Name: Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster를 활용한 질병 관련 인간 미스센스 변이체의 생체 내 기능 분석 방법입니다. 이 기술은 희귀 질환 진단과 치료제 개발 연구에 필수적인 단백질 기능 영향을 신속하게 평가합니다.

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호세 살라자르, 줄리아 왕, 카렌 슐제 박사에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 우리는 여기에 논의 된 TBX2 변종의 기능적 특성에 대해 닝 리우 박사와 Xi Luo 박사를 인정합니다. 진단되지 않은 질병 네트워크 모형 유기체 검열 센터는 건강의 국가 학회 (NIH) 공동 기금 (U54 NS093793)를 통해 지원되었습니다. H. T. C. NIH [CNCDP-K12 및 NINDS (1K12 NS098482)], 미국 신경학 아카데미 (신경 과학 연구 보조금), 버로우스 웰컴 기금 (의료 과학자를위한 경력 상), 아동 신경학회 및 아동 신경학 재단 ( PERF 엘터만 교부금), NIH 이사 조기 독립상 (DP5 OD026426). M. F. W. 사이먼스 재단 (SFARI 상: 368479)에 의해 추가 지원되었다. S. Y.는 NIH (R01 DC014932), 사이먼스 재단 (SFARI 상 : 368479), 알츠하이머 협회 (새로운 조사자 연구 보조금 : 15-364099), 기초 연구를위한 나만 가족 기금 및 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 추가지원되었습니다. 분자 의학. BCM의 공초점 현미경 검사법은 NIH Grant U54HD083092에 의해 부분적으로 지적 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 신경 시각화 코어에 의해 지원됩니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

Drosophila melanogaster를 이용한 실험 적인 연구 결과는 질병 관련 인간 이체의 결과를 평가하기 위하여 강력한 분석 시스템을 제공합니다. 이것은 지난 세기89년 동안 비행 필드에 있는 많은 연구원에 의해 생성된 지식 그리고 다양한 유전 공구의 큰 바디 때문이. 그러나 다른 실험 시스템과 마찬가지로 존재하는 주의 사항과 한계를 인정하는 것이 중요합니다.
데이터 마이닝과 관련된 주의 사항 이 프로토콜의 첫 번째 단계는 관심 있는 유전자와 관련된 정보를 위해 데이터베이스를 채굴하는 것이지만 시작점으로만 사용하는 것이 중요합니다. 예를 들어 변형 함수의 silico 예측에서 중요한 통찰력을 제공하지만 이러한 데이터는 항상 신중하게 해석되어야 합니다. 모든 주요 알고리즘이 인간 변이체가 양성이라고 예측하는 몇 가지 경우가 있지만, Drosophila에서의 기능적...

