Name: 소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 소형 돼지에서 1차 대동맥 내피 세포를 효과적으로 분리하고 배양하는 효소 소화법을 사용하는 방법을. 이 기술은 이종이식 연구에서 면역 및 응고 반응을 연구하는 데 필수적인 순도 높은 세포를 제공합니다.

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이 작품은 광동성 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다, 보조금 / 수상 번호: 2016A030313028; 광동성 의학 과학 연구 재단, 보조금 / 수상 번호: B2018003; 심천 과학 기술 재단, 그랜트 / 수상 번호: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY202022229204449975, GJHZ2022920449975, GJHZ20170331417135556, JCYJ20201604011 및 JCYJ2016040440404040 심천 롱화 지구 과학 기술 재단, 보조금 / 수상 번호: 2017013; 중국 의 국가 주요 R & D 프로그램, 보조금 / 수상 번호: 2017YFC1103704; 심천에서 의학의 산밍 프로젝트, 그랜트 / 수상 번호: SZSM201412020; 광동성 고등병원 건립특별기금(2019년) 심천의 높은 수준의 의료 분야 건설을위한 기금, 보조금 / 수상 번호: 2016031638; 심천 건강 및 가족 계획 위원회의 재단, 보조금 / 수상 번호 : SZXJ2017021 및 SZXJ2018059. 우리는 원고의 준비를 도와 준 심천 대학에서 한청 장과 Zhicheng Zou 감사합니다.

