Name: 돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 학습하세요 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 멜라닌 세포 줄기 세포의 공간적 및 시간적 활성화를 제어하는 방법으로, 피부 흑색종 발생 초기 단계를 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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이 작업은 W81XWH-16-1-0272에서 피어 검토 된 암 연구 프로그램을 통해 건강 문제에 대 한 국방부 장관 비서에 의해 지원 되었습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 것 이며 반드시 국방부가 승인 하지는 않습니다. 이 작업은 또한 A.C. 흰색에 코넬 줄기 세포 프로그램에서 종자 그랜트에 의해 지원 되었다. H. 달은 척추 동물 유전체학 학자 프로그램에 대 한 코넬 센터에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차는 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행 됩니다.
1. 준비
<ol><li>
12 일간의 산 후 마우스에서 꼬리 클립을 수집 하 고 400 µ L의 0.05에서 NaOH를 95 ° c에서 1 시간 동안 µ를 첨가 하 고 1M(1 M), pH 7의 1m 인 트리 스-HCl을 32 추가 하였다. 유전자 형 마우스는 잭슨 실험실을 통해 제공 된 PCR 프로토콜에 따라, 마우스를 관심의 유전자 형으로 식별 하 고6. -티 르 -크 레 머- 헤이 거 대 한 (+/creer) - LSL-BrafV600E -이종 접합 체 (+/lsl-600e) - Pten- 동형 접합 체 (flox/flox) - LSL-트 토마토 -헤이 큰 (+/l sl-td토마토) 참고: 프라이 머 서 열은 재료의 표로제공 된다.</li>
	<li>머리 깎기 (전동 트리머)를 사용 하 여 아래에 설명 된 모든 실험을 시작 하기 2 ~ 3 일 전에 등 쪽 피부를 면도 하 고, 생쥐가 약 7 주 나 되는 경우. 전기 트리머를 사용 하 여 얇은 마우스 피부가 손상 되지 않도록 주의 하십시오. 모든 부상은 MCSCs를 포함 한 모 낭 줄기 세포를 활성화 하는 상처 치유 반응을 끌어낼 수 있습니다.</li>
	<li>헤어 사이클이 휴지기에 있는지, 그리고 대기 기간 동안 피부가 상처를 입는 지 확인 합니다. 피부에 부상의 징후가 나타나면 마우스를이 절차에 사용 하지 말아야 합니다. 참고: 모발 주기는 유전 배경 사이에서 경미하게 다를 수 있더라도,이 나이에 등 쪽 피부에 있는 머리 주기는 일반적으로 휴지기 상태11에서입니다. 티 르 -creer 이식 유전자는 휴지기 피부에 있는 mcscs를 표적으로 하 고, 연속적인 유전 변경은 분화 된 멜 라 닌 세포 및 멜 라 이드 종양을 포함 하 여 mcscs의 모든 선 지에서 영구히 발현 될 것입니다.</li>
</ol>2. 크리 록스 유전 재조합을 위한 타 목 타 펜 처리
<ol><li>
전신 또는 국 소화 된 유전 재조합을 위한 복 강 내 주입 (IP) 또는 국 소 투여를 위한 타 목 타 펜의 제조 참고: 타 목 시 펜이 재결합을 유도 하기 위해서는, 처음에는 간에 서 4-하이드 록 시 타 펜 타 펜 (4OHT)으로 물질 대사로 변화 시켜야 하며,이는 Creer에 바인딩하고 활성화 될 수 있습니다. 타 목 시 펜의 국 소 적용은이 방법으로 대사 되지 않으며, 4-OHT가 직접 사용 해야 합니다. 충분 한 재결합을 위해서는 타 목 시 펜 전달의 한 가지 방법이 필요 합니다.<ol>