희귀 질환 환자는 종종 정확한 진단을 얻기 위해 "진단 오디세이"라고불리는 힘든 여행을 겪습니다 1. 대부분의 희귀 한 질병은 유전 / 게놈 분석 임상 작업의 중요한 요소를 만드는 강한 유전 적 기원을 가지고 생각된다. 염색체 마이크로어레이에 기초한 후보 유전자 패널 염기서열 분석 및 카피 수 변이 분석 이외에, 전체 엑소메(WES) 및 전체 게놈 염기서열 분석(WGS) 기술은 지난 10년 동안 점점 더 가치 있는 도구가 되고 있다2, 3. 현재 WES 및 WGS에서 알려진 병원성 변이체를 확인하기 위한 진단율은 ~25%(소아의 경우 더 높는)4,5. 임상 WES/WGS 후에 진단되지 않는 남아 있는 대부분의 케이스를 위해, 일반적인 문제는 많은 후보 유전자 및 이체가 있다는 것입니다. 차세대 염기서열 분석은 종종 많은 유전자에서 신규또는 매우 드문 변이체를 식별하고, 이러한 변이체가 질병 표현형에 기여하는지 여부를 해석하는 것은 도전적입니다. 예를 들면, 유전자에 있는 대부분의 말도 안되는 또는 프레임 시프트 돌연변이는 인코딩된 전사체의 말도 안되는 중재된 부패 때문에 기능 상실 (LOF) eeles로 생각되더라도, 마지막 exons에서 찾아낸 돌연변이를 잘린 이 프로세스를 탈출하고 같이 기능할 수 있습니다 양성 또는 기능 의 이득 (GOF) 알레일6.
또한, 1930 년대에 허먼 뮬러에 의해 처음 설명 된 바와 같이 다른 유전 시나리오의 숫자 (즉, 변형, 가형, 과모프, 안티 모프, 네오모프, 또는 이소모프) 7 을 초래할 수 있기 때문에, 잘못된 알탐지 알레일의 효과를 예측하는 것은 어려운 작업입니다7 . 수많은 실리코 프로그램 및 방법론은 진화적 보존, 아미노산 변화의 유형, 기능적 영역 내위치, 일반 인구의 대문자 빈도에 기초하여 잘못된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 개발되었으며, 및 기타 매개 변수8. 그러나 이러한 프로그램은 변형 해석의 복잡한 문제를 해결하기위한 포괄적 인 솔루션이 아닙니다. 흥미롭게도, 최근 연구는 5 개의 광범위하게 사용되는 변이체 병원성 예측알고리즘 (폴리펜 9, SIFT10,CADD11,PROVEAN12,돌연변이 테이스터)이 병원성 ~80 %에 동의한다는 것을 보여주었습니다8 . 특히, 모든 알고리즘이 동의하더라도, 그들은 시간의 11 %까지 병원성의 잘못된 예측을 반환합니다. 이것은 뿐만 아니라 결함이 있는 임상 해석으로 이끌어 냅니다 그러나 또한 양성으로 그(것)들을 거짓으로 나열하여 새로운 변이체에 후속에서 연구원을 단념할 수 있습니다. 실리코 모델링에서 현재의 한계를 보완하는 한 가지 방법은 시험관 내, 생체 외(예를 들어, 배양된 세포, 오르가노이드) 또는 생체내 변이체 기능의 효과를 입증하는 실험 데이터를 제공하는 것이다.
MO에 있는 희소한 질병 관련이체의 생체 내 기능적인 연구 결과는 13의 유일한 강점이 있고 미국에 있는 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 희소한을 포함하여 세계에 있는 많은 희소한 질병 연구 이니셔티브에 의해 채택되었습니다 캐나다, 일본, 유럽 및 호주의 질병 모델 및 메커니즘 (RDMM) 네트워크14. MO 연구자를 희귀 질환 진단 및 기계론 적 연구의 워크플로우에 통합하기 위한 이러한 협력적 노력 외에도 임상 및 MO 연구자 간의 다수의 개별 공동 연구결과가 발견으로 이어졌습니다. 및 많은 새로운 인간 질병을 일으키는 유전자및 변이체82,83,84의특성화.
UDN에서, 중앙 집중식 모형 유기체 검열 센터 (MOSC)는 환자의 상태에 대한 설명과 함께 후보 유전자 및 변이체의 제출을 수신하고 이체가 정보학 도구 및 생체 내에서 병원성일 가능성이 있는지 여부를 평가합니다. 실험. UDN의 단계 I (2015-2018)에서, MOSC는 Drosophila 코어 [의학의 베일러 대학 (BCM)] 및 얼룩말 물고기 코어 (오리건 대학)로 구성 사례를 평가하기 위해 협력했다. 정보학 분석 및 Drosophila와 zebrafish에 있는 다른 실험 전략의 수를 사용하여, MOSC는 지금까지 132명의 환자의 진단, 31의 새로운 증후군55의확인, 몇몇 새로운 인간발견의 진단에 기여했습니다 질병 유전자 (예를 들어, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720)및 알려진 질병의 현상치 확장 유전자 (예: CACNA1A21,ACOX122).
UDN 내의 프로젝트 이외에, MOSC Drosophila 코어 연구원은 Mendelian 유전체학 및 그밖 이니셔티브를 위한 센터와 협력하여 새로운 질병 유전자 발견에 기여했습니다 (예를 들면, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29)동일한 정보학 및 유전 적 세트를 사용 UDN을 위해 개발된 전략. 희귀 질환 진단에 대한 MO 연구의 중요성을 감안할 때, MOSC는 UDN의 단계 II (2018-2022)에 대한 C. 예쁜 꼬마 코어와 두 번째 얼룩말 코어 (세인트 루이스의 워싱턴 대학 모두)를 포함하도록 확장되었습니다.
이 원고는 UDN MOSC Drosophila Core에서 활발히 사용되는 생체 내 기능적 연구 프로토콜을 설명하여 잘못된 변형이 인간을 발현하는 형질전환 파리를 사용하여 관심 단백질에 기능적 영향을 미치는지 여부를 결정합니다. 단백질. 이 프로토콜의 목표는 MO 연구원이 임상 연구 그룹과 협력하여 관심 유전자의 후보 변형이 기능적 결과를 가지고 있다는 실험적 증거를 제공하도록 돕고 임상 진단을 용이하게하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 연구원이 관심있는 유전자에 있는 특정 후보 이체를 가진 희소한 질병 환자가 있는 임상 조사체에 의해 접근하는 시나리오에서 가장 유용합니다.