동물의 사용은 동물 복지의 원칙에 따라 심천 제 2 인민 병원의 윤리 검토위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 동물, 중간 및 완충제 의 준비
<ol><li>미니어처 돼지를 준비합니다. 참고 : 모든 미니어처 돼지는 중국 우지산 또는 바마 돼지 (수컷)였다. 돼지의 연령 및 체중은 각각 100일간 ±8일 및 5.7 kg±1.0 kg(평균±SD, n=3)이었다.</li>
	<li>배양 배지를 준비하십시오: 내피 세포 배지 (ECM) 10% (v/v) 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) 및 1% (v/v) 내피 세포 성장 보충제 (ECGS)로 보충.</li>
	<li>세척 버퍼 준비: 1% (v/v) P/S가 있는 1x PBS 용액(pH 7.4).</li>
	<li>0.005% 콜라게나아제 IV 소화용액을 준비하십시오: PBS 용액 20 mL에 콜라게나아제 IV 파우더 1 mg. 소화 전에 37°C에서 콜라게나아제 소화액을 미리 데우다.</li>
	<li>정지 버퍼 준비: 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)는 10% 열 불활성화 FBS와 1% P/S로 보충됩니다.</li>
</ol>2. 돼지 대동맥 내피 세포 격리를위한 수술 및 준비
<ol><li>수술 을 수행하기 전에 1 시간 동안 UV 광으로 수술실을 소독하고 의료 용 소독제 84 액체 (사용 가능한 염소 함량은 4.0 % - 5.0 %, 재료표).</li>
	<li>소형 돼지가 15 mg/kg 케타민, 15 mg/kg 자일라진 염산염 및 0.05 mg/kg 페나세틴 염산염(부적: 100μL/kg, 재료표)에의해 형성된 근육 내 주사를 받은 후(그림1A),동물의 확인 돼지 고통스러운 자극을 검사와 마취 상태 (예를 들어, 한 쪽 귀를 꼬집거나 한 쪽 앞다리를 흔들어) 및 생리 지수 (예를 들어, 혈압, 심장과 호흡 속도). 참고: 또 다른 반 복용량 주입 깨어의 흔적을 보여주는 경우 돼지에 게 주어질 수 있습니다.</li>
	<li>메스로 복부를 자르고 열등한 정맥을 노출시키고 결과적으로 헤파린 나트륨 (5,000 U, 재료표)을 5 mL 주사기로 열등한 정맥에 주입합니다.</li>
	<li>5 분 후, 혈액에 복부 대동맥에 카테터를 삽입하고 가슴의 피부를 자르고 메스로 횡격막을 절개한 후 좌심실을 잘라냅니다. 참고 : 돼지가 혈액을 흘리고 심장을 절단 한 후 대동맥 맥박을 확인하여 안락사되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>뼈 집게 (재료표)로 갈비뼈를 절제하고 심장과 폐를 노출시다. 심장과 폐에 대한 후방을 찾아 두 끝을 고정합니다. 대류를 미리 냉각된 세척 버퍼로 한 번 씻습니다(그림1B,C).</li>
	<li>가위로 대공을 잘라내고 양쪽 끝에 대오르타를 고정시되게 합니다. 멸균 집게와 가위로 대강 주위의 과잉 조직을 제거하십시오. 대불을 50 mL 원심 분리튜브에 넣고 미리 냉각된 세척 버퍼로 대불을 3배(세척당 30mL)로 세척하고 대불을 실험실로옮김(그림 1D).</li>
</ol>3. 돼지 대동맥 내피 세포의 격리
<ol><li>무균 조건하에서, 돼지 대불을 세척 완충제에서 제거하고, 150 mm 페트리접시에 놓는다(그림 2A).</li>
	<li>대공의 두 끝을 부드럽게 잘라내고 멸균 집게와 가위로 대공 주위의 과잉 조직을 다시 절제하십시오 (그림2B). 대류의 외부와 내부를 20-50 mL의 세척 버퍼로 세척하십시오(실온에서 배양 접시 위에). 참고: 일부 EC가 이 부위에 손상되었기 때문에 수술 중에 클램프가 놓인 부위만 잘라내고 과도한 조직과 동맥 측 가지를 제거하십시오.</li>
	<li>대장을 통해 수술 봉합사를 통과한 다음 외과 봉합사 (5-0, 90cm, 재료표)를 사용하여 대반의 한쪽 끝을 묶습니다. 외과 봉합사를 대강장 안쪽에 보관하십시오 (그림2C,D).</li>
	<li>집게로 묶인 끝 부근에 대장을 부드럽게 고정한 다음 대류의 내피 표면이 노출될 때까지 대류를 반대로 하기 위해 수술 봉합사를 천천히 당깁니다(그림2E-G). 참고 : 묶여 끝 근처에 대장을 고정하고 대장을 단단히 고정하지 마십시오, 또는 다른 대는 수술 봉합사를 당겨 반전 할 수 없습니다.</li>
	<li>대류의 내피 표면을 세척 버퍼 3x (세척 당 10 mL)로 씻은 다음이 용액을 폐기하십시오. 대불을 15 mL 원심분리기 튜브에 넣고 튜브에 10 mL0.005 % 콜라게나아제 IV 소화 액으로 대불을 덮습니다 (그림2H). 참고: 소화 전에 37°C에서 0.005% 콜라게나아제 IV 소화액을 미리 데우세요.</li>
	<li>37°C에서 15분 동안 배양. 소화된 대류와 소화액을 100 mm 배양 접시에 넣고 미리 냉각된 스톱 버퍼를 10-15 mL 추가하여 0.005% 콜라주나아제 IV의 효과를 막습니다. 참고: 권장되는 소화 시간은 10분에서 20분 사이입니다. 대류의 내피 표면이 정지 버퍼로 덮여 있는지 확인합니다.</li>
	<li>세포 스크레이퍼를 사용하여 대공의 내부 표면에서 pAECs를부드럽게 긁어냅니다 (그림 2I). 긁힌 대류를 세척 버퍼 (시간당 5 mL)로 3 x 씻으하십시오. 배양 접시에서 용액을 50 mL 원심 분리튜브에 넣습니다. 배양 접시의 바닥을 세척 버퍼(시간당 5 mL)로 2x 세척하고 용액을 다시 50 mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 참고: 한 방향으로 부드럽게 긁어 내고 압축하지 마십시오. 가장자리와 구멍 근처의 조직을 만지지 마십시오. 5-8x를 긁는 것이 좋습니다.</li>
	<li>4 °C에서 6 분 동안 600 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 상급체를 버리고 50 mL 원심 분리튜브 바닥에 10 mL의 용액을 둡니다. 50 mL 원심 분리튜브에 20 mL의 세척 버퍼를 추가하고 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 이 단계에서는 거품을 피하십시오.</li>
	<li>4 °C에서 6 분 동안 600 x g에서 원심 분리기. 상급체를 천천히 버립니다. 배양 배지 1 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 잘 섞는다. 참고: 얻어진 cm 대류당 EC의 평균 수는 1.9 x 10 5±1.4 x 10 4(평균 ± SD, n=3)이다.</li>
	<li>셀 카운터로 셀을 계산합니다. 플레이트 및 배양 세포는 세포 수에 따라 어떤 물질을 코팅하지 않고 용기에 세포를 배양한다. 세포 수가 1.0 x 106보다낮거나 같으면, 배양 세포는 25 cm2 플라스크에서 배양한다. 세포 수가 1.0 x 106보다큰 경우, 배양 세포는 여러 25 cm2 플라스크(플라스크당 1.0 x 10 6세포)에서 배양한다. 플라스크를 37°C에서 37°C에서 5% CO2로 인큐베이터에 놓고 2-3일마다 배지를 교체합니다. 참고 : 일부 세포는 세포 스크레이퍼에 의해 손상됩니다. 세포 생존율 분석결과, 살아있는 세포의 백분율은 95.7% ±1.7%(평균 ±SD, n=3)로 나타났다. 단리된 세포의 두 배 시간은 약 1-2 일입니다.</li>
</ol>4. 수확 및 순수한 내피 세포의 특성화
<ol><li>세포가 약 4-5 일 동안 자라도록 둡니다. 세포가 80% 합류에 도달하면 (그림3A),0.25% 트립신으로 세포를 소화하고 세포를 통과한다. 이어서, 일부 단리된 세포를 수집하고(3일째, 1항 및 통로 2) 유세포분석(항-CD31 항체)에 의해 식별한다.</li>
	<li>단질된 pAECs (세포 수:1 x 10 5) (3일째, 항문 1 및 통로 2) 항포르신 CD31-플루오세인 이소티오미세네이트(FITC) 공액 항체(100 μL 세포당 10 μL 항체, 세포 세포 4°C에서 30분 동안 염색).</li>
	<li>전방 분산 플롯, 음수 대조군으로 스테인드되지 않은 샘플을 사용하여 총 라이브 셀 모집단을 게이트합니다. 그런 다음 히스토그램으로 문이 닫힌 세포의 CD31 양성 세포를 제시합니다. 참고: CD31 양성 세포의 효능은 각각 97.4% ±1.2%(3일째), 94.4% ±1.1%(P1) 및 92.4% ±1.7%(평균±SD)이다(그림 3B).</li>
</ol>