<li>타 목 시 펜: 옥수수 기름에 용 해 된 10 밀리 그램-1 의 농도에서에 스 타 목을 준비 하십시오. 약물의 용액으로의 용 해를 돕기 위해 분말 형태로 약물에 100%의 총 부피의 10%의 분자 등급 에탄올을 추가 하 고 3 분간 소용돌이 한 다음 남은 양의 옥수수 오일을 추가 합니다. 결정 재료가 더 이상 용액에서 명백 해질 때까지 소용돌이를 계속 합니다. 타 목 타 펜 용액은 0.2 µm 필터를 통과 시켜 멸 균 할 수 있다. 치료를 위해 2.2.1 단계를 진행 하십시오.</li>
		<li>4-OHT: 100% 에탄올에서 최대 3mg/ml의 하이드 록 시 타 목의원 액을 제조 한다. 그런 다음, 작업 용액은 관심 있는 피부 영역 (일반적으로 단일 응용 프로그램)을 충당 하기 위해 필요한 만큼 적용 할 수 있습니다. 참고: 하이드 록 시 타 목 시 펜의 원 액을 100% 에탄올에 녹 인 후 최종 농도 5mm로 할 수 있다. 이어서, 작동 용액을 제조 하기 위하여, 4OH-타 목 타 정 원 액의 5 µ L을 100% 에탄올에 15 µ L로 희석 시킬 수 있다. 4mm2 영역에 대해서는 1 ~ 3 µ의 작업 용액을 국 소 적으로 적용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전신 또는 국 소 적으로 타 목 타 펜으로 생쥐 치료
	<ol>
<li>전신 치료를 위해, 26G 바늘을 사용 하 여 3 일 동안 매일 한 번씩 IP 주입을 통해 타 목 타 펜 2 mg을 투여 하십시오. 참고: 이 모델을 사용 하 여 정 동작 MCSCs의 약 93% ± 4%가 tdTomato6으로 표시 됩니다.</li>
		<li>지역 활성화를 위해, 4-OHT와 하나의 국 소 치료를 수행 합니다. 작업 솔루션으로 관심의 피부 영역을 커버. 작업 용액의 양은 단계 2.1.2에서 기술 한 바와 같이 관심 영역의 크기에 의해 결정 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>타 목 시 펜의 마지막 투여 량 다음에 48 h에서, 화학 탈모 유발 종양 개시를 위한 단계 3 또는 UV B 유도 종양 개시를 위한 4 단계로 진행</li>
</ol>3. 화학적 탈모
<ol><li>아이 소 루 레인 시스템이 포함 된 마우스 트리트먼트 룸에 다음과 같은 필수 자료가 장착 되어 있습니다: 헤어 제거 크림, 코 튼 면봉, 종이 피복 및 물.</li>
	<li>마우스를 유도 챔버에 넣고 3.5 4.5%의이 소 폴 루 레인 및 1L/min 산소로 마 취 시켰다.</li>
	<li>호흡 률이 안정화 되 면, 마우스가 발가락 핀치를 수행 하 여 적절 한 마 취 면에 있는지 확인 하 고 마우스를 메인 튜브에 1 ~ 1.5%의 아이 소 루 레인 및 1 L/min 산소와 함께 마 취 유지로 이동 시킨다. 눈가 마 취하에 있는 동안 건조에서 눈을 유지 하기 위해 안구 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>면봉을 사용 하 여 머리카락 제거 크림의 얇은 층을 마우스 피부의 면도 영역에 적용 하십시오.</li>
	<li>크림이 고르게 도포 되 면, 깨끗 한 면봉을 사용 하 여 제거를 시작 합니다. 크림이 피부와 접촉 하는 총 시간은 1 분을 초과 하지 않아야 합니다.</li>
	<li>젖은 종이 천으로 피부를 부드럽게 닦아 내 고 잔류 크림이 제거 되었는지 확인 합니다. 참고: 모발 제거 크림은 완전히 제거 되지 않은 경우 피부에 자극을 유발할 수 있습니다. C57BL/6 배경에 있는 것과 같은 일부 생쥐는 피부염12를 개발 하는 경향이 있을 수 있습니다. 드문 경우 지만, 일부 동물은 제 모 크림 응용 프로그램 또는 기계적 탈모 후 24 시간 이내에 피부염을 개발할 것입니다. 지역 피부 자극의 흔적을 찾기 위해 치료 후 하루에 생쥐를 확인 하십시오.</li>
