Name: 대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 배우세요 대류 강화 전달(CED)을 이용하여 뮤린 뇌로 항체를 효과적으로 전달하는 방법을. 혈뇌장벽을 우회하고 조직 손상을 최소화하며, 뇌 질환 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 취리히 대학의 보조금에 의해 지원되었다 (FK-15-057), 의료 생물학 연구를위한 노바티스 재단 (16C231) 스위스 암 연구 (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) 요하네스 보름 버그와 다리 증거 (개념의 20B1 _177300) - 린다 셸해머.

여기에 설명된 모든 방법은 스위스 주 수의학 사무소의 라이센스 번호 ZH246/15에 따라 승인되었습니다.
1. 스텝 카테터 의 준비
<ol><li>카테터의 단계에 대한 융합 실리카 튜브의 제조
	<ol>
<li>융합된 실리카 모세관을 내경 0.1mm, 벽 두께 0.0325mm의 두께로 30mm 길이로 자른다.</li>
		<li>튜브 개구부가 매끄러운 표면을 가지고 있는지 확인하기 위해 마이크로 포지를 사용하여 끝을 균열 및 열 연마 튜브를 검사합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>금속 바늘에 내부 튜브의 고정
	<ol>
<li>10 μL 주사기에 27 G 바늘을 장착하고 주사기를 입체 로봇에 놓습니다.</li>
		<li>로봇을 사용하여 주사기를 단단한 표면 위로 이동하고 바늘 끝으로 만지다. 이 위치는 카테터 단계의 길이를 설정하기위한 참조 표면 역할을하기 때문에 소프트웨어에 주목하거나 저장해야합니다.</li>
		<li>바늘 내부에 융합 실리카 모세관의 배치를 가능하게하기 위해 바늘을 상승</li>
		<li>융합된 실리카 모세관을 바늘에서 20mm의 모세관이 돌출되도록 바늘에 놓습니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여, 도2에 도시된 바와 같이, 금속 바늘로부터 시작하여 모세관의 하부 말단 위로 10 mm를 마무리하여 모세관 위에 고점도 시아노아크릴레이트 접착제의 2 μL을 고르게 퍼낸다.</li>
		<li>입체 로봇을 사용하여 금속 바늘의 끝이 기준 표면 위에 1mm가 될 때까지 바늘을 낮춥시됩니다. 이렇게 융합된 실리카 모세관은 금속 바늘에 고정되고 금속 바늘의 끝에서 1mm 단계를 형성할 것이다. 금속 바늘 끝에 형성되는 접착제의 과잉을 제거하여 단계를 무디게하지 않도록하십시오.</li>
		<li>접착제가 굳어지고 스테레오틱 로봇에서 카테터로 주사기를 제거할 때까지 15분 기다립니다. 단계에서 현미경으로 카테터의 끝을 확인하여 모든 여분의 접착제가 제거되었는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아가로오스 블록을 사용하여 스텝 카테터 테스트
	<ol>
<li>종래의 겔 트레이에 PBS로 0.6% 아가로즈 용액을 준비하고 중합될 때까지 기다립니다. 아가로즈를 약 20mm x 20mm 블록으로 자른다. 사용할 때까지 블록을 PBS에 담그십시오.</li>
		<li>스텝 카테터 주사기를 여과된 트라이판 블루의 0.4% 용액 10 μL로 수동으로 채웁니다.</li>
		<li>입체 로봇을 사용하여 고정 절차 중에 카테터 의 단계의 밀봉을 평가하기 위해 0.2 μL / min에서 1 μL을 분배하십시오. 트라이판 블루 용액은 카테터의 끝에서만 볼 수 있어야합니다. 종이 티슈로 닦아냅니다.</li>
		<li>입체 로봇에 아가로즈 블록을 놓고 카테터의 끝이 아가로즈 블록의 표면에 대해 참조되도록 로봇을 보정합니다.</li>
		<li>CED에 대한 사출 매개변수를 프로그래밍합니다.<ol>
<li>5 μL의 주입 량의 경우, 다음 단계를 사용하십시오: 0.2 μL/min에서 1 μL, 0.5 μL/min에서 2 μL, 0.8 μL/min에서 2 μL. 각 단계의 지속 시간을 비례적으로 변경하여 특정 실험 계획에 따라 최종 주입 량을 조정합니다.</li>
			<li>무린 카우데이트 푸타멘 (striatum)에 용액을 주입하기 위해, 3.5 mm의 깊이에서 브레그마에서 위치 1mm 정면 및 1.5-2 mm 측면에서 이러한 주입을 수행합니다.</li>
			<li>주입 후 카테터를 2 분 동안 제자리에 둔 다음 1mm / min에서 후퇴하여 뇌의 유체분산과 카테터 제거 시 주입 관의 밀봉을 보장하십시오. 참고: 사용되는 특정 입체 로봇에 따라 모든 매개 변수를 단일 스크립트로 프로그래밍할 수 있습니다. 예제 스크립트는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59675/CED_5_ul_striatum.txt" target="_blank">보조</a>자료로 사용할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>CED 절차를 시작하고 아가로즈 블록에 트라이판 블루 용액 5 μL을 주입합니다.</li>
