식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

식물 세포의 기계적 특성은 근본적인 개발 메커니즘을 이해하려고 할 때 고려해야 합니다. 원자력 현미경 검사는 이러한 특성을 측정하는 데 사용할 수 있으며 장기, 조직, 모든 발달 단계 사이에서 변화하는 방식을 따를 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은, 침습적이지 않으며, 상대적으로 빠르며, 살아있는 샘플에 직접 적용 될 수 있도록 치료가 필요하지 않다는 것입니다.

이 절차에 익숙하지 않은 사람의 경우 샘플의 시스 섹션은 매우 중요하므로 샘플의 적절한 기계적 고정이 있는지 확인하십시오. 이 절차의 시각적 데모는 샘플 고정, 육성 및 측정 설정의 품질 관리의 복잡성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 시몬 보비오, 엔지니어와 유첸 롱, 내 실험실에서 게시물 문서입니다.

먼저 양면 테이프 를 직경 5센티미터의 페트리 접시 중앙에 놓습니다. 꽃봉오리에서 테이프에 분리된 창세기 샘플을 추가합니다. 탈수를 피하기 위해 시료가 완전히 덮일 때까지 접시에 물을 빠르게 넣습니다.

그런 다음 샘플을 AFM 단계에 배치하고 샘플을 통해 머리를 움직입니다. 캔틸레버를 보정한 후 소프트웨어에서 시스템이 QI 모드에 있는지 확인하고 15나노 뉴턴의 세트 포인트 힘으로 시료에 접근한다. 다음으로, 4개의 미크론의 Z 길이를 설정하고 40으로 설정된 픽셀 수와 함께 80미크론으로 스캔 영역을 80마이크로너로 설정합니다.

그런 다음 고급 이미징 설정 패널로 이동하여 모드를 일정한 속도로 설정합니다. 또한, 세트는 초당 200미크론으로 트랙 속도를 입력하고, 샘플 속도는 25킬로 헤르츠로 확장한다. 매개 변수가 설정되면 팁을 샘플의 관심 영역으로 이동합니다.

스캔할 영역이 파편이 없는지 확인하고, 가능한 한 평평한 영역을 찾고, 참여를 유도한 다음 스캔을 시작하고 빠른 저력 스캔을 사용하여 샘플이 이동하는지 확인합니다. 관심 영역이 있는 대로 되면 60 마이크론 제곱에 의해 40~60인 영역을 선택하고 픽셀 수를 미크로네당 2픽셀로 늘립니다. 다음으로, 100 나노 나노 뉴턴으로 설정 점을 증가시키고, 백에서 200 나노 미터의 들여쓰기를 얻는다.

Z 길이를 2개의 미크론으로 줄이고, 연장은 초당 100미크론으로 요로 속도를 입력한 다음 샘플 속도를 50킬로헤르츠로 증가시키고 시료 를 스캔하기 시작합니다. 완료되면 출력을 이미지와 데이터 파일로 저장합니다. 데이터 처리 소프트웨어를 열고 데이터 파일을 로드합니다.

맵의 모든 곡선에서 동일한 매개 변수를 사용하기 위해 배치 처리 버튼에 대해 이 맵 사용을 클릭한 다음 미리 정의된 프로세스를 로드하고 hertz 맞춤을 선택합니다. 다음으로, 전환 가능한 베이스 라인 작업으로 이동하여 빼기를 설정하여 오프셋 플러스 기울기를 설정하고 40~60% 사이의 X min을 설정합니다. 수직 팁 위치 탭에서 원시 데이터 작업을 원하는 경우 매끄러운 타이트에서 선택합니다.

적절한 맞춤 모델을 선택하려면 탄력 맞춤 탭으로 이동하여 예상 접착 강도에 따라 옵션 중 하나를 선택합니다. 유착력이 없거나 약한 경우 접근 곡선을 사용하고 hertz isnader 모델을 사용하는 것을 선호합니다. 강한 접착의 경우, Dergen Milia Dortoprov 또는 DMD의 모델을 사용하고 지체 곡선에서 작동합니다.

이제 명목 팁 셰이프를 기반으로 팁 기하학적 매개변수를 설정합니다. 이 실험에 사용된 팁은 400 나노 미터의 반경과 구형 팁입니다. 다음으로 푸아송 비율을 0.5로 설정하고 시프트 커브를 선택합니다.

주 창에서 아이콘을 클릭하여 두 번째 탄력 성 적합 루틴을 추가하고 동일한 매개 변수 설정을 반복합니다. 마지막으로 원하는 들여쓰기를 X min으로 지정한 다음 맵의 모든 곡선에서 이전 단계를 반복하기 위해 모든 단계에 보관하고 적용합니다. 결과를 저장하여 도트 tsv 파일에 이미지를 가져옵니다.

신속한 용액 변화로 측정하려면 작은 접착제 매스틱 조각을 들고 페트리 접시에 샘플을 장착합니다. 재빨리 매스틱과 샘플 베이스 사이의 간격을 생체 적합성 접착제로 밀봉합니다. 접착제가 0.1%의 식물 보존 혼합물을 함유한 액체 정점 배양 배지에 샘플을 응고한 다음 침수할 때까지 기다립니다.

시스템을 보정한 후 인수 소프트웨어를 열고 먼저 검사 매개 변수 창으로 이동합니다. 캔틸레버의 제조된 스프링 상수 또는 결정된 스프링 상수에 스프링 상수를 설정합니다. 다음으로, 팁 반경을 400나노 미터로 설정하고, 샘플 푸아송 비율을 0.5로 설정하고, 샘플 라인은 백스물8로 빠른 습득을 보장하고, 스캔 속도를 0.2 헤르츠로, 스캔 크기를 1미크론으로 설정한다.

