Name: 식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 배우세요 원자력 현미경 검사법을 사용하여 식물 세포 및 조직의 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을. 비침습적 기법으로 생체 샘플에서 정확한 데이터를 획득할 수 있습니다.

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PLATIM 팀의 기술 지원에 감사드리며, 아레즈키 부다우드와 RDP 연구소의 생물물리학 팀원들에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다.

<ol><li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li>
<li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Can mechanics control pattern formation in plants?</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li>
<li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li>
<li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanislas%2C+T+%22Methods+in+Cell%22">Methods in Cell</a>. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).</li>
<li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li>
<li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li>
<li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically%2C+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+science%22%5BJournal%5D)">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li>
<li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li>
<li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls%3A+implications+for+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li>
<li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity%2C+elasticity%2C+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls%3A+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152(2017).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+growth+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li>
<li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li>
<li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li>
<li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscience+and+Nanometrology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li>
<li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+%28SNAP%29+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

식물의 모양의 출현은 주로 시간과 공간 동안 성장의 조정 속도와 방향에 의해 결정된다. 식물 세포는 다사카리딕 매트릭스로 만들어진 단단한 세포벽에 싸여 있으며, 이 세포는 이를 함께 붙입니다. 그 결과, 세포 확장은 세포벽에 당기는 터거 압력과 이 압력에 저항하는 세포벽의 강성 사이의 평형에 의해 제어된다. 근본적인 발달메커니즘을 이해하기 위해서는 주어진 장기의 다른 조직 또는 세포에서 세포벽 기계적 특성뿐만 아니라 터고 압력을 모두 측정할 수 있어야 합니다. 이 백서에서 설명한 것처럼 AFM은 이 컨텍스트에서 선택하는 방법입니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 탈수증을 피하기에 충분히 빨리해야 조직 준비입니다. 이는 특히 터거 압력을 측정하려는 경우 매우 중요할 수 있습니다. 매우 중요한 것은 시료를 기판에 정확하게 고정시키는 것입니다: 불안정한 샘플은 광학적으로 쉽게 감지할 수 있는 거시적 움직임, 또는 힘 곡선의 강한 변형과 같은 매우 명백한 효과...

원자력 현미경 검사법 (AFM)은 일반적으로 몇 나노미터의 반경을 가진 끝이 견본의 표면을 검사하는 스캐닝 프로브 현미경 검사법 (SPM) 가족에 속합니다. 표면의 검출은 광학 또는 전자 기반 방법을 통해 달성되지 않고 팁과 샘플 표면 사이의 상호 작용 힘을 통해 달성됩니다. 따라서, 이 기술은 샘플 표면의 지형 특성화(몇 나노미터까지 내려갈 수 있는 3D 분해능)에 국한되지 않고 정전기, 반데르발스 또는 접촉력과 같은 모든 유형의 상호 작용 력을 측정할 수 있다. 또한, 팁은 생물학적 샘플의 표면에 힘을 가하고 기계적 특성 (예를 들어, 영의 계수, 점탄성 특성)을 결정하기 위해 생성 된 변형, 소위 "들여 쓰기"를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
식물 세포벽의 기계적 성질은 발달 과정 1,2,3의기본 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 할 필수적입니다. 실제로, 이러한 특성은 세포가 성장할 수 있도록 세포벽 연화가 필요하기 때문에 특히 발달 중에 엄격하게 조절된다. AFM은 이러한 특성을 측정하고 장기, 조직 또는 발달 단계 간에 변화하는 방식을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 백서에서는 AFM을 사용하여 세포벽 기계적 특성과 터거 압력을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 2개의 응용은 2개의 다른 AFM 현미경에 설명되고 후에 여기에서 상세합니다.