		<li>아가로스에서 트라이판 블루의 구름 의 모양과 카테터 관을 따라 잠재적 인 누설을 평가합니다. 트립판 블루는 카테터 팁 주위의 중심과 적어도 1mm의 직경과 타원형 또는 둥근 구름을 형성한다. 금속 바늘 의 끝을 통해 주요 역류가 볼 수 없습니다.</li>
		<li>새로운 아가로즈 블록을 놓고 아가로스와 카테터의 막힘을 평가하기 위해 0.2 μL / min에서 1 μL의 두 번째 주입을 시작합니다. 트립판 블루는 다시 주입의 시작 직후 카테터의 끝에서 구름을 형성하기 시작한다.</li>
		<li>주사기내의 남은 부피가 3 μL에 해당하는지 평가한다. 모든 변형은 카테터 장착 또는 주사기 플런저를 통해 유체누출을 가리킬 수 있습니다.</li>
		<li>모든 테스트 주사가 성공하면 카테터가 잘 밀봉되고 직선이며 트라이판 블루 용액이 카테터 팁이 아닌 다른 지점에서 관찰되지 않고 탈이온 H2O (dH2O)로 카테터를 씻어 트라이판 블루의 흔적이 보이지 않습니다. 이어서 10회 세척한 후 70% 에탄올과 100% 에탄올을 세척한 다음 70% 에탄올로 다시 세척하고 깨끗한 탈이온수를 세척합니다.</li>
		<li>카테터를 건조한 조건에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 뮤린 뇌에 항체 용액의 대류 강화 전달
참고: 지역 동물 복지 규정에 따라 다양한 유형의 마취제, 진통제 및 항생제가이 절차를 위해 시행 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 주사 마취의 사용을 설명합니다. 이소플루란과 같은 흡입 마취제는 또한 입체 프레임에 코 마스크를 장착하여 사용할 수 있습니다. 또한 감염 예방을 위해 식수에 항생제를 추가하는 것이 좋습니다.
<ol><li>수술 설정
	<ol>
<li>마취제 및 해독제를 준비하십시오. 마우스는 펜타닐 (0.05 mg/kg), 미다졸람 (5 mg /kg) 및 메데토미딘 (0.5 mg /kg)을 함유 한 3 성분 마취를 사용하여 멸균 dH2O로 안전하게 마취 할 수 있습니다. 우리는 멸균 dH2O (첫 번째 해독제 용액)에서 플루마제닐 (0.5 mg / kg)과 부프레 노르핀 (0.1 mg / kg)을 함유 한 두 가지 해독제 용액을 사용하여 2 단계 웨이크 업 절차를 수행합니다. 두 번째 는 멸균 dH2O (두 번째 해독제 용액)에 아티파메졸 (2.5 mg / kg)을 함유하고 있습니다.</li>
		<li>멸균 dH2O로 희석 된 카프로펜 (5.667 mg / kg)을 함유 한 진통 용액을 준비하십시오.</li>
		<li>입체 프레임, 난방 패드 및 입체 로봇의 요소를 청소합니다. 로봇의 모든 부품을 손상 위험 없이 청소할 수 있는 것은 아닙니다. 청소 및 사용 준비에 대한 자세한 내용은 로봇 매뉴얼을 참조하십시오.</li>
		<li>스텝 카테터로 주사기를 조립하고 dH 2O,70% 에탄올 및 100% 에탄올로 여러 번 세척한 다음 70% 에탄올 및 dH2O로 다시 플러싱합니다. 마지막으로, 두개내 주사용액의 준비에 사용할 PBS 또는 다른 완충제(예: 인공 뇌척수액)로 주사기를 플러시합니다. 주사기의 플런저는 전체 절차 중에 원활하고 자유롭게 움직여야합니다.</li>
		<li>입체 적 프레임으로 입체 로봇 소프트웨어를 보정합니다.</li>
		<li>로봇 팔이 자유롭게 움직이고 사출 펌프가 제대로 연결되어 있는지 확인하여 입체 로봇 소프트웨어를 테스트하고 방해없이 CED 절차를 수행할 수 있습니다. 여기에는 로봇 이동 테스트, 램핑 주입, 2분 대기 단계 및 카테터 후퇴 속도 확인이 포함됩니다. 모든 매개 변수는 점 1.3.5에 설명된 미리 프로그래밍된 CED 절차에 맞아야 합니다.</li>
		<li>드릴에 드릴 비트를 삽입합니다. 사용하기 전에 드릴 비트를 소독하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>PBS 또는 aCSF와 같은 다른 완충 액을 사용하여 항체 용액을 준비합니다. 5 μL에서 항체의 1 ~ 20 μg는 단일 CED 절차로 주입 될 수있다. 다른 부적 및 단백질 양은 실험을 수행하기 전에 시험되어야 한다. 점도가 높은 솔루션을 사용하면 카테터 막힘이 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>희석 된 항체로 주사기를 수동으로로드하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>CED에 의한 항체 주입을 줄무늬로
	<ol>