이 프로토콜은 세 가지 요소로 나눌 수 있습니다: (1) 환자 표현형및 Drosophila에서기능적 연구의 타당성에 대한 책임이 있는 관심의 변이체의 가능성을 평가하기 위해 정보를 수집, (2) 수집 기존 유전 도구 및 새로운 도구를 확립하고, (3) 생체 내에서 기능 적 연구를 수행. 세 번째 요소는 관심 있는 변형의 기능을 평가하는 방법(구조 실험 또는 과발현 기반 전략)에 따라 두 개의 하위 요소로 더 세분화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 희귀 한 단일 원성 질환 연구 (예 : 일반적인 질병, 유전자 환경 상호 작용 및 약리학 / 유전 스크린)를 제외한 많은 시나리오에 적응하고 최적화 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 변이체의 기능과 병원성을 결정하는 능력은 정확한 분자 진단을 제공함으로써 관심있는 환자에게 유익할뿐만 아니라 번역 및 기본 과학 연구 모두에 더 광범위한 영향을 미칠 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Drosophila UAS-human cDNA transgenesis</td><td></td><td></td><td></td>Injection strains for</tr> <tr><td>transgenesis (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>특이적 시약: VK33 (3번째 염색체)</td></tr><tr><td>형질전환 (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>특정 시약: VK37 (2번째 염색체) 주입 라인</td></tr><tr><td>Plasmid DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloning vector</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>특정 시약: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila 형질전환 벡터</td><td>Johannes Bischof 박사와 Konrad Basler 박사의 선물(Bischof et al., 2013 PNAS)</td><td></td><td>특정 시약: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>분자 생물학 키트 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>특정 시약: Agarose(분자 생물학 등급)</td></tr><tr><td>화학적 유능 세포(E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>특정 시약: DH5&alpha;</td></tr><tr><td>DNA 겔 추출 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>특이적 시약: PureLink 겔 추출 키트</td></tr><tr><td>DNA 분리 및 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>특이적 시약: QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>High Fidelity Polymereach</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>특이적 시약: Q5 중합효소 키트</td></tr><tr><td>재조합효소 매개 클로닝 시스템</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>특이 시약: Gateway BP Clonase kit</td></tr><tr><td>Recombinase mediated cloning system</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit</td></tr><tr><td>Site Directed Mutagenesis kit</td><td>Agilent</td><td>#200523</td><td>Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit</td></tr><tr><td>Electroretinogram Rig related equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analysis</td><td>분자 장치</td><td>N/A</td><td>특정 시약: Axon pCLAMP 10 데이터 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>ERG 데이터 수집</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>특정 시약: ISO-DAM 절연 생물학적 증폭기</td></tr><tr><td>ERG 자극기</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>특정 시약: 사각 펄스 자극기</td></tr></tbody></table>

drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

시퀀싱 기술의 발전으로 전체 게놈 및 전체 엑솜 데이터 세트는 임상 진단 및 최첨단 인간 유전학 연구 모두에 더 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 이러한 데이터 세트에서 확인된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 여러 가지 실리코 알고리즘이 개발되었지만, 기능적 연구는 특정 게놈 변이체가 단백질 기능에 미치는 영향을 결정하는 데 매우 중요합니다. 변종. 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 기타 희귀 질환 연구 컨소시엄에서, Drosophila, C. elegans,제브라피시 및 마우스를 포함하는 모형 유기체 (MO)는 가치 인간 질병의 기능을 평가하기 위하여 적극적으로 이용됩니다 변종. 이 프로토콜은 UDN의 모델 유기체 스크리닝 센터 초파리 코어에 사용되는 희귀 인간 변이체의 기능적 평가를 위한 방법을 기술한다. 워크플로는 여러 공용 데이터베이스에서 인간 및 MO 정보를 수집하는 것으로 시작하여 MARRVEL 웹 리소스를 사용하여 변형이 환자의 상태에 기여할 가능성이 있는지 여부와 사용 가능한 실험을 기반으로 효과적인 실험을 설계하는 것으로 시작됩니다. 지식과 자원을 활용합니다. 다음으로, 유전 적 도구 (예를 들어, T2A-GAL4 및 UAS-인간 cDNA 라인)는 초파리에서관심있는 변이체의 기능을 평가하기 위해 생성됩니다. 이러한 시약의 개발시, 구조 및 과발현 실험에 기초한 두 갈래 의 기능성 실험이 변형 기능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 구조 분지에서, 내인성 비행 유전자는 참조 또는 변이체 인간 형질전환유전자로 정형고성 Drosophila 유전자를 대체해서 "인간화"됩니다. 과발현 분지에서, 참조 및 변이체 인간 단백질은 다양한 조직에서 외인성으로 구동된다. 두 경우 모두, 임의의 코랭킹 표현형(예를 들어, 치사성, 눈 형태학, 전기생리학)은 관심 있는 질병에 관계없이 판독값으로 사용될 수 있다. 기준과 변이체 둘레 사이에 관찰된 차이는 변이체 특이적 효과, 따라서 가능성이 있는 병원성을 시사한다. 이 프로토콜은 알려진 및 알려지지 않은 기능을 가진 유전자의 가증한 인간 질병 유발 변이체의 신속하고 생체 내 평가를 허용합니다.