<table><tbody><tr><td><강>성장 배지</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000x 비마틴 원료 용액</td><td></td><td></td><td>은 ACM을 만드는 데 사용됨, 조성은 Stanislas et al., 2017 참조. 오토클레이브 후 붓기 전에 ACM에 추가하십시오.</td></tr><tr><td>1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)</td> <td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>132-66-1</td>은 <td>애기장대 매체에 첨가하며, 10 &mu;M. 붓기 전에 오토클레이브 후 첨가합니다.</td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>9002-18-0</td>은 <td>애기장대 매체에 1% w/v.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Merck Millipore</td><td>9012-36-6</td>은 <td>고체 ACM, 0.8 % w / v를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>애기장대 배지</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>DU0742.0025</td><td>체외 애기장대 배양용, 11.82g/L.</td></tr><tr><td>질산칼슘 사수화물</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>13477-34-4</td>는 <td>애기장대 배지에 2mM를 추가합니다.</td></tr><tr><td>무라시게 & SKOOG MEDIUM</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>M0221.0025</td><td>ACM, 2.2 g / L를 만드는 데 사용되는 기저 염 혼합물.</td></tr><tr><td>N6-벤질아데닌(BAP)</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>1214-39-7</td>은 <td>ACM, 555nM을 만드는 데 사용됩니다. 오토클레이브 후 붓기 전에 ACM에 추가하십시오.</td></tr><tr><td>Oryzalin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>19044-88-3</td><td>오리잘린 치료, 10 &mu; g/mL입니다.</td></tr><tr><td>식물 보존 혼합물 (PPM)</td><td>ACM, 0.1 % v / v를 만드는 데 사용되는 식물 세포 기술. 붓기 전에 오토 클레이브 후 ACM에 첨가하십시오.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼륨</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>1310-58-3</td>은 <td>애기장대 배지 및 ACM, 둘 다 pH 5.8을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>57-50-1</td>은 <td>ACM, 1% w/v를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>AFM용 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioScope Catalyst BioAFM</td><td>Bruker</td><td></td><td>이 프로토콜에서 터거 압력 측정에 사용되는 AFM입니다.</td></tr><tr><td>Nanowizard III + CellHesion</td><td>JPK (Bruker)</td><td></td><td>기계적 특성을 측정하는 데 사용되는 AFM입니다.</td></tr><tr><td>Patafix</td><td>UHU</td><td>D1620</td><td></td></tr><tr><td>참조 탄성 구조</td><td>NanoIdea</td><td>2Z00026</td><td></td></tr><tr><td>Reprorubber-Thin Pour</td><td>Flexbar</td><td>16135</td><td>생체 적합성 접착제.</td></tr><tr><td>구형 AFM 팁</td><td>Nanoandmore</td><td>SD-SPHERE-NCH-S-10</td><td>기계적 특성 측정에 사용되는 팁.</td></tr></tbody></table>

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

우리는 여기에 식물 조직을 들여 쓰기 위해 원자력 현미경 검사법의 사용을 제시하고 기계적 특성을 회복합니다. 들여쓰기 모드에서 두 개의 서로 다른 현미경을 사용하여 탄성 계수체를 측정하고 이를 사용하여 세포벽 기계적 특성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 또한 turgor 압력을 평가하는 방법도 설명합니다. 원자력 현미경 검사법의 주요 장점은 비 침습적이고 상대적으로 빠르며 (5 ~ 20 분), 피상적으로 평평한 거의 모든 유형의 살아있는 식물 조직이 치료없이 분석 될 수 있다는 것입니다. 팁 크기와 단위 면적당 측정 횟수에 따라 해상도가 매우 좋을 수 있습니다. 이 방법의 한 가지 제한은 표면 세포 층에 직접 액세스 할 수 있다는 것입니다.

그림 1A 및 그림 1B는 QI 맵을 획득할 위치를 찾는 데 사용되는 프로토콜의 1.3.4 ~ 1.3.6 단계의 결과를 보여주는 스크린샷을 보여 준다. 관심 영역이 기울어진 표면 (즉, 가능한 한 평평하지 않도록)에 선택되었음을 언급 할 가치가 있습니다. 사실, Routier 등 5에의해 발견 된 바와 같이, 들여 쓰기 축이 표면에 수직이 아닌 경우, 측정 영의 계수는 과소 평가 될 수있다. 이 효과는 그림1의 C 또는 D 패널의 오른쪽 위 모서리에 표시되며, 여기서 셀 테두리의 일부가 셀의 나머지 부분보다 부드러워 보입니다. 이 효과에 의해 유도된 아티팩트는 국소 기울기 각도가 50 x 50 μm2 스캔 영역을 통해 40°를 쉽게 극복할 수 있는 메...