<li>마우스를 무게와 체중에 따라 각막에 세 성분 마취 용액을 주입. 사출 시간을 기록합니다. 가열 패드로 가열된 별도의 케이지로 마우스를 옮김.</li>
		<li>마우스를 관찰하여 언제 완화가 시작되는지 확인합니다. 마우스가 움직이지 않는 즉시, 수술 중 각막이 건조해지는 것을 막기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 전체 감미는 일반적으로 3 성분 마취 용액의 주입에서 10-15 분 시작됩니다.</li>
		<li>동물의 완전한 마취를 보장하기 위해 핀치 반사 테스트를 사용하여 통증 반응을 확인하십시오.</li>
		<li>헤어 트리머를 사용하여 머리를 면도하십시오.</li>
		<li>요오드 용액에 담근 면봉으로 피부를 소독하십시오. 피부를 원을 그리며 세 번 문질러 주세요.</li>
		<li>메스를 사용하여 눈 높이에서 두개골 중간선을 따라 10mm 피부 절개를 합니다.</li>
		<li>노즈 클램프와 이어 바를 사용하여 마우스를 입체 프레임에 고정합니다. 두개골 표면이 수평으로 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 정확한 해부학 적 탐색 외에도 이것은 또한 드릴링 및 CED 절차 동안 두개골의 기울기를 피하기 위해 중요합니다.</li>
		<li>주사기가 입체 로봇에 놓습니다.</li>
		<li>드릴 비트를 참조점에서 카테터 팁과 동기화합니다. 드릴과 주사기의 위치 사이의 관계가 소프트웨어에서 정확하게 결정되므로 주사는 뇌의 원하는 해부학 적 영역에서 수행 될 수 있습니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 피부를 철회하고 두개골 표면에 bregma를 지역화하십시오.</li>
		<li>드릴 비트의 팁을 사용하여 소프트웨어의 bregma를 참조합니다.</li>
		<li>드릴을 브레그마에서 1mm 정면 및 측면 2mm 위치로 이동하고 버 구멍을 뚫습니다. 경막이 손상되지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>버 구멍 위로 주사기를 이동합니다.</li>
		<li>주사기에서 0.5-1 μL을 분배하여 카테터에 기포가 남지 않도록 합니다.</li>
		<li>포인트 1.3.5에 설명된 CED 프로그램을 시작합니다. 주사 지점에서 유체 역류의 흔적이 있는지 두개골 표면을 관찰하십시오. 동물의 호흡 속도를 모니터링합니다.</li>
		<li>CED 프로그램이 끝나면 카테터가 뇌에서 철회되면 CED 동안 카테터 막힘이 있는지 확인하기 위해 0.2 μL /min에서 주입 펌프를 시작합니다. 막힘이 발생하지 않으면 카테터 팁에서 나오는 주사 믹스 방울이 즉시 표시됩니다.</li>
		<li>카테터를 재사용하거나 보관하기 전에 카테터 단계를 육안으로 검사하여 현미경으로 손상또는 마모의 징후를 검사하고 1.3.10 단계에서와 같이 청소하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>시술을 깨우기
	<ol>
<li>입체 프레임에서 마우스를 부드럽게 제거합니다.</li>
		<li>멸균 식염수로 수술 부위를 씻으소서.</li>
		<li>집게를 사용하여 버 구멍을 뼈 왁스로 채웁니다.</li>
		<li>얇은 팁 집게로 피부를 닫고 절단 위에 10 μL 파이펫으로 수술 용 접착제를 적용합니다. 접착제가 중합될 때까지 15-30s기다립니다.</li>
		<li>피하 주사로 진통 용액을 적용하십시오. 주입 시간을 기록하십시오.</li>
		<li>첫 번째 해독제 용액을 적용합니다. 주입 시간을 기록하십시오.</li>
		<li>가열 패드가있는 별도의 케이지에 마우스를 전송하고 깜짝 반사에 대한 동물을 모니터링합니다.</li>
		<li>마우스가 제1 해독제 용액을 투여한 후 15분 후에 완전한 의식을 얻지 못하면, 피하 주사에 의해 제2 해독제 용액을 적용한다.</li>
		<li>회복 단계에서 동물을 모니터링합니다.</li>
		<li>수술 후 합병증에 대한 다음 날뿐만 아니라 1-2 시간 나중에 확인하십시오. 필요한 경우 진통을 다시 적용하십시오.</li>
		<li>감염 예방을 위해, 설파독신(최종 농도 0.08% w/v)과 트리메토프림(최종 농도 0.016% w/v)을 동물이 수술 후 1주일 동안 광고 리비툼에 접근할 수 있는 식수에 추가합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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요하네스 복 베르그는 취리히 대학의 특허 출원 (PCT / EP2012 / 070088)에 발명가로 언급된다. 미칼 베핑거, 린다 셸해머, 요하네스 복베르그는 취리히 대학의 특허 출원(EP19166231)에 대한 발명가로 언급된다. 저자는 추가적인 재정적 이해관계가 없습니다.