신경 발달 표현형에 연결된 EBF3에 있는 de novo 오해의 소지가 있는 변이체의 기능적인 연구 근력 저하, 운동 실조, 글로벌 발달 지연 및 표현 성 언어 장애를 포함한 신경 발달 표현형을 가진 7 세 남성에서, 의사와 건강 미진단 질병 프로젝트의 국립 연구소에서 의사와 인간 유전학자 (UDP) EBF3(초기 B-세포 인자3)에서 de novo missense 변이체(p.R163Q)를 확인하되, COE(콜리어/후각-1/초기 B 세포 인자) 가족 전사 인자를 암호화하는 유전자. 이 사례는 기능 연구를 위해 2016년 3월에 UDN MOSC에 제출되었습니다. 이 유전자가 이 케이스를 위한 좋은 후보인지 평가하기 위하여는, MOSC는 OMIM, ClinVar, ExAC (지금 그놈AD로 확장), 제노2MP, DGV 및 해독에서 인간 유전 및 게놈 정보를 수집했습니다. 또한, 주요 MO...

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

이 프로토콜은 우리가 질병에 연결되는 인간 적인 유전자에 있는 잘못된 감각 이체가 단백질 기능에 영향을 미치는지 결정하는 것을 허용합니다. 이는 최첨단 알고리즘에서도 계산적으로 수행하기가 어렵습니다. 이 기술은 척추 동물 모델 유기체보다 빠르고 비용 효율적인 생체 내 시스템 Drosophila 멜라노가스터를 사용하여 인간의 단백질에 있는 잘못된 감각 이체의 신속한 분석을 허용합니다.특정 이체가 단백질 기능에 직접적인 영향을 미친다는 것을 입증하는 것은 희소한 질병의 진단에 직접적으로 기여하고 질병 기계장치 분석 및 잠재적인 치료를 위한 출발점역할을 합니다. 이 프로토콜은 희귀 질환에 연결된 이체를 연구 할 때 특히 유용하지만 자폐증과 암과 같은 일반적인 질병에 적용 될 수 있습니다. 단백질 기능을 반영하는 파리에서 재현 가능한 표현형을 식별하는 것은 어려울 수 있습니다.표현형은 유전자에서 유전자에 다를 수 있고 미묘할 수 있습니다. Drosophila를 사용하여 인간 적인 단백질에 있는 변이체의 기능적인 연구 결과는 구조 실험 또는 과발현 연구 결과에 근거를 두어 수행될 수 있습니다. 절차를 시작하기 전에, 관심의 인간의 유전자와 모델 유기체 정형 외과에 대한 정보를 수집합니다.플라이 비주얼 시스템에서 참조 및 변이체 인간 단백질을 과발현하여 변형 기능을 테스트하려면, Gal4 업스트림 활성화 서열 또는 UAS 시스템의 제어하에 관심있는 참조 또는 변형 인간 cDNA를 표현하는 형질 전환 파리를 생성합니다. 특정 플라이 조직에서 인간 단백질을 발현하기 위해 특정 Gal4 라인을 선택하려면, 단일 바이알 또는 중복에 있는 UAS 인간 cDNA 형질대사각각에서 3~5명의 수컷과 함께 Gal4 라인에서 3~5명의 처녀 암컷을 교차한다. 가능한 한 하나의 십자가에서 동봉된 많은 동물을 얻기 위해 2~3일마다 십자가를 옮기고 해부 현미경하에서 동봉된 동물을 검사하여 기준과 변이체 균주 사이의 차이점을 식별합니다.눈에 보이는 결함이 있는 경우 플라이를 이미지하여 표현형을 문서화합니다. 시각 시스템에서 기능적 결함에 대한 테스트를 위해 파리를 생성하기 위해, rhodopsin 1 Gal4 라인에서 참조 또는 변이체 UAS 인간 cDNA 트랜스게컨을 가진 남성에게 처녀 암컷을 교차하여 플라이 망막에서 광수용체 R1내지 R6에 대한 관심있는 인간의 단백질을 표현한다. 파리가 닫히기 시작하면 자손을 신선한 바이알로 모으고 바이알을 적절한 실험 온도로 설정된 인큐베이터로 돌려 보내 시각적 시스템이 성숙할 수 있도록 3일 더 허용합니다.인큐베이션의 끝에서, 적절한 마취 방법으로 파리를 고정하고 유리 현미경 슬라이드에 각 비행의 한쪽을 부드럽게 접착제. 전세전 도전자를 설치한 후 1.2mm 유리 모세관을 바늘 풀러에 넣고 모세관 튜브를 부러뜨려 직경 0.5mm 미만의 날카로운 중공 테이퍼 전극 2개를 얻습니다. 기포를 피하고 유리 모세혈관을 실버 와이어 전극 위로 밀어 내도록 주의하는 100 밀리머 식염수 용액으로 모세혈관을 채웁니다.모세혈관을 제자리에 고정시키고 파리를 실내 온도에서 최소 10분 동안 어둠을 완성하도록 적응시다. 습관의 끝에, 파리를 포함하는 슬라이드를 기록 장치에 놓고 참조를 운반하는 마이크로 조작기를 이동시키고 전극을 관심있는 비행에 가깝게 기록한다. 전극의 끝을 보면서, 조심스럽게 표피를 관통하는 플라이의 흉부에 기준 전극을 배치하고 눈표면에 기록 전극을 배치합니다.성공적인 전세전도 기록의 경우, 눈의 관통 없이 작은 보조개를 유발하도록 기록 전극에 적절한 양의 압력을 가하여 주의하십시오. 전극이 배치되면 1차 라이트를 3분간 끄면 파리를 어두운 환경으로 다시 적응시합니다. 재적응 기간이 끝나면 동일한 전극을 사용하여 조건당 미끄럼항당 최소 15파리의 전세전사진을 20초 동안 1초 동안 1초 동안 셔터를 열고 닫습니다.참조 및 변형 파리의 레코딩이 완료되면 참조, 변형 및 컨트롤의 전하 기록과 비교하여 차이점을 평가합니다. 그런 다음 과도, 탈극화, 과도 및 다시 양극화에 대한 변화에 대한 전기 전세음원 데이터를 평가합니다. 이 대표적인 실험에서는, 인간 참조 TBX2가 구조 기지를 둔 전략을 불가능하게 만드는 직교 플라이 유전자를 기능적으로 대체할 수 없었기 때문에 TBX2를 위한 과발현 기지를 둔 연구가 수행되었다.인간 TBX2를 참조하면 눈없는 Gal4를 사용하여 발달 하는 눈과 뇌의 부분에서 과발현, 과발현은 약 85%의 치사율과 눈 크기의 현저한 감소를 초래합니다. 대조적으로, 변이체 변형은 치사성을 일으키는 데 덜 강력하며 동일한 실험 조건하에서 동일한 드라이버를 사용하여 작은 눈 표현형을 유도하여 변이체가 단백질 기능에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 또한, 기준 인간 TBX2가 rhodopsin Gal4를 사용하여 광수용체에서 과발현되면, 과발현은 전하계선 흔적에 상당한 변경을 일으킨다.이러한 표현형은 변이체 단백질이 발현될 때 더 온화하며, 관심의 변이체가 생체내 단백질 기능에 영향을 미친다는 추가 증거를 제공한다. 모든 유전자가 고유하므로 모든 질병 관련 이체의 영향을 평가할 수 있는 단일 실험이 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 인간 cDNA와 함께 작업하는 것 외에도, 이체가 정형소 비행 유전자의 진화적으로 보존된 잔류물로 유사 변이체를 도입하여 기능적 결과를 가지고 있는지 도를 결정할 수 있다.이 방법을 사용하여, 우리는 진단되지 않은 질병 네트워크 및 그밖 단과 공동으로 인간적인 질병 유전자 발견 연구 결과의 숫자에 기여했습니다.

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