여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

식물 세포의 기계적 특성은 근본적인 개발 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 합니다. 원자력 현미경 검사는 이러한 특성을 측정하는 데 사용할 수 있으며 장기, 조직, 모든 발달 단계 사이에서 변화하는 방식을 따를 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은, 침습적이지 않으며, 상대적으로 빠르며, 살아있는 샘플에 직접 적용 될 수 있도록 치료가 필요하지 않다는 것입니다.이 절차에 익숙하지 않은 사람의 경우 샘플의 시스 섹션은 매우 중요하므로 샘플의 적절한 기계적 고정이 있는지 확인하십시오. 이 절차의 시각적 데모는 샘플 고정, 육성 및 측정 설정의 품질 관리의 복잡성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 시몬 보비오, 엔지니어와 유첸 롱, 내 실험실에서 게시물 문서입니다.먼저 양면 테이프 를 직경 5센티미터의 페트리 접시 중앙에 놓습니다. 꽃봉오리에서 테이프에 분리된 창세기 샘플을 추가합니다. 탈수를 피하기 위해 시료가 완전히 덮일 때까지 접시에 물을 빠르게 넣습니다.그런 다음 샘플을 AFM 단계에 배치하고 샘플을 통해 머리를 움직입니다. 캔틸레버를 보정한 후 소프트웨어에서 시스템이 QI 모드에 있는지 확인하고 15나노 뉴턴의 세트 포인트 힘으로 시료에 접근한다. 다음으로, 4개의 미크론의 Z 길이를 설정하고 40으로 설정된 픽셀 수와 함께 80미크론으로 스캔 영역을 80마이크로너로 설정합니다.그런 다음 고급 이미징 설정 패널로 이동하여 모드를 일정한 속도로 설정합니다. 또한, 세트는 초당 200미크론으로 트랙 속도를 입력하고, 샘플 속도는 25킬로 헤르츠로 확장한다. 매개 변수가 설정되면 팁을 샘플의 관심 영역으로 이동합니다.스캔할 영역이 파편이 없는지 확인하고, 가능한 한 평평한 영역을 찾고, 참여를 유도한 다음 스캔을 시작하고 빠른 저력 스캔을 사용하여 샘플이 이동하는지 확인합니다. 관심 영역이 있는 대로 되면 60 마이크론 제곱에 의해 40~60인 영역을 선택하고 픽셀 수를 미크로네당 2픽셀로 늘립니다. 다음으로, 100 나노 나노 뉴턴으로 설정 점을 증가시키고, 백에서 200 나노 미터의 들여쓰기를 얻는다.Z 길이를 2개의 미크론으로 줄이고, 연장은 초당 100미크론으로 요로 속도를 입력한 다음 샘플 속도를 50킬로헤르츠로 증가시키고 시료 를 스캔하기 시작합니다. 완료되면 출력을 이미지와 데이터 파일로 저장합니다. 데이터 처리 소프트웨어를 열고 데이터 파일을 로드합니다.맵의 모든 곡선에서 동일한 매개 변수를 사용하기 위해 배치 처리 버튼에 대해 이 맵 사용을 클릭한 다음 미리 정의된 프로세스를 로드하고 hertz 맞춤을 선택합니다. 다음으로, 전환 가능한 베이스 라인 작업으로 이동하여 빼기를 설정하여 오프셋 플러스 기울기를 설정하고 40~60% 사이의 X min을 설정합니다. 수직 팁 위치 탭에서 원시 데이터 작업을 원하는 경우 매끄러운 타이트에서 선택합니다.적절한 맞춤 모델을 선택하려면 탄력 맞춤 탭으로 이동하여 예상 접착 강도에 따라 옵션 중 하나를 선택합니다. 유착력이 없거나 약한 경우 접근 곡선을 사용하고 hertz isnader 모델을 사용하는 것을 선호합니다. 강한 접착의 경우, Dergen Milia Dortoprov 또는 DMD의 모델을 사용하고 지체 곡선에서 작동합니다.