Name: 광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 광견병 백신 효능을 평가하는 간접 ELISA 샌드위치 면역포착법을 사용하는 방법을. 중화 단클론항체(mAb-D1)를 활용하여 당단백질 삼량체를 인식하고, 동물실험을 대체하는 신뢰할 수 있는 시험관 내 대안을 제공합니다.

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실비 모르게오 박사와 장 미셸 채프살 박사는 백신 배치에 대한 ELISA 분석 결과를 확립하고 국제 워크샵 및 공동 연구를 조직하기 위해 주요 참여를 인정받아야 합니다. 우리는 원고의 비판적 독서사브리나 칼리에게 감사드립니다. 피에르 페린 박사는 mAb-D1의 격리와 특성화를 담당했습니다. 이 작품은 주로 인스티투트 파스퇴르 자금조달에 의해 지원되고 있습니다.

1. 보안 예방 조치
참고: 이 방법은 살아있는 RABV 및 불활성화 백신 모두에 적용됩니다.
<ol><li>좋은 실험실 실습 및 안전 절차를 사용하십시오.</li>
	<li>일회용 코트, 장갑, 마스크, 안경 등을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.</li>
	<li>살아있는 바이러스가 적정되면, 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛을 사용한다.<ol>
<li>시료(시약, 세척용액 등)와 접촉하는 모든 물질을 전염성 물질로 고려하십시오.</li>
		<li>오염 물질을 표백제 용액(하이포아염소산나트륨 2,5%)에 30분 간 침지하여 오염물질을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>우수 실험실 관행에 따라 화학 물질을 취급하십시오.</li>
</ol>2. 준비
<ol><li>가능한 한 분석 등급 시약을 사용하십시오.</li>
	<li>코팅 버퍼/탄산염 버퍼, 패시베이션 버퍼, 희석제 및 구연산염 완충액(표1)의신선한 용액을 준비하고 0.45 또는 0.22 μm 필터를 통해 필터를 사용하고 분석 순도를 보존하기 위해 사용 하기 전 하루 동안 4 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>시약이 사용 30분 전에 실온(+18°C ~ +25°C)에 도달하도록 하고 사용하기 전에 부드럽게 혼합하여 균질화합니다.</li>
</ol>3. 마이크로 플레이트 과민화
참고: 다량의 면역 글로불린을 결합하도록 최적화된 96개의 잘 흡착 면역 분석 판을 사용하십시오(예: 재료 표참조).
<ol><li>각각의 우물에, 탄산염 완충액에서 희석된 단일클론 항체(mAb-D1)의 200 μL을 첨가한다. 참고: 약 1 μg/mL의 최적 농도가 실험적으로 결정되었으며 정제된 mAb-D1의 대략 1/2000 희석에 해당합니다. 이 권장 농도 각 mAb-D1 배치에 대 한 표시 하 고 주기적으로 긍정적인 제어와 확인 해야 합니다.</li>
	<li>접착제 필름으로 플레이트를 덮고 가습 된 분위기에서 37 °C에서 3 시간 동안 마이크로 플레이트를 배양하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 흡입하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 잘 함량을 옮김을 옮김.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 5 분 동안 건조시키십시오.</li>
</ol>4. 마이크로 플레이트 패시베이션
<ol><li>각 우물에 패시베이션 버퍼의 300 μL을 추가합니다.</li>
	<li>접착제 필름으로 플레이트를 덮고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수용자에게 잘 함량을 옮김을 옮김.</li>
	<li>마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오. 참고: 마이크로플레이트는 사용 전까지 최대 3개월 동안 -20°C에서 즉시 사용하거나 밀봉하여 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 엘리사 분석
참고: 참조 백신의 제어 곡선을 설정하기 위해 5.3 단계는 필요하지 않습니다. 시험된 백신을 적대하기 위해서는 모든 단계 5.1 ~ 5.6이 필요하다.
<ol><li>과민성 마이크로 플레이트의 세척<ol>
<li>각 우물에 세척 버퍼의 300 μL을 추가합니다.</li>
		<li>조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수용자에게 잘 함량을 옮김을 옮김.</li>
		<li>5.1.1 단계와 5.1.2 단계를 5번 더 반복하여 감작 판을 광범위하게 세척합니다.</li>
		<li>마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>대조군 곡선에 대한 기준 백신의 희석<ol>
<li>광견병 바이러스 당단백질의 농도10 μg/mL에 해당하는 증류수의 1 mL에서 기준 백신(유효성 검사 항원 Lot 09)을 재구성한다.</li>