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<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

내피 세포는 혈관 기능 장애, 당뇨병, 조직 재생, 이식 및 암14,15,16,17,18의연구에 일반적으로 사용된다. 이러한 질병에서 EC의 생물학 및 기능을 이해하고 특성화하기 위해, 다른 병든 장기 또는 조직의 EC를 분리하는 수많은 방법이8,19,20, 보고되었다. 21세 , 22세 , 23세</...

이식에 사용할 수 있는 장기의 부족은 전세계적으로 눈에 띄는 문제 1. 중국 적십자사에 따르면, 2018년 중국에서 말기 장기 부전 환자 중 소수의 환자만이 적합한 장기를 받았다고 합니다.
Xenotransplantation은 장기 부족 문제를 해결할 수있는 유망한 방법입니다. 돼지 장기는 해부학및 생리적 유사성 때문에 인간에게 가장 적합한기관으로 간주되며 2,3. 돼지 이종이식의 실패는 주로 영장류 면역 거부 및 응고 반응과 관련이 있다. 돼지 내피 세포(ECs)는 이들 세포가 항체, 보체, 사이토카인 및 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 및 대식세포)를 포함하는 영장류 면역계와 상호 작용하는 첫 번째 세포이기 때문에 중요하다 4,5. 돼지 장기와 아일렛 이종이식6,7에서중요한 역할을 하는 돼지 ECs. 따라서, ECs는 돼지 이식편에 대한 거부 및 응고 반응을 조사하기 위한 중요한 세포이다. 이종이식 연구에는 고품질 돼지 EC의 분리가 필요합니다.
상이한 장기(예를 들어, 심장, 신장, 간 및 대류)로부터 EC를 분리하려는 시도에서, 여러 프로토콜은8, 9,10,11,12를 이종이식으로 보고되었다. 그러나 격리된 EC의 초순수 문화를 유지하는 것은 표준 프로토콜에서 뛰어난 문제입니다. 소화 된 용액의 농도 증가, 부적절한 소화 시간 및 긁힘 강도는 현재연구에서섬유 아세포 오염 증가8,10,13에기여할 수 있습니다. 게다가, 소형 돼지에서 분리 된 pAECs의 방법은 덜 연구된다. 여기서, 우리는 소형 돼지 (우지산 또는 바마)에서 고도로 정제 된 pAECs를 분리하는 최적화 된 효소 방법을 설명합니다. 프로토콜의 여러 단계는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 EC를 얻기 위해 고안되었습니다.