이제 명목 팁 셰이프를 기반으로 팁 기하학적 매개변수를 설정합니다. 이 실험에 사용된 팁은 400 나노 미터의 반경과 구형 팁입니다. 다음으로 푸아송 비율을 0.5로 설정하고 시프트 커브를 선택합니다.주 창에서 아이콘을 클릭하여 두 번째 탄력 성 적합 루틴을 추가하고 동일한 매개 변수 설정을 반복합니다. 마지막으로 원하는 들여쓰기를 X min으로 지정한 다음 맵의 모든 곡선에서 이전 단계를 반복하기 위해 모든 단계에 보관하고 적용합니다. 결과를 저장하여 도트 tsv 파일에 이미지를 가져옵니다.신속한 용액 변화로 측정하려면 작은 접착제 매스틱 조각을 들고 페트리 접시에 샘플을 장착합니다. 재빨리 매스틱과 샘플 베이스 사이의 간격을 생체 적합성 접착제로 밀봉합니다. 접착제가 0.1%의 식물 보존 혼합물을 함유한 액체 정점 배양 배지에 샘플을 응고한 다음 침수할 때까지 기다립니다.시스템을 보정한 후 인수 소프트웨어를 열고 먼저 검사 매개 변수 창으로 이동합니다. 캔틸레버의 제조된 스프링 상수 또는 결정된 스프링 상수에 스프링 상수를 설정합니다. 다음으로, 팁 반경을 400나노 미터로 설정하고, 샘플 푸아송 비율을 0.5로 설정하고, 샘플 라인은 백스물8로 빠른 습득을 보장하고, 스캔 속도를 0.2 헤르츠로, 스캔 크기를 1미크론으로 설정한다.그런 다음 경사로 창으로 이동하여 램프 크기를 5미크론으로 설정하고, 삼각형 임계값을 최대로 설정하고, 샘플 수를 4,000,8개로 설정합니다. 모든 매개 변수를 설정하면 신중하게 샘플에 수동으로 접근하십시오. 프로브가 샘플 표면에 상대적으로 가까우면 접근 방식을 클릭합니다.접촉시, 점차적으로 스캔 크기를 증가시키고 시료 또는 팁을 손상시키지 않고 원하는 균형에 도달 할 때까지 스캔 속도를 수정합니다. 측정 영역이 원하는 대로 되지 않으면 스캔을 재배치합니다. 만족하면 버튼을 클릭하고 가리키고 촬영하여 지점을 시작하고 창을 촬영합니다.저장 디렉터리 및 파일 이름을 지정합니다. 그런 다음 다음 스캔에서 경사로를 클릭하여 녹음을 시작합니다. 스캔이 완료되면 소프트웨어 인터페이스가 램프 창으로 리디렉션됩니다.스캔한 이미지를 클릭하여 들여쓰기 위치를 지정합니다. 베리 센터 근처의 셀당 3개 이상의 들여쓰기 시야를 선택하고, 한 번에 세 번 들여쓰기를 반복한 다음 경사로를 클릭하고 캡처합니다. 분석 소프트웨어에서 도트 MCA 파일을 열어 스캔한 이미지의 각 힘 곡선의 위치를 보여 주습니다.그런 다음 분석할 한 힘 곡선을 엽니다. 기본 선 보정 버튼을 클릭하고 소스 베이스 라인 시작을 확장하고 소스 베이스 라인 정지를 확장하거나 각각 0%와 80%로 확장할 때까지 힘 곡선의 파란색 대시 선을 드래그합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.다음 상자 자동차 필터 버튼을 클릭하고 힘 곡선을 부드럽게 실행합니다. 그런 다음 들여쓰기 버튼을 클릭합니다. 입력 창에서, 확장할 활성 곡선, 다섯 번째 방법을 선형화된 모델로 설정하고, 최대 힘 적합 경계는 99%, 최소 힘 은 경계에 75%, 강성에 맞는 모델을 설정합니다.일괄 처리에서 힘 곡선을 분석합니다. 이렇게 하려면 실행 기록 단추를 클릭하고 보고서 디렉터리지정을 지정하고 동일한 처리가 필요한 다른 힘 곡선을 추가합니다. 완료되면 실행을 클릭합니다.K값이 일괄 처리에 맞는 경우 기록을 클릭하고 5개의 들여쓰기로 이동하여 들여쓰기 창으로 돌아갑니다. 