	<li>제거 된 머리 샤프트와 생물 학적 빈에 사용 된 모든 재료를 버리십시오.</li>
	<li>마 취가 닳아 없어질 때까지 마우스를 빈 깨끗 한 마우스 케이지에 놓습니다.</li>
	<li>생쥐를 케이지로 돌려 준다.</li>
</ol>4. UV-B 조사
<ol><li>아이 소 루 레인 시스템이 포함 된 마우스 트리트먼트 룸에 다음과 같은 필수 자료가 장착 되어 있습니다. 자외선-b 광 시스템, 자외선-B 라이트 미터, 마우스 보호용 커버, 연구원을 위한 추가 UV-B 보호 PPE 및 타이머.</li>
	<li>마우스는 관심의 UV-B 용량 (즉, 0-180 mJ/2cm2)에서 조사 되어야 한다. UV-B 라이트 미터를 사용 하 여 마우스를 조사 하는 적절 한 시간 길이를 결정 합니다. 참고: mW/센티미터2 x 시간 = 복용량</li>
	<li>마우스를 아이 소 루 레인으로 마 취 시킵니다. 유도 챔버에 있는 동안, 3.5를 4.5% 아이 소 루 레인 및 1L/min 산소에 사용 하십시오.</li>
	<li>마우스가 안정 되 면, 발가락 핀치와 마 취 효과를 확인 하 고 UV 챔버에 있는 주요 마 취 튜브에 마우스를 전송 합니다. 눈이 마 취하는 동안 건조에서 눈을 방지 하기 위해 안구 연 고를 적용 합니다. 아이 소 루 레인 1 ~ 1.5%와 1 L/min 산소로 마 취를 유지 합니다.</li>
	<li>등 쪽 피부를 UV-B 보호 물질로 덮어 서 원하는 부위만 노출 시킵니다. 참고: 이때 적절 한 PPE를 활용 해야 합니다. 마우스를 조사 하는 데 필요한 시간은 사용 된 전구의 강도에 따라 다르지만 필요한 시간이 30 초를 초과 하면 마 취를 모니터링 해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>Uv 방지 뚜껑 또는 다른 적합 한 재료를 사용 하 여 UV 챔버를 덮으 십시오.</li>
	<li>자외선 B 램프를 켜고 특정 목적을 위해 연구자에 의해 결정 된 시간 동안 마우스를 조사.</li>
	<li>UV 시스템과 아이 소 포컬을 끄고, 마 취가 닳아 없어질 때까지 마우스를 빈 마우스 케이지에 놓습니다.</li>
	<li>생쥐를 케이지로 돌려 준다.</li>
</ol>5. 조직 처리
<ol><li>
피부 분리
	<ol>
<li>시작 하기 전에 다음을 구하십시오: 악기, 필터 종이 및 종이 타월.
</li>
		<li>IACUC 승인 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 시키고, 진행 하기 전에 사망을 확인 한다.</li>
		<li>머리 깎기를 사용 하 여 등 쪽 피부 부분에서 어떤 머리를 면도. 보풀이 없는 티슈로 가볍게 닦 고 지역을 지웁니다.</li>
		<li>꼬리의 기저 부 바로 위에 날카로운가 위로 작은 절 개를 하십시오.</li>
		<li>절 개에 큰 무딘가 위를 삽입 하 고 진 피 결합 조직을 분리 합니다.</li>
		<li>조직의 가장자리를 따라 날카로운가 위를 절단 하 여 관심 있는 피부 영역을 조심 스럽게 분리 합니다.</li>
		<li>깨끗 한 종이 타월 위에 피부 조직을 놓고 무딘 집게를 사용 하 여 피부를 스트레칭 하 여 수건에 부착 하 고가 르 쳤 다. 이 단계는 그것의 모양을 유지 하면서 조작 하 고 처리 할 수 있도록 조직에 대 한 추가 지원을 제공 하는 역할을 한다. 참고: 조직 학적으로 볼 수 있는 피부에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 피부 조직의 외부 영역을 처리 하는 것에 주의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직 고정
