있지만, 두 가지를 결합하면 TMEM 기능을위한 미세 환경 전제 조건뿐만 아니라 TMEM 매개 혈관 투과성의 가장 완벽한 분석을 제공 할 수 있습니다. 유방암에 있는 전이성 프로세스, 및 가능하게 그밖 모형암때문에, TMEM 출입구를 통해암세포 보급을 관련시키기 때문에, TMEM 출입구 활동의 분석을 위한 잘 확립된 방법을 채택하는 것이 필수적입니다. 여기에 설명된 두 가지 방법은 암세포를 예방하는 제제의 전임상 시험에서 가장 중요한 순진한 동물또는 약리학적으로 처리된 동물에서 TMEM 출입구 활성 분석에 대한 포괄적인 접근법을 제공합니다. TMEM을 통해 보급될 수 있습니다.

이 프로토콜 문서에 설명된 실험 절차는 그림 1 A-C에간략하게 요약되고 설명되어 있습니다.
TMEM 매개 혈관 투과성("파열 활성")을 측정하고 다른 혈관 투과성 모드(즉, 소개에서 설명한 대로 세포 간 및 파라셀룰러)의 실험 소음을 줄이기 위해 정맥 내(i.v.) 155 kDa Dextran과 같은 고분자량 프로브를 테트라메틸 로다민에 공액화합니다. 낮은 분자량 덱스트랜스는 혈관 투과성의 세 가지 모드를 구별하지 않았다. 우리의 이전 경험은 155 kDa TMR-Dextran의 전신 순환이 유선 및 폐와 같은 두 정상 조직의 혈관 구조뿐만 아니라 신생물 조직(그림2A,B)을효율적으로 표시했다는 것을 지적했습니다. 원발성 유방암 및 유방암은 폐에서 전이 (그림2</strong...

우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

이러한 보완 기술은 고분자 체중 Dextran을 사용하여 종양 혈관의 투과성을 평가하고 측정합니다. 고정 조직 프로토콜은 더 큰 종양 엄호를 제안하고, 높은 처리량이고, 다중 광자 화상 진찰 장비를 요구하지 않습니다. 한편, 인트라베이티 이미징 프로토콜은 전이 또는 TMEM의 종양 미세 환경에서 세포의 운동, 기능 및 동적 상호 작용에 대한 실시간 정보를 제공한다.따라서 여기에 제시된 프로토콜은 암 세포 보급과 강하게 상관관계가 있는 TMEM 의존혈관 투과성의 직접적인 측정을 가능하게 하기 때문에, 따라서 이러한 프로토콜은 종양의 전이성 전위를 평가하기 위하여 이용될 수 있다. 이식에 적합한 종양 조직의 조각을 생성하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 종양 을 베어링 마우스의 안락사로 시작합니다. 연기 후드에 얼음에 DMEM / F12 세포 배양 배지와 페트리 접시를 배치합니다.연기 후드에 마우스를 가지고 70 %에틸 알코올마우스의 복부를 살균. 멸균 장갑과 수술 도구를 사용하여 종양을 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. 작은 조각으로 종양을 잘라, 그들은 페트리 접시에있는 동안 어떤 괴사 부분을 폐기.종양 조각을 받는 호스트로 이식하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 유전자 조작된 형광표 대식세포로 자란 마우스를 마취시킵니다. 마취를 약 3%로 줄이고 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 적용합니다. 마우스의 네 번째 유방 선 이상에서 머리를 제거합니다.살균으로 피부를 청소 한 후 살균 된 계측기를 사용하여 네 번째 젖꼭지보다 약 2 ~ 3 밀리미터 작은 절개를하십시오. 매머 지방 패드가 노출 될 때까지 해부. 페트리 접시에서 종양 조각을 가지고 인공 세포 외 매트릭스에 코트.네 번째 유방 지방 패드 아래에 종양을 이식. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 절개를 닫습니다. 마지막으로, 동물의 식수에 enrofloxacin 항생제의 1 밀리리터를 추가합니다.마우스를 마취하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 꼬리 정맥 카테터를 삽입합니다. 성기보다 즉각적으로 발간되는 세로 중형 절개를 만들고 네 번째 유방 선의 우수한 측면의 수준으로 절개를 수행하십시오. 네 번째 유방 선의 우수한 측면에 절개 횡단을 수행.이 시점에서 혈액 공급을 손상시키지 않도록하는 것이 중요합니다. 플랩의 피부 쪽에 2센티미터 크기의 단단한 고무조각을 부착하여 피부 플랩을 안정화시하십시오. 종양은 고무에 의해 안정화되는 영

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Research

연구

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Cancer Research

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우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

여기에서는 혈액 뇌 장벽 전이성 종양 미세 환경을 준비하고 배양한 다음 공초점 이미징 및 인공 지능 (기계 학습)을 사용하여 상태를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다.

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

이것은 암 전이의 억제제 또는 드라이버를 위해 검열하는 효과적인 방법입니다. 발현 라이브러리로 변환된 세포는 전이성 콜로니를 형성하기 위해 닭 초리오알란토아막 혈관에 주입됩니다. 감소 또는 증가 된 침략을 갖는 식민지는 절제, 확장, 자신의 표현형을 확인하기 위해 재주입, 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석.

신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

Intravital microscopy 결과의 번역은 조직에 대한 얕은 깊이 침투로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 직접적인 공간 상관 관계를 위해 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식(예: CT, MRI)을 함께 정합할 수 있는 등쪽 창 챔버 마우스 모델에 대해 설명하며, 이를 통해 생체 내 현미경 검사 결과의 임상 번역을 간소화할 수 있습니다.

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

배우세요 종양 미세환경에서 혈관 투과성을 평가하는 세포 내 이미징 및 고정 조직 분석 방법을. 고분자량 덱스트란을 사용하여 암 세포 전이 가능성을 측정하고 실시간 종양 역학을 연구할 수 있습니다.

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