		<li>광견병 바이러스 당단백질의 1 μg/mL에 도달하기 위해 희석제에서 재구성된 기준 백신의 10배 희석을 준비한다.</li>
		<li>표 1에나타낸 바와 같이 희석제에서 이러한 기준 백신의 6개의 직렬 2배 희석을 준비한다.</li>
		<li>희석제의 200 μL을 중복(wells 1H/2H)에 분배하여 블랭크 대조군으로 한다.</li>
		<li>각 기준 백신 희석의 웰당 200 μL을 중복으로 분배합니다(우물 G1/G2에서 A1/A2).</li>
	</ol></li>
	<li>적정에 대한 테스트 된 백신의 희석<ol>
<li>희석제에서 시험된 백신의 10배 희석을 준비한다.</li>
		<li>표 2에나타낸 바와 같이 희석액으로 시험된 백신의 7개의 2중 직렬 희석을 준비한다.</li>
		<li>각 테스트 된 백신 희석의 웰 당 200 μL을 중복 (우물 H3 / H4에서 A3 / A4)을 분배하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>ELISA 플레이트의 인큐베이션/세척<ol>
<li>미플레이트를 접착제 필름으로 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>필름을 제거하고 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 함량을 2,5 % 하이포 아염소산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 옮니다.</li>
		<li>각각잘 300 μL의 세척 버퍼를 추가합니다.</li>
		<li>조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 각 웰의 함량을 옮김.</li>
		<li>5.4.3 단계 및 5.4.4 단계를 5회 반복하여 언바운드 항원을 제거하고 코팅된 항체(mAb D1)에 결합된 G 단백질 트리머를 보존한다.</li>
		<li>마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>과산화아제 컨쥬게이드 mAb-D1의 결합<ol>
<li>희석제(대략 1μg/mL의 대략 농도)에 과산화재 표지된 mAb-D1의 권장 희석(1/2000)의 웰당 200 μL을 분배합니다. 각 mAb-D1 배치에 대해 권장 농도가 표시되며 긍정적 인 대조군으로 주기적으로 검증되어야합니다.</li>
		<li>미플레이트를 접착제 필름으로 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>필름을 제거하고 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 함량을 2,5 % 하이포 아염소산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 옮니다.</li>
		<li>각각의 웰에, 300 μL의 세척 버퍼를 첨가한다.</li>
		<li>조심스럽게 흡인하고 2,5 % 하이포 염산 나트륨 용액을 함유 한 수령인에게 각 웰의 함량을 옮김.</li>
		<li>5.5.4 단계 와 5.5.5 를 5 회 반복하여 언바운드 과산화아제 표지 항체 (mAb D1)를 제거합니다.</li>
		<li>마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡착제 종이에 1 분 동안 건조시키십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>기질 염색체를 이용한 계시<ol>
<li>기질-크로모겐 용액의 웰당 200 μL을 분배합니다.</li>
		<li>필름으로 마이크로 플레이트를 밀봉하고 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 황색-주황색은 결합된 과산화아제 표지 된 항체 (mAb D1)의 양에 비례하는 강도를 개발합니다.</li>
		<li>잘 당 50 μL의 정지 용액을 추가하여 반응을 중지합니다.</li>
		<li>신중하게 마이크로 플레이트의 바닥을 닦아 모든 사용 웰의 492 nm에서 광학 밀도 (OD)를 결정하기 위해 분광광도계에 배치 : 음성 제어 (빈), 참조 백신 및 테스트 백신.</li>
		<li>분석을 위해 .xls 또는 .xlsx 파일 형식으로 OD 데이터를 수집합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>광학 밀도(492 nm)의 함수로서 기준 백신 곡선, 트리메릭 당단백질 함량을 그립니다.<ol>
<li>기준 백신의 다른 희석에서 각 중복에 대해 492 nm에서 평균 OD를 계산합니다(표 2의G1/G2에서 A1/A2까지)</li>
		<li>계산된 각 평균 OD에서 공백의 평균 OD(표 2의웰, H1/H2)를 뺍니다.</li>
		<li>수직 축(선형 눈금)에 결과 OD 값을 플롯하고 수평 축(로그가리축)에 당단백질 트리머(ng/mL)의 해당 농도를 플로팅합니다.</li>
		<li>점을 결합하여 참조 곡선을그립니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