대류 강화 된 배달, 또는 뇌에 압력 매개 약물 주입, 처음에 처음 제안 되었다 19903. 이 접근은 통제된 방식으로 혈액 두뇌 방벽 의 뒤에 큰 두뇌 양의 관류를 약속합니다2. 그러나, 지금까지, 몇몇 임상 시험은 임상 설치에 있는 CED가 기술적으로 요구하는 것으로 나타났기 때문에 부분적으로, 이 접근을 사용하여 수행되었습니다24,25. 카테터 설계 및 주입 프로그램의 최근 발전은 이러한기술적 어려움을 극복 한 것으로 보인다 8,19. 면역조절 체크포인트 차단제의 출현을 포함하는 치료항체의 임상적 구현이 진행되고 있으며, CNS장애(10)의치료에 적용을 기다리고 있다. 이러한 개발은 소형 ...

혈액 뇌 장벽 (BBB) 혈액 순환에서 중추 신 경계를 분리 하는 반 투과성 국경을 형성 (CNS). 그러나 치료와 함께 CNS에 도달하는 것은 뇌종양, 알츠하이머 병 (AD) 또는 파킨슨 병 (PD)과같은 다양한 질병의 맥락에서 필요하다 1. 이것은 새로운 치료법의 개발에 중요하게 되고, 특히 시험된 약물이 BBB 투과성이 좋지 않거나전신 노출이 위험한 독성으로 이어질 수 있는 경우 1,2. 임상적으로 사용된 항체 중 일부는 이러한 두 가지 특징을 모두 표시한다. 이 문제에 대한 해결책은 BBB 바로 뒤에 치료제를 전달하는 것입니다.
대류 강화 배달 (CED) 큰 두뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게 하는 신경 외과 기술입니다. 이것은 표적으로 한 지역에 하나 이상의 카테터를 외과적으로 설치함으로써 달성됩니다. 약물 적용 중에 카테터의 개구부에서 압력 구배가 형성되며, 이는 조직3,4에서난간 분산의 원동력이됩니다. 따라서 관류 범위 2,4,5를결정하는 확산 계수가 아닌 주입의 지속 시간입니다. 이는 종래의 확산기반 내뇌주사 방법2,6에비해 훨씬 더 큰 뇌부피에 대한 배음의 균일한 전달을 제공한다. 동시에,이 전달 양식은 조직 손상의 낮은 위험을 갖는다2. 따라서, CED는 CNS 종양의 치료를 위한 기존의 화학치료제의 안전하고 효과적인 투여를 가능하게 할 수 있으며, 다른 CNS 장애 2에서 면역조절제 또는 작용작용및 길항항체의 전달을 가능하게 할 수 있다2 ,7,8,9. CED는 현재 파킨슨 병, 알츠하이머 병뿐만 아니라 고급 신경교종 2, 7,8,10,11의치료법에서 테스트됩니다.
카테터 설계 및 주사 요법은 CED 10,12,13,14,15,16의결과에 영향을 미치는 가장 중요한 요인 중 하나입니다. 더욱이, 입자의 적당한 크기, 음이온 전하 및 낮은 조직 친화도 10,17을포함하는 난간내 특이적 물리화학적 특성을 요구한다. 이들 파라미터각각은2,10,17을표적으로 하는 뇌 영역의 조직학적 특징에 따라 잠재적으로 조정되어야 한다.
여기에서 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘 (striatum)으로 항체 용액의 CED를 수행하기위한 방법론을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 실험실 설정에서 스텝 카테터의 준비를 포함, 시험관내에서 테스트 및 CED를 수행.
캐뉼라의 모양, 사용되는 재료 및 카테터 개구부 수(12,15,18,19,20)에 따라 문학에서 사용할 수있는 여러 카테터 디자인이있습니다. ,21,22. 우리는 무딘 말단 금속 바늘에서 1mm 돌출된 융합실리카 모세관으로 만든 스텝 카테터를 사용하고 있습니다. 이러한 카테터 설계는 연구실험실에서 쉽게 제조될 수 있으며, 생체내 뇌의 자렌치마(23)와 유사한 물리적 파라미터를 가진 아가로즈 블록을 시험관내에서 시험할 때 좋은 CED 결과를 재현할 수 있다.
또한, 우리는 생체 내에서 5 μL의 난파를 전달하기위한 램핑 요법을 구현합니다. 이러한 프로토콜에서 주사 속도는 0.2 μL / min에서 최대 0.8 μL / min로 증가하므로 카테터를 따라 소화기 역류의 기회와 조직 손상 의 위험을 최소화합니다16. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 11 분 30 초의 과정을 통해 PBS의 5 μL에서 항체의 최대 20 μg를 가진 마우스를 성공적으로 관리했습니다.