일단 최대 힘 피팅 경계를 10%로 변경하고 최소 힘은 경계에 1%로 맞습니다. 그런 다음 핏 모델을 헤르치안으로 설정합니다.다음으로 적절한 파일을 열어 다른 스캔된 채널을 표시합니다. 채널이 높은 창에서 단면 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 터고 압력 공제에 필요한 샘플 표면 곡률을 측정할 수 있습니다.그런 다음 한 셀의 긴 축을 가로질러 선을 그리고 대시 선 경계를 셀 가장자리로 이동하고 반지름 값을 기록합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜을 따라, 각 셀에 대한 평균 젊은의 변조기, 스프링 상수, E, K 및 터고 압력을 계산합니다. 왼쪽의 이미지는 오른쪽 의 이미지가 들여쓰기의 첫 번째 백 나노 미터의 분석의 결과를 표시하는 동안 사용자 정의 힘 설정 점까지 전체 들여쓰기를 분석하여 얻은 젊은의 계수의지도입니다.여기서 두 맵은 매우 유사해 보이지만, 들여쓰기 깊이의 변화는 시료 이질성을 더 잘 강조표시하도록 유도할 수 있으며, 이는 위치를 식별하거나 내부 구조의 동작에 대한 정보를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 맵의 각 점에 대해 기본 힘 곡선이 있습니다. 여기에 표시된 곡선에는 언급 할 가치가있는 두 가지 효과가 있습니다.우선, 힘 곡선의 접근 부분이 500 나노 뉴턴에서 끝나는 경우. 하향 팁 움직임은 계속 진행됩니다. 팁에 의해 적용된 최종 힘이 예상보다 높다는 것을 의미합니다.두 번째 눈에 띄는 것은 타원에 의해 강조된 개폐 곡선의 파도입니다. 이러한 흔들림은 팁의 동작하에서 시료이동 또는 진동의 지표가 될 수 있으며 다른 고정 방법으로 전환하는 것이 필요할 수 있다. 이 문서에 설명된 절차를 사용하여 세포벽 두께를 제외한 터고 압력 공제에 대한 모든 주요 매개 변수는 AFM 스캔 및 들여쓰기에서 검색할 수 있습니다.적색 교차 위치에서 깊은 들여쓰기의 힘 곡선은 곡선의 다른 정권에 세포 벽 젊은의 계수와 샘플의 명백한 강성을 설명합니다. 샘플 고정은 매우 중요합니다. 측정 과정에서 시료 불안정의 징후에 주의를 기울이는 다.수직 들여쓰기를 보장하기 위해 평평한 표면이 있는 영역을 신중하게 선택합니다. 이 절차에 따라 시간이 지남에 따라 기계적 특성과 다른 조건을 모니터링할 수 있습니다. 또한 상관 관계 연구를 위해 공초점 이미지와 기계적 측정을 오버레이할 수도 있습니다.이 기술은 생체 역학을 생리학 개발 및 기타 생물학적 과정과 연결하는 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

원자력 현미경(AFM)을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 방법을 설명합니다. 우리는 식물 발달 중 세포벽에서 발생하는 기계적 변화를 광시야 중간 규모로 기록하여 이러한 변화가 성장 및 형태 형성과 상관 관계가 있을 수 있도록 하는 방법에 중점을 둡니다.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.

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식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

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