mAb-D1에 의해 인식된 에피토프는 RabV 당단백질의 항원 부위 III에 위치하며 이는 VNAbs의 유도를 위한 면역 지배적일 뿐만 아니라 또한 신경성, 병원성40,,41 및 수용체인식에관여한다. 당단백질, 부위 II43을따라 또 다른 중요한 항원 부위가 있는데, 이에 대해 mAb-WI-111235와같은 여러 MAb가 분리되었다. 이들은 또한 실험의 유사한 모형에서 이용될 수 있습니다.
ELISA에 의한 이러한 시험관내 방법의 한 가지 제한은 시험될 광견병 바이러스 균주에 사용된 mAb에 의해 인식되는 에피토프의 필요한 보존에 상주한다. 지금까지, 인간 광견병 백신에 사용되는 모든 고전적인 긴장은 mAb-D1에 의해 인식됩니다. 동물 백신에 사용...

50년 이상 부터, NIH 시험1은 일괄 방출 전에 광견병 백신 효능을 평가하는 금 본위제 방법으로 사용된다. 이 시험은 광견병 바이러스 (RABV)의 도전 바이러스 표준 (CVS) 긴장으로 14 일 후에 시험될 백신을 가진 마우스의 군의 복강 내 면역으로 이루어져 있습니다. 효능은 IC 도전에서 살아남은 마우스의 비율에서 평가됩니다. WHO2 와 유럽 약전3은 여전히 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트를 필요로하지만,이 테스트는 몇 가지 장애물을 겪습니다 : 결과는 매우 가변적4; 전염성 RABV는 도전 도중 사용되며 이것은 기술적 인 기술과 엄격한 생물 안전 조치를 모두 필요로합니다. 많은 수의 동물이 사용되고 있으며, 도전의 심각성은 심각한 윤리적 우려를제기5. 이 시험의 보다 적게 가혹한 변이는 개발되었습니다: 복막 내 면역 화 후에 2 주, 마우스는 IC에 의해 도전되지 않습니다 그러나 시험관외 중화 시험을 사용하여 그들의 혈청에 있는 특정 RABV 중화 항체 (VNAbs)의 존재를 위해 시험을 보았습니다. 그러나, 이 시험은 이미 수의학 백신6,,7에 사용되고 인간 백신8에대해 고려되고 있지만 많은 수의 실험실 마우스를 희생해야한다.
현재, 국제9 및 유럽10 권고 는 제조 업체와 국가 제어 실험실을 장려 (공식 의학 제어 실험실 - OMCLs) 실험실 동물 테스트의 교체를 구현, 감소, 그리고 실험실 동물 테스트의 정제, 3Rs 전략으로 언급. 동물의 보호 및 복지와 관련된 유럽 지침 2010/63/EU(2013/01/01 이후 발효)는 광견병 백신의 품질 관리및 광견병 연구11에관련된 백신 제조업체 및 실험실에 대한 제약을 강화했습니다. 그 결과, 시험관 내 대체 접근법의 개발, 검증 및 사용이 이제 우선 순위가 되었습니다. 이들은 윤리적으로 건전할 뿐만 아니라 배치 테스트 비용을 줄이고 결과 에 대한 시간을3주가아닌 시간으로 단축할 수 있습니다.
RABV 입자의 표면에서 당단백질은 트리메라 형태12,,13,,14,,15,,16을채택합니다. 광견병 백신에서, 이러한 네이티브 트리메릭 형태는VNAbs(17)를 유도하는 주요 면역원을 구성하는 반면, 단용성, 용해성 또는 변성당단백질은 면역원성이 불량한18,,19이다. 따라서, 백신 생산 공정에 따른 당단백질의 트리머의 보존은 최적의 면역원성 전위보존을 위한 좋은 지표이다. 항체 결합 시험20,,21,단일 방사형 면역이디퓨전(SRD) 시험22 및 ELISA 시험23,,24,,25,,26,,27과 같은 몇몇 면역화학적 방법은 광견병 백신의 항원 함량을 정량화하기 위해 WHO 기술 보고서 시리즈2 및 유럽 논문3에 의해 권장된다. 이들은 NIH 시험이 아직도 힘에 대하여 고려되더라도, 인간 백신28의, 배치의 일관된 배합을 평가하기 위하여 백신 생산의 일관성을 감시하기 위하여 제조자에 의해 이용됩니다.
그러나, 이러한 모든 면역 화학 적 방법은 동일하지 않습니다. 상기 SRD 시험은 막 고정 된 트리머를 변경하고 당단백질22,,29의용해성 또는 변성 형태를 초래할 수있는 전처리를 필요로한다. 따라서, SRD는 면역 원성 및 비 면역 원성 당단백질 사이의 차별에 많은 효율적이지 못하여 백신 부지의 면역 원내성에 대한 불완전한 평가를 초래한다. 대조적으로, ELISA 시험은22더 민감하고, 당단백질의 기본 구조를 보존하고, 당단백질의 기본적으로 접힌 삼량분의 함량을 결정하는 것이 더 적절하다. ELISA 시험은 토끼 폴리클로날 또는 마우스 단일클론 항당단백질 항체를 정제하거나 황산암모늄으로 농축하여 사용할 수 있다. 연구는 백신에서 ELISA에 의해 평가된 NIH 시험과 항원 함량 사이 좋은 일치를 보여주었고 ELISA 방법은 시험관 내 힘 시험에 적합하다는 결론을 내렸습니다. 이것은 ELISA 시험이 적어도 보충하거나 NIH 시험4,26,27,,,30,,31,,32,,33을대체할 지도 모른다는 것을 옹호합니다., 오늘, 유럽 약리학은 NIH 시험3에대한 대안으로 검증 된 혈청학 또는 면역 화학 분석법의 사용을 권장합니다. 백신 효능에 대한 동물 사용의 완전한 회피는 현실적인 관점이되었다.
하기 제시된 방법은 삼각약 RABV 당단백질15,,34의항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 마우스 단일클론 항체 클론(mAb-D1)을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포착에 기초한다. 이 방법은 처음에 개발되었다 연구소 파스퇴르26,30 다음 최적화 및 기관 국립 에 의해 검증 세큐리테 뒤 메디카멘트 et des produits 드 산테 (ANSM) 실험실, 즉, 프랑스 OMCL4,33. mAb-D1은 플레이트를 과민화하고 이어서 포획된 항원을 검출하기 위해 모두 사용된다. 이는 당단백질 트리머, 즉 면역원성 RABV 항원의 특이적 정량화를 허용한다. 검출에 사용되는 mAb-D1은 기질 및 크로모겐의 존재 에서 밝혀지는 과산화아제로 표지된다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다. RABV당단백질(35)의상이한 항원 부위를 인식하는 상이한 mAbs에 동일한 유형의 분석이 적용될 수 있다는 점에 유의한다. 상기 방법은 황산암모늄을 황산염 항당단백질 폴리클로날 토끼 G(IgG) 또는 모노클로날 마우스 글로불린으로 획득 및 정제 또는 농축하는방법(37)과 함께 이전에 광범위하게 기술되어 왔다37..