<table><tbody><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boneforceps</td><td>베이징 HeLi KeChuang 기술 개발 CO., Ltd. 중국</td><td>HL-YGQ&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BOON 일회용 주사기 (10ml)</td><td>Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31-FITC 항체</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1746F</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크래퍼</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3010#</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IV</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5138#-1G</td><td></td></tr><tr><td>컴파운드 케타민 주사&nbsp;</td>중국 <td></td><td>선양의 수의학 제약 공장</td><td>케타민 염산염?0.3g/2ml, 자일라진 염산염:0.3g/2ml, 페나세틴 염산염?1mg/2ml</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디염산염)</td><td>생명 과학</td><td>D1306#</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>생명 기술</td><td>11965118#</td><td></td></tr><tr><td>ECM</td><td>Sciencell</td><td>1001#</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Sciencell</td><td>1052#</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&nbsp;</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C#</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353003#</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 세럼</td><td>GIBCO</td><td>10270-106#</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치&nbsp;</td><td>ShangHai medical instruments Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>요오드 팅크</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniature Pig (Bama 또는 Wuzhishan)</td><td>Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mshot microscope&nbsp;</td><td>광저우 마이크로 탄 기술 Co., 주식 회사.</td><td>M152</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (150 x 15 mm)</td><td>Biologixgroup</td><td>66-1515#</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15070063#</td><td></td></tr><tr><td>벤트 캡이 있는 직사각형 경사 목 세포 배양 플라스크? T25?</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3289#</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 전사 피펫 (10ml)</td><td>JET Biofil</td><td>GSP010010#&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 파스퇴르 피펫</td><td>GeneBrick</td><td>GY0025#</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터 (0.22&micro; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS#</td><td></td></tr><tr><td>외과용 메스</td><td>ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td><td>22#</td><td></td></tr><tr><td>외과용 봉합</td>사 <td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td><td>5-0#</td><td></td></tr><tr><td>주사기?5mL?</td><td>Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>GIBCO</td><td>25200056#</td><td></td></tr><tr><td>75% 의료용 알코올</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 x PBS 용액(pH 7.4, 뉴클레아제 무료)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B540627#</td><td></td></tr><tr><td>Medical 소독제 84 액체</td><td>쓰촨성 Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td><td>450ml/병</td><td></td></tr></tbody></table>

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation은 말기 장기 부전 환자를 위한 인간 기관의 부족을 해결하는 유망한 방법이고, 돼지는 적당한 기관 근원으로 여겨됩니다. 면역 거부 및 응고는 이종이식의 성공을 위한 2개의 중요한 장애물입니다. 혈관 내피 세포 (EC) 손상 및 기능 장애는 이종이식에서 염증 및 응고 반응의 발달에 중요하다. 따라서, 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)의 분리는 면역 거부 반응 및 응고 반응을 조사하기 위해 필요하다. 여기에서, 우리는 소형 돼지에서 고도로 정제된 pAE의 격리, 특성화 및 확장을 위한 간단한 효소 접근법을 개발했습니다. 첫째, 미니어처 돼지는 케타민으로 마취되었고, 대공의 길이를 절제시켰다. 둘째, 대치의 내피 표면은 0.005 % 콜라게나아제 IV 소화액에 15 분 동안 노출되었습니다. 셋째, 대초원의 내피 표면은 세포 스크레이퍼 (<10 회)로 한 방향으로만 긁어 내고 (<10 번), 및 의 과정에서 압축되지 않았습니다. 긁. 마지막으로, 제3일의 단리된 pAECs, 및 제1및 2항 후에, 항-CD31 항체를 가진 유세포측정에 의해 확인되었다. CD31 양성 세포의 백분율은 각각 97.4% ±1.2%, 94.4% ±1.1%, 및 92.4% ±1.7%(평균 ±SD)였다. 콜라게나아제 IV의 농도, 소화 시간, 방향, 스크레이핑의 빈도 및 강도는 섬유아세포 오염을 줄이고 고순도 및 많은 수의 EC를 얻는 데 매우 중요합니다. 결론적으로, 우리의 효소 방법은 소형 돼지 대원으로부터 EC를 분리하는 고효율 방법이며, 세포는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하기 위해 시험관 내에서 확장 될 수 있습니다.