	<ol>
<li>필터 용지를 반으로 접어 적절 하 게 라벨을 부착 합니다. 종이 타월과 함께 피부를 주름에 바로 인접 한 접힌 용지에 놓고 샘플이 부드럽고 접혀 있지 않도록 합니다. 열린 면을 스테이플 하 여 여과 지를 밀봉 한 다음 나머지 용지가 향후 샘플에 사용 될 수 있도록 트림 합니다. 참고: 이 단계는 고정 하는 동안 피부가 모양을 유지 하도록 수행 됩니다.</li>
		<li>실 온에서 3 ~ 5 시간 동안 10% 중성 완충 포 르 말린으로 조직 샘플을 완전히 서브 머지 하 고 4°c에서 밤새 한다.</li>
		<li>고정 후, 포 르 말린에서 샘플을 제거 하 고, 탈 이온 수 (각 5 분)에 세척 하 고 조직 블록을 만들기로 진행 합니다. 피부 조직 (즉, 잔여 종이)에서 잔류 물질을 조심 스럽게 제거 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
냉동 조직 블록 만들기 (그림 1)
	<ol>
<li>피부 샘플의 가장자리를 정돈 하 여 톱니가 고르지 않도록 하 고 3 개의 궁탈 컷을 만듭니다. 이러한 스트립의 폭은 냉동 몰드 (5mm)의 높이 이상 이어야 한다. 다음으로, 하 부 금형 (20mm)의 폭 보다 더 길고, 포함 될 수 있는 피부 조각을 갖도록 횡 방향 절단을 합니다. 등 쪽 피부의 나머지 절반을 반복 하거나 다른 용도로 조직을 저장 하십시오 (또는 고정 하기 전에 반을 저장 하십시오). 참고: 적절 한 방향으로 피부 조각을 유지 하는 것이 중요 합니다.</li>
		<li>세로 방향으로 동결 금형 (25 x 20 x 5mm)의 방향을 지정 하 고 10 월에 4 ~ 5 개 피부를 놓습니다. 모든 조각이 제자리에 되 면, 두 쌍의 미세 집게를 사용 하 여 피부의 긴 가장자리를 저온 금형의 바닥으로 가져옵니다. 이제 피부가 몰드의 베이스에 수직인 OCT에 서 있어야 합니다. 이 단계에서 10 월 내에에 어 포켓의 형성을 최소화 하기 위해 주의를 기울여야 합니다 (그림 1).</li>
		<li>10 월에 두 번째 립에 금형을 채우고 드라이 아이스의 평평한 표면에 놓습니다. 집게를 사용 하 여 블록이 동결 되기 시작 하면 이동 중에 이동 했을 수 있는 모든 피부 조각을 조정 하십시오. 바닥 층이 응고 되 면, 조직의 조작은 불가능 할 것 이다.</li>
		<li>컷 8-10 µm 슬라이드를 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
포 르 말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 블록을 만들기
	<ol>
<li>고정 된 피부 2 개를 표지 된 카세트에 넣고 에탄올의 농도를 30 분으로 증가 시 킴으로써 (75% 에탄올, 30 분에 대 한 85%, 30 분에 대 한 90%, 2 배 30 분에 대 한 100 95%, 자일 렌 또는 자일 렌은 2x 30 분으로 대체 합니다. 58-60 ˚에서 파라핀으로 30 분 동안 먼저 배양 한 다음 밤새 사용 합니다.</li>
		<li>액체 파라핀으로 24 x 24 mm2 스테인레스 스틸 티슈 몰드에 조직을 내장 하 고-5°c에서 응고 시켰다. 조직 방향은 여러 모 낭에 걸쳐 세로 섹션을 시각화 할 수 있도록 냉동 조직 블록의 것과 비슷해야 합니다 (그림 1).</li>
		<li>파라핀이 응고 되 면 몰드를 제거 하 고 분석을 위해 5-10 μ m 섹션으로 자릅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.