<table><tbody><tr><td>클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10445753</td><td>살아있는 바이러스를 적정하는 경우</td></tr><tr><td>투명 평면 바닥 면역 비멸균 96-웰 플레이트, 400 &마이크로; L, MAXISORP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>439454</td><td>장전된 항체에 결합하는 데 좋습니다</td></tr><tr><td>. Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12576606</td><td>for the preparation of sulfuric</td></tr> acid <tr><td>Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96</td><td>Dutscher</td><td>55303</td> good for <td>binding to the loaded antibody</td></tr><tr><td>Microplate Sealing 테이프(100 장)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Microplate&nbsp; 단일 모드 리더 Sunrise</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate 쉐이커-인큐베이터</td><td>Dutscher</td><td>441504</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 세척기 Wellwash</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5165000</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 (30-300 &마이크로; L) 12</td>채널 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>싱글채널 피펫 (키트 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &mu; L 마이크로, 2-20 &mu; L, 20-200 &mu; L & 100-1000 &뮤; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4700880</td><td></td></tr></tbody></table>

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 elisa 테스트

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

동물 복지에 대한 전 세계적으로 증가하는 관심사는 제조업체와 국립 통제 연구소(OMCL)가 실험실 동물 실험의 교체, 감소 및 개선을 위한 3R 전략을 따르도록 장려하고 있습니다. 시험관 내 접근법의 개발은 광견병 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트의 대안으로 WHO 및 유럽 수준에서 권장됩니다. 광견병 바이러스 (RABV) 입자의 표면에서, 당단백질의 트리머는 바이러스 중화 항체 (VNAbs)를 유도하는 주요 면역 원을 구성한다. 중화 단일 클론 항체 (mAb-D1)는 당단백질의 트리메라 형태를 인식하는 ELISA 테스트는 백신 배치의 생산과 함께 네이티브 접힌 트리메릭 당단백질의 함량을 결정하기 위해 개발되었습니다. 이 시험관 내 효능 시험은 NIH 테스트와 양호한 일치를 입증했으며 RABV 백신 제조업체 및 OMcLs의 공동 시험에서 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 동물 사용의 회피는 가까운 장래에 달성 가능한 목표입니다.
제시된 방법은 트리메릭 RABV 당단백질, 즉 면역원성 RABV 항원의 항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 mAb-D1을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포지에 기초한다. mAb-D1은 백신 배치에 존재하는 당단백질 트리머의 코팅 및 검출 모두에 사용됩니다. 에피토프는 그것의 형태 특성 때문에 인식되기 때문에, 잠재적으로 변성된 당단백질 (더 적은 면역원성)은 mAb-D1에 의해 포착되고 검출될 수 없습니다. 시험되는 백신은 mAb-D1로 민감화된 플레이트에서 배양된다. 바운드 트리메릭 RABV 당단백질은 mAb-D1을 다시 첨가하여 확인되고, 과산화아제로 표지된 다음 기질 및 크로모겐의 존재에서 밝혀낸다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다.

다음 예에서 정제된 불활성화 광견병 바이러스 입자(PV 백신 균주)로 구성된 참조 백신 Lot 09가 사용된다. 이에 대한 당단백질 트리머(10 μg/mL) 함량은 총 바이러스 성 단백질(BCA 시험)의 측정 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 당단백질의 백분율의 평가 후에 확립되었다. 대안적으로, 교정된 기준 백신, 예를 들어, 광견병 백신에 대한 WHO6th 국제 표준(IS)(NIBSC 코드: 07/162)을 사용할 수 있다.
표 3은 전형적인 실험에 대한 OD 값(492 nm)을 나타낸다. 이러한 값을 사용하여, 기준 백신 곡선은 수직 축(선형 스케일)에 대한 기준 백신의 상이한 희석에서 평균 OD(공백의 평균 OD를 뺀)를 플로팅(1)하여 그려졌다; (2) 수평 축(로그계 척도)에서 당단백질 트리...

