Name: 동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 연골 세포 역학 생물학 연구를 위한 미세 유체 압축 장치 사용법을. 이 방법은 3D 하이드로겔 배양에서 다양한 압축 강도를 동시에 적용하여 비용 효율적인 세포 분석을 가능하게 합니다.

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크리스토퍼 모라에스 박사와 스티븐 에이 모린 박사가 장치 설계 및 제작을 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구 결과는 네브라스카 링컨 대학 (UNL)와 네브래스카 대학 의료 센터 (UNMC)에서 인간 건강 교부금을 위한 생명 공학에 의해 지원되고, NIH/NIAMS에서 AR070242를 부여했습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법에 도움을 제공한 네브래스카 대학 의료 센터에 있는 고급 현미경 코어 시설의 제니스 A. 테일러와 제임스 R. Talaska에게 감사합니다.

참고: 이 프로토콜의 모든 단계에 장갑과 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
1. 마스터 금형 제작
참고: 연기 후드에서 1.1단계 - 1.3단계를 수행합니다.
<ol><li>유리 처리 참고: 1.1단계에서는 얼굴 보호막, 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오.<ol>
<li>피라냐 용액(60 mL)을 황산(H2SO4)과과산화수소(H2O2)를부피비 3:1로 혼합하여 만듭니다. 주의: 폭발 위험으로 인해 동일한 연기 후드에 피라냐 용액과 아세톤을 사용하지 마십시오.</li>
		<li>40°C에서 30분 동안 피라냐 용액에 유리판(50.8mm × 76.2 mm × 1.2 mm)을 놓습니다.</li>
		<li>탈이온수(diH 2O)로 유리판을헹구다.</li>
		<li>유리 판을 실온에서 아세톤에 넣고 10분 동안 놓습니다.</li>
		<li>유리판을 이소프로판올로 헹구고질소(N2)가스로 건조시면 됩니다.</li>
		<li>유리판을 200°C에서 20분간 핫 플레이트에 굽습니다. 이후의 모든 베이킹 단계는 핫 플레이트를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 판에 SU-8 종자 층 형성<ol>
<li>일회용 파이펫이 있는 유리 판에 SU-8 5를 분산하여 플레이트 표면적의 약 2/3을 덮습니다.</li>
		<li>35초(초기 회전 사이클)에 대해 500rpm에서 SU-8 5 포토레지스트로 유리 판을 돌린 다음 스핀 코터를 사용하여 40초(최종 회전 주기)에 대해 2,500rpm을 회전시면 됩니다. 모든 후속 스핀 코팅 단계에는 동일한 초기 회전 사이클이 포함됩니다.</li>
		<li>SU-8 5 코팅 유리 판을 65°C에서 2분간 구운 다음 95°C에서 5분간 굽습니다.</li>
		<li>UV 광에 SU-8 5 코팅 유리 플레이트를 노출 (60 mW / cm2,UV 램프와 포토 마스크 사이의 거리는 20cm, UV 광 에너지의 총 량 = 60 mJ / cm2)1 s. 참고: 사용된 UV 광선의 힘에 따라 UV 노출 시간을 조정해야 합니다.</li>
		<li>SU-8 5 코팅 유리 판을 65°C에서 2분, 95°C에서 5분간 굽습니다.</li>
		<li>구운 유리 판을 SU-8 개발자에 2 분 동안 놓습니다.</li>
		<li>SU-8 5 코팅 유리를 180°C에서 20분간 굽습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토리소그래피를 이용한 SU-8 채널 패턴 제작(그림 2a 단계 1-3)<ol>
<li>SU-8 5 시드 유리 플레이트에 SU-8 100을 부어 플레이트 표면적의 약 2/3을 덮습니다.</li>
		<li>3,000rpm에서 SU-8 100으로 유리 판을 38s(두께 90μm)로 돌이면서 회전시면 됩니다.</li>
		<li>SU-8 100 코팅 유리 판을 65°C에서 10분 간 구운 다음 95°C에서 30분간 굽습니다. 이 시술 후에도 SU-8 100이 여전히 끈적끈적한 경우, 95°C에서 유리판을 구우고 SU-8 100이 끈적거리지 않게 됩니다.</li>
		<li>SU-8 100 코팅 유리 판에 고해상도 마이크로채널 포토마스크(25,400 dpi, 추가 그림 1참조)를 놓고 포토마스크 덮인 유리판을 4초 동안 UV 광에 노출시다(총 자외선 에너지 량 = 240 mJ/cm2). 참고: 사용된 UV 광선의 힘에 따라 UV 노출 시간을 조정해야 합니다.</li>
		<li>유리판에서 포토마스크를 제거하고 유리판을 65°C에서 2분간 굽은 다음 95°C에서 20분간 굽는다.</li>