피부 흑색 종 종양에서 자주 발견 되는 홀 마크 유전 변경은 잘 설명 되어 있습니다13. 가장 지배적 인 드라이버 돌연변이는 BrafV600E이 고, brafV600E매개 흑색 종을 위한 유전적으로 조작 된 마우스 모델은 보 센 버그 그룹14 에 의해 생성 되 고 잭슨 실험실에서 증 착 되었다. 이 마우스 모델을 사용 하 여, 우리의 최근 연구는 등 쪽 피부에 BrafV600E매개 흑색 종의 유의 한 개시를 위한 종양이 발생 하기 쉬운 mcscs의 세포 활성화의 요구 사항을 설명 했다6.
탈모는 등 쪽 피부에 뮤 린 모 낭 줄기 세포 활성화를 유도 하는 효과적인 방법으로 알려져 있다6,...

흑색 종, 멜 라 세포 종양의 악성 형태는 대부분의 피부 암 사망1을 담당 하는 피부 흑색 종으로 피부의 가장 공격적인 암입니다. 미국에서, 흑색 종은 일반적으로 진단 됩니다; 20182에서 추정 된 새로운 암 발병 사례 중 5th 내지 6번째 가장 흔한 암 유형으로 예상 된다. 더욱이, 전반적인 암 발생률은 최근 수십 년 동안 점진적으로 감소 하는 경향을 보이고 있지만, 지난 몇 십년 동안 피부 흑색 종 발생률은 두 성별 모두에서 지속적이 고 급속 한증가를 보여줍니다.
피부 흑색 종을 보다 효율적으로 퇴치 하기 위해, 임상적으로 효과적인 예방 방법을 더 잘 식별 하기 위해 원산지 세포에서 흑색 종 발달의 초기 사건을 명확 하 게 이해 하는 것이 중요 합니다. 현재 성체 줄기 세포는 피부 조직3,4,5등 다양 한 유형의 장기에서 암의 세포 기원으로 종양 형성에 크게 기여할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 마찬가지로, 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 성체 멜 라 닌 세포 (MCSCs)는 Ras/Raf 및 Akt 통로의 변종 활성화 시 기원의 흑색 종 세포로 서 일할 수 있다6. 그러나, 이러한 발암 돌연변이 단독은 정 맥 내에서 종양 형성을 효율적으로 유도할 수 없다. 멜 리 세포 종양은 결국 MCSCs 자연 헤어 사이클링 동안 활성화 될 때 개발. 그러나,이 프로토콜에서, 우리는 인위적으로 흑색 종 개시6의 정확한 통제를 촉진 하는 종양에 걸리기 쉬운 mcscs의 세포 활성화를 유도 하는 방법을 설명할 것입니다,7.
여기에 설명 된 방법을 통해 서, 피부 흑색 종의 공간적 및 시간적 제어는 종양 발생 가능성이 있는 MCSCs에서 시작 하 여 Pten 발현 손실과 함께 발암 성 brafV600E 을 발현 하 여 성공적으로 수행 될 수 있습니다. 이전에 보고 된6. 이 방법은 탈모를 통해 모 낭 줄기 세포 활성화를 보여주는 이전 연구 결과를 통합 하 고 뮤 린 피부를 UV-B에 노출 시키는 방법 뿐만 아니라 모 낭에 거주 하는 MCSCs의 활성화와이 세포의 이식에 도움이 될 수 있습니다. 간 모 낭 표 피6,9,10에 대 한 하위 집단. 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부에 흑색 종의 현저한 개시를 유도할 수 있는 흑색 종 경향이 있는 MCSCs의 세포 상태를 변화 시킬 수 있는 생리 적 및 환경적 변화가 어떻게 하는지에 관한 귀중 한 정보를 제공할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>타목시펜</td><td>시그마</td><td>T5648-1G</td><td>전신 주입용</td></tr><tr><td>타목시펜</td><td>케이맨 케미컬</td><td>13258</td><td>전신 주입용</td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>시그마</td><td>45-C8267-2.5L-EA</td><td></td></tr><tr><td>4OH-타목시펜</td><td>시그마</td><td>H7904-25MG</td><td>국소 치료용</td></tr><tr><td>26 G 1/2" 바늘</td><td>다양한</td><td></td><td>수의학 등급</td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>각종</td><td></td><td>수의학 등급</td></tr><tr><td>애완 동물 헤어 트리머</td><td>Wahl</td><td>09990-502</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td>대부분의 약국에서 구매</td></tr> 가능 <tr><td>면봉</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자외선 전구</td><td>UVP</td><td>95-0042-08</td><td>모델 XX-15M 미드 레인지 UV 램프</td></tr><tr><td>200 프루프 에탄올</td><td>다양한</td><td></td><td>순수 에탄올</td></tr><tr><td>Histoplast PE</td><td>Fisher Scientific</td><td>22900700</td><td>파라핀 펠릿</td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>6901</td><td>크실렌 대체품</td></tr><tr><td>O.C.T. 화합물</td><td>Thermo</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>Cassette Sakura</td><td>89199-430</td><td>용 FFPE 가공</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td>25 x 20 mm</td></tr><tr><td>FFPE 금속 금형</td><td>Leica</td><td>3803082</td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>다양한</td><td></td><td>수의학 등급</td></tr><tr><td>마취 흡입 시스템</td><td>다양한</td><td></td><td>수의학 등급</td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>FST</td><td>14085-09</td><td>스트레이트, 샤프 / 샤프</td></tr><tr><td>파인 시저</td><td>FST</td><td>14558-09</td><td>스트레이트, 샤프/샤프</td></tr><tr><td>Metzenbaum</td><td>FST</td><td>14018-13</td><td>스트레이트, 무딘/뭉툭</td></tr>한 <tr><td>집게</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>집게</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>Micro-Adson</td></tr><tr><td>Tyr-CreER; LSL-브래프V600E; Pten-f/f</td><td>Jackson Labs</td><td>13590</td><td></td></tr><tr><td>LSL-tdTomato</td><td>Jackson Labs</td><td>007914</td><td>ai14</td></tr><tr><td>Cre-1</td><td></td><td>n/a</td><td>GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG</td></tr><tr><td>Cre-2</td><td></td><td>n/a</td><td>GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG</td></tr><tr><td>Braf-V600E-1</td><td></td><td>n/a</td><td>TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC</td></tr><tr><td>Braf-V600E-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CTCTGCTGGGAAAGCGGC</td></tr><tr><td>Kras-G12D-1</td><td></td><td>n/a</td><td>AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA</td></tr><tr><td>Kras-G12D-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA</td></tr><tr><td>Pten-1</td><td></td><td>n/a</td><td>ACTCAAGGCAGGGATGAGC</td></tr><tr><td>Pten-2</td><td></td><td>n/a</td><td>AATCTAGGGCCTCTTGTGCC</td></tr><tr><td>Pten-3</td><td></td><td>n/a</td><td>GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC</td></tr><tr><td>tdTomato-1</td><td></td><td>n/a</td><td>AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA</td></tr><tr><td>tdTomato-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CCGAAAATCTGTGGGAAGTC</td></tr><tr><td>tdTomato-3</td><td></td><td>n/a</td><td>GGCATTAAAGCAGCGTATCC</td></tr><tr><td>tdTomato-4</td><td></td><td>n/a</td><td>CTGTTCCTGTACGGCATGG</td></tr></tbody></table>