프로토콜은 다른 주입 볼륨또는 화학 요법, 사이토 카인, 바이러스 입자 또는 리포좀 2,10,14,18과 같은 다양한 다른 물질을 주입하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. ,22. 항체의 인산완충식염수(PBS) 또는 인공 뇌척수액(aCSF) 용액에 비해 극히 다른 물리화학적 특성을 가진 침심물을 사용하는 경우 추가적인 검증 단계가 권장됩니다. 카테터 어셈블리, 검증 및 CED의 경우 일반 입체 프레임에 장착된 드릴 및 사출 유닛이 있는 입체 로봇을 사용하는 모든 단계를 설명합니다. 이 절차는 또한 설명된 유리 미세 시링거를 구동할 수 있는 프로그래밍 가능한 미세 주입 펌프에 연결된 수동 입체 프레임으로 수행될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10 &뮤; L 주사기</td><td>해밀턴</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>27G 무딘 바늘</td><td>해밀턴</td><td>7762-01</td><td></td></tr><tr><td>아가로 스</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>아티 파메 졸</td><td>Janssen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>브라운</td><td>1029754</td><td></td></tr><tr><td>부 프레 노르 핀</td><td>인디비어 슈바이즈 AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카르 프로펜</td><td>화이자 AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치과용 드릴 비트, 스틸, 크기 ISO 009</td><td>Hager & Meisinger</td><td>1RF009</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td> <td>Reuss-Chemie AG</td><td>179-VL03K-/1</td><td></td></tr><tr><td>펜타닐</td><td>헬베팜 AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-덱스트란, 2000kDa</td><td>시그마 알드리치</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>플루마제닐</td><td>Labatec Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>고점도 시아 노 아크릴 레이트 접착제</td><td>Migros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>요오드 용액</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Orion Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Roche Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Bausch + Lomb</td><td>비타민 A Blache</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr> Alexa Fluor 647 Jackson Immuno <tr><td></td><td></td><td></td> Scalpels Braun BB518 <td></td></tr><tr><td>Silica tubing 내부 직경 0.1 mm, 벽 두께 0.0325 mm와</td><td></td> 결합된 Polyclonal <td></td> goat anti-rat IgG (H+L) 항체 Stoelting <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>정위 로봇</td><td>Neurostar</td><td>드릴 및 사출 로봇</td><td></td></tr><tr><td>Succrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>국소 티슈 접착제</td><td>Zoetis</td><td>GLUture</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Bichsel</td><td>1000004</td><td></td></tr></tbody></table>