우리의 방법은 소형 돼지에서 대불에서 고도로 정제 된 EC를 분리하는 효과적인 방법을 제공하는 것을 목표로합니다. 대동맥 수술 의 과정은 그림1에 도시되어 있습니다. 첫 번째 단계는 전체 대류가 돼지에서 절제된다는 것입니다. 다른 세포 또는 세균 오염을 방지하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, 표적세포나 세균이 대류를 오염시킬 경우 다른 장기 나 조직을 손상시키지 말고, 미리 냉각된 세척 완충액으로 대장을 3배 세척한다(도1B-D). 세포 생존력을 유지하는 또 다른 중요한 단계는 외과 시편과 격리 절차를 얻는 사이의 기간을 최소화하는 것입니다.
PAE의 정제에 관여하는 프로세스는 그림 2에나와 있습니다. 우리의 방법은 대류의 한쪽 끝이 묶여 있고 내피 표면이 노출되기 때문에 다른 방법과 다릅...

소형 돼지로부터 1차 돼지 대동맥 내피 세포(pAECs)를 분리하는 효과적인 효소 방법이 설명되어 있다. 단리된 1차 pAECs는 이종이식에서 면역 및 응고 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

이 방법은 소형 돼지로부터 내피 세포를 격리시키는 매우 효과적인 방법입니다. 그리고 세포도 확장될 수 있고, xeno이식에서 면역 및 응고 반응을 조사한다. 기술의 주요 장점은 돼지로부터 고도로 정제된 내피 세포를 분리하는 것이 쉽고 매우 효과적일 뿐만 아니라 다른 PC를 통과할 때 유지하는 것이 더 낫다는 것입니다.마취돼지의 통증 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 돼지 복벽을 75%의 의료 알코올로 3회 세척하고 요오드 1개를 씻어낸다. 마지막 세척 후 메스를 사용하여 복부 절개를 하여 열등한 베나 카바를 노출시키고 5밀리리터 주사기를 사용하여 5000단위의 헤파린 나트륨을 열등한 베나 카바에 주입합니다. 5분 후, 카테터를 복부 대어타에 삽입하고 메스를 사용하여 다이어프램을 절개합니다.두 번째 조사자의 도움으로 왼쪽 심실을 제거하고 뼈 집게를 사용하여 갈비뼈를 절제하여 심장과 폐를 노출시합니다. 대자 후방을 심장과 폐에 찾아 끝을 고정시다. 가위를 사용하여 대어타를 소비하고 미리 냉각된 세척 버퍼로 한 번 세척합니다.멸균 집게와 가위로 대어타 주변에 과도한 조직을 제거하고, 실험실로 이송하기 위해 신선한 미리 냉각된 세척 버퍼를 포함하는 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 용기를 놓습니다. 돼지 대동맥 내피 세포 절연의 경우 돼지 대동맥을 무균 조건하에서 150mm 페트리 접시로 옮기고 혈관의 양 끝을 부드럽게 제거하십시오. 혈관이 고정된 여분의 여분의 조직을 멸균 집게와 가위로 다듬고 20~50밀리리터의 신선한 세척 버퍼를 사용하여 대오르타 의 외부와 내부를 헹구세요.다음으로, 대자를 통해 외과 봉합사를 전달하고, 느슨하게 혈관의 한쪽 끝을 묶어 루멘 내에서 봉합사를 유지합니다. 집게로 묶인 끝 부근의 대어타를 부드럽게 고정한 다음 수술 봉합사를 천천히 당겨 대마의 내피 표면이 노출될 때까지 대마를 반전시다. 대마의 내피 표면을 세척당 신선한 세척 버퍼 10 밀리리터로 세 번 씻고 대마를 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다.샘플을 섭씨 37도의 10 밀리리터로 덮고 0.005%의 콜라게나아제 IV 소화용액을 데우고, 15분 동안 37°C에서 조직을 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 전체 튜브 내용물이 100mm 배양 접시로 옮기고, 미리 냉각된 정지 버퍼의 10~15밀리리터로 소화를 체포한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 용기의 내부 표면에서 대동맥 내피 세포를 부드럽게 제거하고 세척당 5 밀리리터의 세척 버퍼로 용기를 세 번 씻습니다.마지막 세척 후, 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 옮기고, 50 밀리리터 튜브의 세척을 당 5 밀리리터의 신선한 세척 버퍼로 문화 접시의 바닥을 두 번 씻습니다. 원심 분리에 의해 세포를 수집하고, 상류체의 마지막 10 밀리리터를 제외한 모든 폐기. 20 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하여 펠릿을 재일시 중단하고 거품을 피하고 다른 원심 분리로 세포를 수집합니다.계산을 위해 세포 배양 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 25센티미터 제곱 플라스크 농도당 6개의 세포에 11회 10시에 세포를 플레이트한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 세포를 5%의 이산화탄소에 섭씨 37도에 놓고 2~3일마다 배지를 상쾌하게 한다. 격리 후, 내피 세포는 0일, 1, 2일에 검사되고, 오염 및 형태학적 평가를 위해 1개와 2개의 구절 후에 검사됩니다.항 CD31-FITC 항체를 이용한 유동 세포 분석은 배양 3일째에 전형적으로 97%이상의 내피세포 마커 양성 집단을 나타내며, 이는 두 구절 후에도 90% 이상의 순도로 유지된다. 대자의 내피 표면은 셀 스크레이퍼로 10배 미만의 한 방향으로만 긁어내고, 스크래핑 과정에서 압축되지 않았다. 가장 좋은 대답, pAEC 격리의 최적화 된 방법, 우리는 개별 실험을 수행하고 xeno 이식에서 면역 거부 및 응고 반응을 조사하기 위해 정제 된 pAEC를 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