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

동물 실험을 줄이는 것을 목표로 하고 NH 시험의 가변성 때문에 WHO는 광견병 백신 효능을 평가하기 위한 체외 접근법을 개발하도록 장려합니다. 본 ELISA 시험은 당단백질의 면역원성 형태를 인식하는 고전적인 NH 시험과 양호한 일치를 나타내며, 고감도를 나타내며, 하루 만에 수행될 수 있다. ELISA에 의한 시험관 내 광견병 백신 효능의 평가는 생체 내 NH 시험의 대안이다.그것은 제조 업체및 국가 통제 실험실에 의해 추진된다. 이 절차를 시작하기 위해 세정 후 흡수성 용지에 사전 크기의 볼륨을 복제하고 소용 용지에 접시를 잘 말리는 것이 중요합니다. 오염된 물질을 2.6%의 하이포염 나트륨용액에 30분 동안 담근 후 오염된 물질을 치료하여 오염물질을 제거합니다.다음으로, 96웰의 면역분석판을 설정하고 탄산염 완충제에서 희석된 단클론 항체의 200마이크로리터를 각각 양호하게 첨가한다. 접착제 필름으로 접시를 덮고 가습 환경에서 3 시간 동안 섭씨 37도에서 마이크로 플레이트를 배양하십시오. 그런 다음 신중하게 흡인하고 2.6 %의 염화 나트륨의 용액을 포함하는 수령인으로 우물 함량을 전송합니다.마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지에 5 분 동안 건조시키십시오. 먼저 각 웰에 300마이크로리터의 통과 버퍼를 추가합니다. 접착제 필름으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하십시오.그 후, 2.6%의 하이포염소산나트륨용액을 함유한 웰의 내용물들을 하나로 옮기는다. 접시를 씻으려면 각 우물에 300 마이크로리터를 첨가하십시오. 그런 다음 신중하게 흡인하고 2.6 %의 하이포클로리트 나트륨의 용액을 포함하는 수령인으로 우물 함량을 전송합니다.이 세탁 과정을 5회 더 반복하여 감광판으로 광범위하게 씻어주세요. 그 후 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지 조각을 1분 동안 건조시키십시오. 광견병 바이러스 당단백질의 최종 농도가 밀리리터 당 10 마이크로그램인 증류수 의 1 밀리리터에서 기준 백신을 재구성한다.희석제에서 재구성된 기준 백신의 10배 희석을 준비하여 밀리리터당 1마이크로그램의 광견병 바이러스 당단백질 농도에 도달한다. 다음으로, 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 희석제에서 이 기준 백신의 6개의 직렬 2배 희석제를 수행한다. 중복 우물에 희석제 200마이크로리터를 분배하여 각 기준 백신 희석에 대해 시각 장애인 대조군과 200마이크로리터를 복제하여 사용할 수 있습니다.그런 다음 희석제에서 테스트된 백신의 10배 희석을 준비하고 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 희석제에서 테스트된 백신의 7배 연속 희석제를 준비한다. 마이크로 플레이트의 각 웰에 복제하여 각 테스트 된 백신 희석의 200 마이크로 리터를 배포합니다. 접착제 필름으로 마이크로 플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오.이 후 필름을 제거합니다. 신중하게 흡인하고 2.7 %의 나트륨 hypochlorite 용액을 포함하는 수령인으로 각 우물의 내용을 전송합니다. 접시를 세척하려면 각 웰에 300 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 각 웰의 내용을 조심스럽게 흡인하고 2.6 %의 hypochlorite 나트륨 용액을 포함하는 수령인으로 옮겨 넣습니다.