대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

대류 강화 전달 (CED)는 카테터 시스템을 사용하여 큰 뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게하는 신경 외과 기술입니다. 이러한 접근법은 혈액 뇌 장벽(BBB)을 우회하여 안전한 전달 방법을 제공하므로 BBB 투과성이 좋지 않은 치료제 또는 전신 노출이 바람직하지 않은 치료제(예를 들어 독성으로 인한 치료)를 허용합니다. CED는 카테터 설계, 주입 프로토콜 및 난간 특성의 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘내로 항체의 최대 20 μg를 포함하는 용액의 CED를 수행하는 방법을 기술한다. 그것은 단계 카테터의 준비를 설명하고, 시험관 내에서 시험하고 램핑 주입 프로그램을 사용하여 마우스에서 CED를 수행합니다. 프로토콜은 다른 주입 볼륨에 대해 쉽게 조절될 수 있으며 화학요법, 사이토카인, 바이러스 입자 및 리포좀을 포함한 다양한 트레이서 또는 약리활성 또는 비활성 물질을 주입하는데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 실험실 환경에서 CED절차에서 사용하기 위한 단계 카테터(그림 1)의 제조를 가능하게 한다. 카테터를 누출, 바늘 관을 따라 역류 및 막힘에 대한 카테터를 제어하려면 염료(예: 트라이판 블루 용액)를 아가로즈 블록으로 주사하는 것이 좋습니다. 도 3은 CED 카테터를 사용하여 0.5 μL/분에서 1 μL의 주입 후 트라이판 블루 형성의 구름을 도시한다(도3A). 카테터 단계의 시작 부분에 바늘 관을 따라 역류가 보이지 않았습니다. 더욱이, 분산된 구름은 원하는 구형 형상을 형성했다. 이는 현저한 역류가 관찰될 수 있는 종래의 27G 무딘 말단 바늘(도3B)을사용하여 얻은 결과와 대조적이다.
또한 CED는 최적화된 주입 절차가 필요합니다. <strong c...