판막병 내피 세포의 분리

혈액 - 문의 autologous 세포 및 시험 biocompatibility과 biomaterials 것은 시딩의 티타늄에 대한 방법을 설명합니다. 이 방법은 돼지의 venae cavae에 주입 수술의 분 이내에 씨앗 내피 전구 세포와 티타늄 튜브를 사용합니다. 이 기술은 다른 많은 implantable 생명 의학 장치에 적용할 수 있습니다.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

이 비디오에서는 미니어처 돼지에서 대동맥을 외과적으로 제거하는 절차를 보여줍니다. 이러한 분리된 대동맥에서 채취한 내피 세포는 응고 및 면역 반응을 연구하기 위해 체외 조건에서 추가로 배양할 수 있습니다.

돼지 대동맥 분리: 다운스트림 분석을 위해 미니어처 돼지에서 흉부 대동맥을 절제하는 수술 절차

이 비디오에서는 1단계 콜라겐분해효소 분해를 사용하여 돼지 모델의 복부 대동맥에서 내피 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 내피 세포는 추가 다운스트림 적용을 위해 배양할 수 있습니다.

돼지 대동맥 내피 세포(pAEC) 분리: 수확된 돼지 복부 대동맥에서 내피 세포를 분리하는 효소 기반 방법

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

혈관에서 일차 내피 세포를 분리하는 새로운 방법이 필요합니다. 이 프로토콜은 관심 혈관을 완전히 역전시켜 내피 쪽만 효소 소화에 노출시키는 새로운 기술을 설명합니다. 그 결과로 얻은 순수 내피 세포 배양은 심혈관 질환, 질병 모델링 및 혈관 신생을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

배우세요 소형 돼지에서 1차 대동맥 내피 세포를 효과적으로 분리하고 배양하는 효소 소화법을 사용하는 방법을. 이 기술은 이종이식 연구에서 면역 및 응고 반응을 연구하는 데 필수적인 순도 높은 세포를 제공합니다.

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

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