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

피부 흑색 종은 가장 공격적인 피부 암으로 잘 알려져 있습니다. 비록 위험 요인과 주요 유전 변화는 계속 해 서 증가 하는 깊이로 문서화 될 수 있지만, 피부 흑색 종의 발병 률은 최근 수십 년 동안 급속 하 고 지속적인 증가를 보이고 있다. 효과적인 예방 방법을 찾기 위해, 피부에 흑색 종 개시의 초기 단계를 이해 하는 것이 중요 합니다. 이전 데이터는 종양 생성 돌연변이 및 유전적 변경을 발현 할 때 성체 피부 조직에서 여 포 멜 라 닌 세포 (MCSCs)가 원산지의 흑색 종 세포로 작용할 수 있다는 것을 입증 하였다. 흑색 종에 걸리기 쉬운 MCSCs에서 발생 하는 종양은 대기에서 활성 상태로의 MCSCs 전이로 인해 유발 될 수 있다. 흑색 종 발생 가능한 MCSCs에서의 이러한 전환은 모 낭 줄기 세포의 활성 상태 또는 자외선-b와 같은 외적 환경적 요인을 통해 어느 하나의 변조에 의해 촉진 될 수 있다. 이러한 요인은 화학 탈모에 의해 실험실에서 인위적으로 조작 될 수 있으며,이는 모 낭 줄기 세포와 MCSCs를 정 동작 상태에서 활성 상태로, 그리고 벤치탑 광을 사용 하 여 UV-B 노출로 전환 시키는 원인이 됩니다. 이 방법 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 피부 흑색 종 개시의 성공적인 공간 그리고 시간적 통제를 제공 합니다. 따라서, 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부 흑색 종 개시의 초기 단계를 정의 하 고 종양 예방을 위한 잠재적인 방법을 시험 하는데 사용 될 수 있는 가치가 있을 것 이다.