대류 강화 전달 (CED)은 큰 조직 볼륨의 직접 관류에 의해 뇌로 치료제의 효과적인 전달을 가능하게하는 방법입니다. 절차는 카테터와 최적화 된 주입 절차의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 마우스 뇌로 항체의 CED에 대한 방법론을 설명합니다.

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

이 프로토콜은 표적 뇌 영역의 조절 가능한 균일 한 관류에 대한 단계 카테터 시스템을 사용하여 작은 설치류에서 대류 강화 된 전달을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 대류 강화 전달의 장점은 조직 손상이나 역류가 거의 없는 혈액-뇌 장벽을 우회하여 관심 영역으로 물질을 전달할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 주로 뇌로 항체와 같은 치료 물질의 전달에 유용합니다.따라서 많은 신경 학적 조건을 대상으로 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 의사 인 Michal Beffinger가 될 것입니다. 0.1 밀리미터의 내지름과 0.325 밀리미터의 벽 두께를 30밀리미터로 융합된 실리카 모세관 튜브 를 절단하여 시작합니다.균열에 대한 튜브를 검사 한 후 튜브 개구부가 매끄러운 표면을 보장하기 위해 끝을 가열하기 위해 마이크로 포지를 사용합니다. 다음으로, 10 마이크로 리터 주사기에 27 게이지 바늘을 장착하고 주사기를 스테레오전술 로봇에 배치합니다. 로봇을 사용하여 주사기를 단단한 표면 위로 이동하고 바늘 끝으로 표면을 만지도록 합니다.이 위치를 지적한 후 바늘을 상승시키는 것은 바늘의 20밀리미터가 바늘로부터 돌출되는 바늘 의 내부에 융합된 실리카 모세관의 배치를 가능하게 한다. 파이펫을 사용하여 금속 바늘에서 시작하여 모세혈관의 하부 끝 위로 10밀리미터 를 마무리하는 모세관 위에 고점도 시아노아크레이트 접착제의 두 마이크로리터를 균일하게 퍼집니다. 스테레오전술 로봇을 사용하여 바늘 끝이 기준 표면을 1밀리미터 이상 상회할 때까지 금속 바늘을 낮추어 금속 바늘 끝에서 1밀리미터 단계를 형성하는 금속 바늘의 융합된 실리카 모세관을 고정한다.카테터 스텝을 심지 않도록 금속 바늘 끝에 형성되는 과도한 접착제를 제거하십시오. 현미경의 밑에 팁을 확인하여 모든 초과 접착제가 제거되었는지 확인합니다. 그런 다음 접착제가 로봇에서 카테터로 주사기를 굳고 제거할 때까지 15분 간 기다립니다.스텝 카테터 테스트를 위해 0.6%의 아가로즈 젤을 20%로 20mm 블록으로 자르고 수동으로 10 마이크로리터의 여과 된 0.4% 트라이팬 블루 솔루션으로 스텝 카테터 주사기를 채웁니다. 스테레오전술 로봇을 사용하여 분당 0.2 마이크로 리터에 1개의 미세리터를 분배하여 고정 절차 중에 카테터의 스텝의 밀봉을 평가합니다. 트라이판 블루 솔루션은 카테터 의 끝에만 표시되어야합니다.종이 조직으로 염료를 닦고 입체 로봇

delivery-antibodies-into-murine-brain-via-convection-enhanced

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

중추 신경계의 행동 약물의 철저한 잠복기 테스트는 종종 평가 및 관리의 구체적인 노선과 공동으로 마약 biodistribution을 비교를 포함합니다. 여기 세 일반적으로 사용되는 체계 배달 방법 (정맥 intraperitoneal, 그리고 구두)뿐만 아니라 로컬 배달하는 방법 (대류 향상된 전송)은 생쥐에서 증명하고 있습니다.