언바운드 항원을 제거하고 코팅된 항체에 결합된 G-단백질 트리머를 보존하기 위해 세척 과정을 5회 더 반복한다. 세척된 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지 한 조각에서 1분 동안 건조시키십시오. 그런 다음 각 웰에 희석제에 D1 단클론 항체를 표시과 산화의 권장 희석의 200 마이크로 리터를 배포.접착제 필름으로 마이크로 플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 필름을 제거하고, 신중하게 흡인하고, 2.6%의 하이포염소산나트륨 용액을 함유한 수령인으로 각 우물의 내용을 전송한다. 마이크로 플레이트를 세척하려면 각 웰에 300 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다.신중하게 흡인하고 2.6 %의 나트륨 hypochlorite 용액을 포함하는 수령인으로 각 우물의 내용을 전송합니다. 이 세척 과정을 5회 더 반복하여 불바운드 peroxidase 라벨이 부착된 항체를 제거합니다. 세척된 마이크로 플레이트를 반전시키고 실온에서 흡수성 용지 한 조각에서 1분 동안 건조시키십시오.다음으로, 각 우물에 기질 염색체 용액 200 마이크로리터를 분배합니다. 마이크로 플레이트를 필름으로 밀봉하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 50 마이크로리터의 정지 용액을 각 우물에 추가하여 반응을 중지합니다.마이크로 플레이트의 바닥을 조심스럽게 닦고 분광측에 놓습니다. 사용되는 모든 웰에 대해 492 나노미터의 광학 밀도를 결정합니다. 분석을 위해 스프레드시트 파일에서 이 데이터를 수집합니다.이 후 텍스트 프로토콜에 설명된 참조 백신 곡선과 광학 밀도 값 모두에 대한 플롯을 만듭니다. 이 연구에서는, 시험관 내 ELISA 시험은 광견병 백신 효능을 평가하기 위하여 이용됩니다. 일반적인 실험에서 대표적인 광학 밀도 값이 여기에 표시됩니다.이러한 값은 수직 축상상에 있는 기준 백신의 상이한 희석을 위한 평균 광학 밀도및 수평 축상에 있는 당단백질의 농도를 플로팅하여 기준 백신 곡선을 그리는 데 사용된다. 시험된 백신의 당단백질 함량은 이 곡선을 사용하여 추정됩니다. 이 평가는 기준 백신 곡선의 라이너 영역에서 평균 광학 밀도 값을 갖는 희석에 대해 정확합니다.1대 40의 희석을 고려하여 x축에서 OD 1534의 수직 투영은 밀리리터당 500 나노그램에 해당합니다. 따라서 테스트된 백신은 당단백질의 밀리리터 당 20 마이크로그램으로 추정됩니다. 시험관 내 효능이 확립되면, 시험된 백신을 국제 단위로 보정된 WHO 국제 표준 6개 기준과 비교할 필요가 있다.동일한 방법은 고전적으로 더 가변적인 수의학 백신에 사용된 것을 포함하여 더 많은 백신 균주의 검출을 확대하기 위하여 그밖 항체와 함께 이용될 수 있습니다. 항체는 또한 말 또는 인간 혈청에 있는 항체 항체의 적정을 위한 경쟁에서 이용될 수 있습니다. 예방 조치는 비활성화되지 않았거나 바이러스가 없는 백신으로 취해야 합니다.개인 보호 장비를 사용하고 장갑을 착용하고 모든 것을 적절하게 오염 제거하십시오. 또한 발암성 및 산성 나트륨 저염용정제에 주의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 감염된 쥐의 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색을 보여줍니다. 이 과정에는 탈파라핀화(deparaffinization) 및 알코올 처리(alcohol treatment)가 포함되며, 항원 접근성을 높이기 위한 단백질 분해 처리(proteolytic treatment)가 이어집니다. 면역조직화학 염색을 통해 붉은 침전물이 나타나 조직 단면에 광견병 항원이 존재함을 확인합니다.

