이중 루시파라제 기자 시스템을 통해 포유류 세포에서 CRISPR 플라스미드 의 건설 및 녹아웃 효율 검출

이 프로토콜은 효율적인 sgRNA 벡터의 생성 및 최적화의 주요 단계를 설명합니다. 후보 sgRNA의 사전 가속은 상대적인 시간과 추론을 대상으로 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 내인성 유전자를 편집하지 않고 각 sgRNAs에 대한 DNA 코딩 노출을 분석할 수 있게 한다는 것입니다.

이 사전 선택 방법은 또한 이중 좌초 된 휴식을 통해 다른 유전자 편집 측정에 적용 될 수있다. 리옹화된 올리고뉴클레오티드를 이중 증류수에 10마이크로몰라의 최종 농도로 희석하는 것으로 시작합니다. 추가 버퍼를 추가하지 않고 1 대 1 비율로 얇은 벽PCR 튜브에서 앞뒤로 올리고뉴클레오티드를 혼합합니다.

혼합물을 섭씨 95도에서 5분간 배양한 다음 온도를 섭씨 72도까지 10분간 내려갑니다. PCR 기계에서 올리고뉴클레오티드 믹스를 제거하고 실온에서 냉각할 수 있습니다. pX330-xCas9 벡터를 Bbs1과 소화하려면 벡터, 효소 및 소화 버퍼를 50 마이크로리터 부피로 결합하고 2시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다.

세포 변환을 수행 한 후, LB 플레이트에서 5 ~ 10 세균 성 식민지를 선택하고 1.5 밀리리터 튜브에 60 밀리그램 암피실린으로 LB 미디어의 1 밀리리터를 접종하기 위해 각각을 사용합니다. 그런 다음 회전 셰이커에 튜브를 2~3시간 동안 배양합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 재조합 플라스미드를 검사하기 위해 PCR을 수행한 다음 10볼트%에서 2%의 아가로즈 젤로 제품을 실행합니다.

양성 플라스미드를 식별한 후, 기자 벡터와 함께 적절한 세포줄을 공동 트랜스펙트하기 위해 이를 사용하십시오. 세포를 lyse하려면 배양 된 세포에서 성장 배지를 제거하십시오. PBS로 배양 용기의 표면을 부드럽게 세척하고 각 배양에 PLB 100 마이크로리터를 분배하여 세포 모노 층을 완전히 덮습니다.

플레이트가 실온에서 20분 동안 배양한 다음, 용하를 튜브 또는 바이알로 옮겨 추가 처리 또는 보관을 합니다. 이중 루시파라제 분석기를 수행하려면 발광계를 프로그래밍하여 2초 사전 판독 지연을 제공하고 10초 측정 기간을 입력합니다. 그런 다음, 100 마이크로리터의 루시파라제 분석 시약을 적절한 수의 광미계 튜브에 분배합니다.

조심스럽게 20 마이크로 리터의 셀 리세이터를 발광계 튜브에 넣고 2 ~ 3 번 파이프를 섞습니다. 튜브를 발광계에 놓고 판독을 시작합니다. 광노미터에서 샘플 튜브를 제거합니다.

100 마이크로리터의 스톱 시약과 소용돌이를 짧게 추가하여 섞어보세요. 샘플을 발광계로 반환하고 읽기를 시작합니다. 반딧불 루시파아제 활동, 특히 화면에 표시되는 비율의 상호 작용으로 정규화된 Renilla Luciferase 활동을 기록합니다.

완료되면 반응 튜브를 폐기하십시오. 이 방법은 양 DKK2 엑슨 1에 대한 3개의 sgRNA 벡터를 생성하는 데 사용되었다. sgRNA 및 xCas9 발현 벡터는 벡터 백본을 미리 소화한 다음, 어닐링 올리고 쌍을 통해 일련의 짧은 이중 가닥 DNA 단편으로 리칭하여 제작되었다.

7개의 세균성 식민지는 특정 프라이머 쌍 유도 PCR로 검열되었고 양성 식민지가 검출되었다. pX330-xCas9 T1, T2 및 T3의 유전자 표적화 용량은 이중 루시파아제 분석으로 동시에 검출되었다. 마지막 sgRNA 벡터는 가장 높은 검출 신호를 표시하고 그 후에 양 유전자 편집 연구를 위해 이용되었습니다.

이 프로토콜에 따라 T7EI 분석또는 리보누클리스 분석이 수행될 수 있습니다. 이 추가 측정은 내인성 유전자 편집의 더 정확한 인상을 줍니다.