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

신생아 생쥐의 중추 신경계에 치료 요원들을 소개하는 뇌 (intracerebroventricular)와 (정맥 주사) 2) 체계로 : 1)이 문서 분사의 두 가지 방법을 보여줍니다.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

약물 캡슐화는 종양 세포 특이성을 향상시키고 신경 독성을 감소시킵니다.

대류 강화 폴리에틸렌 글리콜 코팅 하전 리포좀을 쥐 뇌 종양으로 전달

출처: Zamboni, M., et al., induction of leptomeningeal cells modification by cisternal injection. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 유도 약물을 전달하는 절차를 보여줍니다. 주사는 형광 영상으로 확인된 뇌척수액을 통해 접근할 수 있는 뇌 표면 세포에서 형광 마커 발현을 선택적으로 유도합니다.

Cisterna Magna Injection을 통한 마우스 모델의 표적 약물 전달

이 비디오는 쥐의 뇌로 항체를 전달하는 CED(convection-enhanced delivery) 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스의 두개골이 노출되고 항체 전달을 위해 대상 부위에 버 구멍이 생성됩니다. 항체가 포함된 계단식 카테터를 표적 부위에 삽입하고 주입 펌프를 통해 압력 구배를 생성하여 제어된 속도로 항체를 전달합니다.

Convection-Enhanced Delivery of Antibodies into a Mouse Brain(쥐 뇌로의 항체 전달)

이 비디오는 마우스 모델에서 초음파 보조 항체 전달 절차를 보여줍니다. 역궤도로 주입된 미세기포는 초음파에서 진동하여 혈액뇌장벽에 일시적인 붕괴를 일으켜 표지된 항체가 뇌에 들어갈 수 있도록 합니다.

마우스 모델에서 항체의 초음파 보조 전달

출처: Leda, AR, et al. 내경동맥을 통해 CNS로 표적 물질을 전달하기 위한 마우스 미세수술 주입 기술. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 내경동맥(ICA)을 통해 테스트 물질을 뇌에 표적으로 주입하는 것을 용이하게 하도록 설계된 미세 수술 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 혈류를 일시적으로 제한하여 제어된 전달을 보장하기 위한 정밀한 봉합과 혈관 조작이 포함됩니다. 모세혈관이 외경동맥(ECA)에 삽입되어 분기점을 향해 전진합니다. 주입 시 이 물질은 전신 순환을 우회하고 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌 실질로의 표적 전달을 달성합니다.

내경동맥으로의 주입을 통한 마우스 뇌로의 표적 물질 전달

인간의 내시경 두개골 바닥 재건의 마우스 모델은 코 점막 이식을 사용하여 뇌와 코 사이의 반투과성 인터페이스를 만듭니다 개발되었다. 이 방법은 연구자가 체계적으로 관리, 그렇지 않으면 혈액 - 뇌 장벽에 의해 제외되는 고 분자량 치료제의 중추 신경계에 전달을 연구 할 수 있습니다.

쥐의 뇌에 직접 약물 전달 이소성 점막 Engrafting 절차

본 프로토콜은 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 직접 효과적으로 전달하는 마우스 미세 수술 주입 기술을 설명합니다.

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥

여기서, 우리는 중추 신경계에서 효과적인 유전자 침묵이 가능하게 하는 뇌 표적화 펩티드-siRNA 제제의 비강 내 투여를 위한 마우스의 적절한 배치를 가능하게 하는 마우스 포지셔닝 장치를 이용한 프로토콜을 제시한다.

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

여기에 제시된 프로토콜은 대소 또는 마우스 뇌 전체에 걸쳐 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 일시적으로 열어 형광 표지 항체를 전달하고 미세 아교세포를 활성화시키는 프로토콜입니다. 또한 조직학에 의한 항체 전달 및 미세아교세포 활성화를 검출하는 방법이 제시된다.

집중 스캐닝 초음파를 사용하여 뇌로 항체 전달

배우세요 대류 강화 전달(CED)을 이용하여 뮤린 뇌로 항체를 효과적으로 전달하는 방법을. 혈뇌장벽을 우회하고 조직 손상을 최소화하며, 뇌 질환 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달

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