광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

이 동영상은 백신의 면역원성 당단백질 수치를 평가하기 위해 고안된 간접 효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 샌드위치 면역포획 분석을 보여줍니다. 당단백질 특이적 항체를 포함하는 분석 플레이트는 참조 및 테스트 백신을 포함하여 연속적으로 희석된 백신 샘플과 함께 배양된 후 면역 분석을 통해 테스트 백신의 당단백질 함량을 정량화합니다.

샌드위치 ELISA를 사용하여 백신의 면역원성 당단백질 함량 측정

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

직접 급속 면역 조직 화학 검사 (DRIT)는 광견병 진단을위한 직접 형광 항체 (DFA) 테스트에 대한 인식 대안 동물 보건 및 세계 보건 기구 (OIE / WHO)에 대한 세계 기구를 제공합니다. 이 시험은 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 두뇌 노출에 따라 대략 1 시간에서 수행 될 수있는 필드 기반 응용 프로그램을 허용합니다.

직접 신속한 면역 기능 화학 검사를 사용하여 향상된 광견병 감시

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

이 프로토콜은 체외 전사를 사용하여 다양한 소 뇌 해부학 구조 내에서 광견병 바이러스 뉴클레오프로틴(N) 유전자 복사 수를 결정하기 위한 qRT-PCR 기반 접근법을 제시한다.

다양한 소 뇌 구조에서 광견병 바이러스의 양

이 방법은 광견병 항원을 미리 결정된 지연 후에 박동성 방출을 가능하게 하는 구조적 및 물질적 특성을 가진 생분해성 고분자 미세입자로 캡슐화하는 것을 설명합니다. 입자 코어에서 회수된 항원의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 평가는 입자 제조를 통해 손상되지 않은 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 존재를 확인합니다.

광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조

이 원고의 목적은 광견병 특이적 IgG 및 IgM 항체 검출을 위한 광견병 간접 형광 항체 검사의 사용을 조사하는 것입니다.

광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출

이 프로토콜은 조직 채취에서 결과 해석에 이르기까지 pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 보여주며, 여기에는 일부 비광견병 lyssavirus 및 lagomorphs에 대한 분석 성능을 개선하기 위한 프라이머 염기서열 및 제형 업데이트가 포함됩니다. 또한 단일 웰 LN34 다중화(LN34M) 형식에 대한 분석 설정을 시연합니다.

업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

배우세요 광견병 백신 효능을 평가하는 간접 ELISA 샌드위치 면역포착법을 사용하는 방법을. 중화 단클론항체(mAb-D1)를 활용하여 당단백질 삼량체를 인식하고, 동물실험을 대체하는 신뢰할 수 있는 시험관 내 대안을 제공합니다.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

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