화학 탈모에 의해 유도 된 피부 흑색 종 개시
화학 탈모의 절차는 그림 2에 묘사 되어 있습니다. 생쥐가 7 주 후 나 탈 때, 등 쪽 피부가 telogen에 있습니다. Telogen 동안, 모 낭 줄기 세포 및 MCSCs는 정 동작, 휴식 상태에 있는 것으로 알려져 있다. 피부는 면도 후 중요 한 머리카락의 성장을 표시 해야 합니다. 한편, 화학적 탈모는 모 낭 줄기 세포 활성화를 유도할 수 있으며,이는 차례로 관심 영역 으로부터 상당한 모발 성장을 나타낸다 (도 2). 유사 하 게, 종양에 걸리기 쉬운 MCSCs는 발암 돌연변이를 발현 하 고 또한 종양 형성 가속화를 위해 활성화 될 필요가 있다. 화학적 탈모는 모 낭 줄기 ...

다음 절차는 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용 하 여 뮤 린 등 피부에 멜 라 세포 종양 개시의 공간적 및 시간적 제어를 위한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 거시적 뿐만 아니라 현미경 피부 흑색 종 개시를 설명 합니다.

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

흑색종은 전 세계적으로 널리 진단되며, 발병률이 증가합니다. 이 프로토콜은 흑색종 개시의 초기 단계가 신중하게 통제될 수 있게 해주며, 그 발달의 연구를 용이하게 합니다. 흑색세포 줄기 세포 활성화의 시간과 위치를 제어함으로써, 우리는 줄기 세포 인구 내의 변화와 새로운 균주 흑색종 개시 내의 변화를 분별할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 실험실대학원생인 김다히름과 윤예안이 될 것이다. 시술을 시작하기 2~3일 전에 전기 트리머를 사용하여 7주 된 각 마취된 마우스에서 등갈 피부를 면도합니다. 실험 당일면 면봉을 사용하여 노출된 피부에 얇은 탈모 크림층을 적용합니다.크림을 고르게 바르면 깨끗한 면봉을 사용하여 크림을 제거하고 젖은 천으로 부드럽게 닦아 잔류 크림을 제거하십시오. 그런 다음 전체 복구될 때까지 모니터링하여 각 마우스를 홈 케이지로 반환합니다. UV-B 조사의 경우, 원하는 부위만 노출되도록 UV-B 보호 재료로 등대 피부를 덮고 UV 내성 뚜껑으로 UV 챔버를 덮습니다.그런 다음 UV-B 램프를 켜서 마우스를 적절한 실험 기간 동안 조사한 후 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 빈 케이지로 되돌린다. 피부 샘플을 격리하려면 전기 트리머를 사용하여 안락사 된 쥐의 등대 피부 영역에서 머리카락을 제거하고 노출된 피부를 보풀이없는 조직으로 가볍게 브러시하여 영역을 지웁웁습니다. 꼬리 의 바닥 바로 위에 날카로운 가위로 작은 절개를하고 피하 결합 조직을 분리하기 위해 절개에 크고 무딘 가위를 삽입합니다.날카로운 가위를 사용하여, 신중하게 조직 샘플을 격리하고 깨끗한 종이 타월에 절제 된 피부 조직을 배치하기 위해 관심의 피부 영역의 가장자리를 따라 잘라. 그런 다음 칙칙한 집게를 사용하여 피부를 스트레칭하여 수건을 부착하고 팽팽하게 합니다. 모든 샘플을 수확하면, 피부 샘플과 종이 타월을 주름에 바로 인접한 접힌 필터 용지에 넣고 시료가 매끄럽고 접히거나 구겨지지 않도록 주의하십시오.필터 용지의 측면을 스테이플로 닫고 용지를 다듬습니다. 그런 다음 실온에서 3~5시간 동안 10% 중성 버퍼링 포머닌에 샘플을 완전히 담그고, 5분간 의 세척을 사용하여 티슈를 탈온화된 물에 세척합니다. 두 번째 세척 후, 피부 조직에서 잔류 재료를 조심스럽게 제거하고 샘플의 가장자리를 다듬어 들쭉날쭉하지 않도록 합니다.다음으로 각 샘플에서 3개의 적발 절단을 만들어 스트립의 너비가 5밀리미터 를 넘지 않도록 하고, 샘플이 폭이 20밀리미터 이하가 되도록 횡방향 컷을 만듭니다. 최적의 절삭 온도 또는 OCT 매체를 포함하는 저온 몰드를 세로 방향으로 배치하고 10월 위에 4~5개의 스킨을 배치합니다. 모든 조각이 제자리에 있을 때, 두 쌍의 미세 한 집게를 사용하여 각 피부의 긴 가장자리를 극저온 금형의 바닥에 가져와 서 샘플이 10 월 내에 수직이고 곰팡이의 베이스에 수직이되도록하십시오.그런 다음 금형을 두 번째 입술에 추가 10월로 채우고 금형을 드라이 아이스 조각의 평평한 표면에 놓고, 집게를 사용하여 블록이 필요에 따라 동결되기 시작하면 이송 중에 이동했을 수 있는 모든 피부 조각을 조정합니다. 생쥐가 산후 7주일 때, 그들의 등갈 피부는 텔로겐에 있습니다. 텔로겐 동안, 모낭과 멜라닌 세포줄기 세포는 정지 휴식 상태에 있는 것으로 알려져 있고, 피부는 면도 후에 중요한 머리 성장을 보여주지 말아야 합니다.화학 적 분 멸, 그러나, 모낭 줄기 세포 활성화를 유도할 수 있습니다., 관심의 영역 내에서 상당한 머리 성장을 유도. 화학적 탈취가 모낭과 멜라닌세포 줄기세포의 활성화를 유의로 유도할 수 있으므로, 활성 상태에서 흑색종경향이 있는 흑색세포 줄기세포는 종양을 형성할 수 있고 미세한 흑색종 개시는 화학적 탈약2주 이내에 관찰될 수 있다. UV-B 조사는 또한 정지, 종양 경향이 멜라닌세포 줄기 세포에서 종양 개시를 유도할 수 있습니다.중요한 것은, UV-B는 여포 간 피피로 그들의 여포 줄기 세포 틈새에서 멜라노시스 줄기 세포의 직접적인 전좌를 유도합니다. 더욱이, UV-B는 피부 피연전 전반에 걸쳐 흑색세포 줄기 세포 유래 피부흑색종 형성을 유도할 수 있다. 등쪽 피부와 유사하게, UV-B 유도흑색종 개시는 귀 피부와 같은 그밖 피부 지역에서 주목할 수 있습니다.실제로 UV-내성 천으로 덮인 조절 귀 피부에 비해 UV-B에 노출된 귀 피부는 흑색종 개시의 부담이 높기 때문에 더 높은 색소 침착을 보여줍니다. UV-B의 다른 복용량 마우스 피부와 멜 라 닌 세포 활동에 다른 효과 있을 수 있습니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 조사 용량을 결정하고 최적화하는 것이 중요합니다.