		<li>구운 유리 판을 알루미늄 호일로 감싼 용기에 보관하여 빛을 차단하여 밤새 경화하십시오.</li>
		<li>15 분 동안 SU-8 개발자의 유리 판에 SU-8 100 채널 패턴을 개발합니다.</li>
		<li>SU-8 패턴 유리 플레이트(마스터 몰드)를 이소프로필 알코올로 세척하고N2 가스로 건조시면 됩니다. 이 과정에서 백색 입자가 남아 있으면 7단계를 5분 동안 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 공압 작동 장치
<ol><li>마이크로채널 층(레이어 1) 참고: 연기 후드에서 2.1.1 - 2.1.2 단계를 수행합니다.<ol>
<li>커버 슬립에 (Tridecafluoro-1,1,2,2-테트라 하이드로 옥틸)-1-트리클로로실란의 200 μL을 드롭하고 마스터 금형진공 챔버에 배치합니다.</li>
		<li>챔버에서 2 분 동안 진공을 적용하고 금형의 실란화를 위해 6 시간 (또는 하룻밤)을 기다립니다.</li>
		<li>PDMS를 10:1(프리폴리머:경화제)의 중량비로 5분 동안 혼합합니다. 참고: 이후의 모든 PDMS 캐스팅 단계는 동일한 전합체 및 경화제 중량비(10:1)를 포함합니다.</li>
		<li>마스터 몰드에 PDMS를 붓고 진공 챔버에서 PDMS를 30 분 동안 탈기하십시오.</li>
		<li>투명 필름의 조각으로 샌드위치 PDMS.</li>
		<li>위의 샌드위치 어셈블리를 유리 판, 폼 패드 및 플렉시 유리 플레이트로 고정합니다(그림 2a 단계 4).</li>
		<li>6 시간 동안 80 °C에서 오븐에서 PDMS를 치료하십시오.</li>
		<li>PDMS 층(레이어 1)을 샌드위치 구조로부터 투명 필름으로분리합니다(도 2a 단계 5).</li>
		<li>플라즈마 클리너를 사용하여 1층 및 깨끗한 유리 판(유리판 1, 50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm)의 표면을 1 분 동안 활성화하십시오. 참고: 플라즈마 세척 시간은 사용된 플라즈마 클리너의 전력에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>유리판 1에 1층을 결합시키고 오븐에 30분 동안 80°C로 놓습니다.</li>
		<li>레이어 1에서 투명필름을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얇은 PDMS 멤브레인 (층 2)<ol>
<li>1,000 rpm에서 1,000 rpm에서 경화되지 않은 PDMS를 1분 동안 스핀 코팅하여 60 μm 두께의 PDMS 층을 얻었다.</li>
		<li>부분적으로 20-30 분 동안 80 °C에서 오븐에서 스핀 코팅 PDMS (층 2)를 경화.</li>
		<li>플라즈마 클리너를 사용하여 유리 판 1과 레이어 2의 레이어 1을 1분 동안 활성화합니다. 참고: 플라즈마 세척 시간은 사용된 플라즈마 클리너의 전력에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>레이어 2를 레이어 1에 결합하고 밤새 80°C에서 오븐에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>튜브 블록<ol>
<li>금속 튜브를 페트리 접시에 수직으로 놓습니다.</li>
		<li>금속 튜브의 약 3/4을 담그기 위해 접시에 PDMS를 부드럽게 붓습니다.</li>
		<li>60°C에서 6시간(또는 하룻밤)에 오븐에서 PDMS를 경화합니다.</li>
		<li>하나의 금속 튜브를 포함하는 PDMS 블록의 조각을 잘라.</li>
		<li>입구에 대한 레이어 2에 구멍을 펀치.</li>
		<li>플라즈마 클리너를 사용하여 PDMS 블록과 레이어 2를 1분 동안 활성화합니다.</li>
		<li>PDMS 블록을 레이어 2의 입구 부분에 부착하고 전체 작동 장치를 오븐에 80°C로 하룻밤 동안 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 알지네이트 콘드로 시테 (또는 비드) 구조
<ol><li>아미노 실란화 유리 판<ol>
<li>다이아몬드 스크리버를 사용하여 유리 판(50.8mm × 76.2 mm × 1.2 mm)을 두 개의 반크기 유리 판(50.8mm × 38.1 mm × 1.2 mm)으로 자른다.</li>
		<li>유리판을 0.2M 염화수소(HCl)에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어줍니다(예: 55rpm).</li>
		<li>diH2O로 유리 판을 헹구다.</li>
		<li>유리판을 0.1M 수산화나트륨(NaOH)에서 55rpm에서 1시간 동안 흔들고 diH2O로헹구십시오.</li>