그런 다음 경사로 창으로 이동하여 램프 크기를 5미크론으로 설정하고, 삼각형 임계값을 최대로 설정하고, 샘플 수를 4,000,8개로 설정합니다. 모든 매개 변수를 설정하면 신중하게 샘플에 수동으로 접근하십시오. 프로브가 샘플 표면에 상대적으로 가까우면 접근 방식을 클릭합니다.

접촉시, 점차적으로 스캔 크기를 증가시키고 시료 또는 팁을 손상시키지 않고 원하는 균형에 도달 할 때까지 스캔 속도를 수정합니다. 측정 영역이 원하는 대로 되지 않으면 스캔을 재배치합니다. 만족하면 버튼을 클릭하고 가리키고 촬영하여 지점을 시작하고 창을 촬영합니다.

저장 디렉터리 및 파일 이름을 지정합니다. 그런 다음 다음 스캔에서 경사로를 클릭하여 녹음을 시작합니다. 스캔이 완료되면 소프트웨어 인터페이스가 램프 창으로 리디렉션됩니다.

스캔한 이미지를 클릭하여 들여쓰기 위치를 지정합니다. 베리 센터 근처의 셀당 3개 이상의 들여쓰기 시야를 선택하고, 한 번에 세 번 들여쓰기를 반복한 다음 경사로를 클릭하고 캡처합니다. 분석 소프트웨어에서 도트 MCA 파일을 열어 스캔한 이미지의 각 힘 곡선의 위치를 보여 주습니다.

그런 다음 분석할 한 힘 곡선을 엽니다. 기본 선 보정 버튼을 클릭하고 소스 베이스 라인 시작을 확장하고 소스 베이스 라인 정지를 확장하거나 각각 0%와 80%로 확장할 때까지 힘 곡선의 파란색 대시 선을 드래그합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.

다음 상자 자동차 필터 버튼을 클릭하고 힘 곡선을 부드럽게 실행합니다. 그런 다음 들여쓰기 버튼을 클릭합니다. 입력 창에서, 확장할 활성 곡선, 다섯 번째 방법을 선형화된 모델로 설정하고, 최대 힘 적합 경계는 99%, 최소 힘 은 경계에 75%, 강성에 맞는 모델을 설정합니다.

일괄 처리에서 힘 곡선을 분석합니다. 이렇게 하려면 실행 기록 단추를 클릭하고 보고서 디렉터리지정을 지정하고 동일한 처리가 필요한 다른 힘 곡선을 추가합니다. 완료되면 실행을 클릭합니다.

K값이 일괄 처리에 맞는 경우 기록을 클릭하고 5개의 들여쓰기로 이동하여 들여쓰기 창으로 돌아갑니다. 일단 최대 힘 피팅 경계를 10%로 변경하고 최소 힘은 경계에 1%로 맞습니다. 그런 다음 핏 모델을 헤르치안으로 설정합니다.

다음으로 적절한 파일을 열어 다른 스캔된 채널을 표시합니다. 채널이 높은 창에서 단면 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 터고 압력 공제에 필요한 샘플 표면 곡률을 측정할 수 있습니다.

그런 다음 한 셀의 긴 축을 가로질러 선을 그리고 대시 선 경계를 셀 가장자리로 이동하고 반지름 값을 기록합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜을 따라, 각 셀에 대한 평균 젊은의 변조기, 스프링 상수, E, K 및 터고 압력을 계산합니다. 왼쪽의 이미지는 오른쪽 의 이미지가 들여쓰기의 첫 번째 백 나노 미터의 분석의 결과를 표시하는 동안 사용자 정의 힘 설정 점까지 전체 들여쓰기를 분석하여 얻은 젊은의 계수의지도입니다.

여기서 두 맵은 매우 유사해 보이지만, 들여쓰기 깊이의 변화는 시료 이질성을 더 잘 강조표시하도록 유도할 수 있으며, 이는 위치를 식별하거나 내부 구조의 동작에 대한 정보를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 맵의 각 점에 대해 기본 힘 곡선이 있습니다. 여기에 표시된 곡선에는 언급 할 가치가있는 두 가지 효과가 있습니다.

우선, 힘 곡선의 접근 부분이 500 나노 뉴턴에서 끝나는 경우. 하향 팁 움직임은 계속 진행됩니다. 팁에 의해 적용된 최종 힘이 예상보다 높다는 것을 의미합니다.

두 번째 눈에 띄는 것은 타원에 의해 강조된 개폐 곡선의 파도입니다. 이러한 흔들림은 팁의 동작하에서 시료이동 또는 진동의 지표가 될 수 있으며 다른 고정 방법으로 전환하는 것이 필요할 수 있다. 이 문서에 설명된 절차를 사용하여 세포벽 두께를 제외한 터고 압력 공제에 대한 모든 주요 매개 변수는 AFM 스캔 및 들여쓰기에서 검색할 수 있습니다.

적색 교차 위치에서 깊은 들여쓰기의 힘 곡선은 곡선의 다른 정권에 세포 벽 젊은의 계수와 샘플의 명백한 강성을 설명합니다. 샘플 고정은 매우 중요합니다. 측정 과정에서 시료 불안정의 징후에 주의를 기울이는 다.

수직 들여쓰기를 보장하기 위해 평평한 표면이 있는 영역을 신중하게 선택합니다. 이 절차에 따라 시간이 지남에 따라 기계적 특성과 다른 조건을 모니터링할 수 있습니다. 또한 상관 관계 연구를 위해 공초점 이미지와 기계적 측정을 오버레이할 수도 있습니다.

이 기술은 생체 역학을 생리학 개발 및 기타 생물학적 과정과 연결하는 길을 열어줍니다.