spatial-temporal-control-murine-melanoma-initiation-from-mutant

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

이 비디오에서는 인간 유래 흑색종 세포를 면역이 저하된 마우스의 옆구리에 피하로 이식합니다. PDX 모델을 사용하면 생체 내  조건에서 관찰된 종양 이질성과 흑색종 공격성을 더 잘 요약할 수 있는 흑색종 세포의 전임상 조사를 수행할 수 있습니다.

환자 유래 이종이식 모델링: 흑색종 마우스 모델을 생성하는 기술

표피의 멜라닌은 공정한 피부가 자외선에 민감한 인간의 쥐 모델 포스 콜린의 국소 응용 프로그램에 의해 유도된다. 최소 홍반 량 (MED) 분석에 의해 측정 된 강력한 UV-매개 성 염증 (자외선)으로부터 보호 어둡게 피부 표피에있는 캠프 수준의 약리학적인 조작.

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

여기, 우리이 두 아키텍처는 3D organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 프로토콜을 제시 하 고 다세포 복잡 한 기관/종양에 vivo에 의 하지만 같은 시간에 수용 체계적인 실험 내정간섭입니다.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.

흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

이 기사는 흑색종 전이의 새로운 후보 매개체와 그 작용 메커니즘을 테스트하는 데 사용되는 기술의 워크 플로우에 대해 설명합니다.

흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼

현재 프로토콜은 광간섭 단층촬영을 사용하여 쥐 맥락막에 흑색종의 이식 및 평가를 설명합니다.

광간섭 단층촬영을 통한 쥐 맥락막의 흑색종 이식 및 평가

학습하세요 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 멜라닌 세포 줄기 세포의 공간적 및 시간적 활성화를 제어하는 방법으로, 피부 흑색종 발생 초기 단계를 정밀하게 연구할 수 있습니다.

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

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