		<li>유리판을 1% (v/v) 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTES)에서 55rpm에서 1시간 동안 흔들고 diH2O로 헹구세요.</li>
		<li>아미노 실란화 유리 판을 밤새 연기 후드에 말립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>알긴산 젤 구조용 아가로즈 젤 몰드<ol>
<li>diH2O에 5% (v) 아가로오스와 200 mM 염화칼슘(CaCl2)을섞습니다.</li>
		<li>아가로즈 젤 용액을 전자 레인지 (또는 핫 플레이트)로 끓입니다. 끓는 시간은 아가로즈 젤 용액의 부피와 전자 레인지의 힘 (또는 핫 플레이트의 온도)에 따라 다릅니다.</li>
		<li>삶은 아가로즈 젤 용액을 알루미늄 몰드에 붓고 (보조 그림 S2참조) 유리 접시로 샌드위치.</li>
		<li>5 분 동안 기다렸다가 알루미늄 금형에서 고형 아가로즈 젤을 풀수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>성장 판 연골 세포 수확<ol>
<li>신생아 생쥐의 뒷다리에서 성장판을 분리합니다.</li>
		<li>성장판을 37°C 및 8%이산화탄소(CO2)에서인큐베이터에서 3시간 동안 0.25% 콜라게나아제의 1 mL에 놓고, 세포외 매트릭스(ECM)를 제거한다.</li>
		<li>125 x g에서 5 분 동안 소화 된 샘플을 원심 분리하여 연골 세포 펠릿을 만들고 샘플에서 상류자를 제거합니다. 여기서, 1 x g는 중력의 가속도이다.</li>
		<li>덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)의 1mL에서 연골 세포 펠릿을 다시 정지시면 됩니다.</li>
		<li>세포 카운터를 사용하여 DMEM에서 연골 세포의 수를 계산합니다.</li>
		<li>DMEM에서 연골 세포체를 125 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 다시 연골 세포 펠릿을 만들고 샘플에서 상류자를 제거합니다.</li>
		<li>선택적으로, 연골세포 배양 배지(CCM)34에서 2 μM 칼세인 AM을 함유하고, 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양하고, 3.3.6단계를 반복하고 3.3.8단계로 이동한다.</li>
		<li>콘드로시테 펠렛을 원하는 CCM 부피로 다시 중단하고 사용하기 전에 37°C 및 8%CO2에서 인큐베이터에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>알긴산-콘드로시테(또는 비드) 구문(그림 2c)<ol>
<li>1.5% (w/v) 알긴산알지산과 설포-NHS 5 mg/mL, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염(EDC)의 10 mg/mL과 함께 혼합합니다.</li>
		<li>알긴산 젤 용액 1mL에 8 x 106 연골 을 첨가 [또는 알긴산 젤 용액 의 1 mL에 1 μm 직경 형광 비드 (542/612 nm)의 3 μL을 추가하십시오 (0.3 % (v /v)].</li>
		<li>3.1단계에서 제조된 아미노 실란화된 유리 판상에 알긴산 콘드로시드(또는 비드) 용액의 150 μL을 놓습니다.</li>
		<li>알긴산 젤 용액을 아가로즈 젤 몰드로 3분 동안 덮습니다.</li>
		<li>면도날로 아가로즈 겔 몰드에서 흘러나오는 과도한 알긴산 젤 용액을 제거하고 아가로즈 겔 몰드를 제거한다. 이어서, 원통형 알긴산-콘드로시테(또는 비드) 구체는 아미노실란화된 유리판 상에서 수득된다.</li>
		<li>알긴산-콘드로시트 생성을 가교 용액(50 mM CaCl 2/140 mM NaCl in diH2O)에 1분 동안 배치하여 추가 중합을 위해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 장치 어셈블리(그림 2d)
참고: PDMS 스페이서와 3D 인쇄 클램프는 별도로 준비해야 합니다.
<ol><li>작동 장치의 레이어 2의 네 모서리에 1mm 두께의 PDMS 스페이서 4개 위치를 찾습니다.</li>
	<li>700 μL의 CCM을 배치하여 레이어 2의 공기 챔버를 덮습니다.</li>
	<li>알긴산 콘드로시테(또는 비드) 구조물을 레이어 2에 놓고 공소를 공기 챔버와 신중하게 정렬합니다.</li>
	<li>3D 인쇄 클램프로 장치를 고정합니다(그림1c).</li>
</ol>5. 장치의 작동
<ol><li>에어 펌프의 출구를 실리콘 튜브가 있는 솔레노이드 밸브 입구와 연결합니다(재료 표참조).</li>
	<li>솔레노이드 밸브의 출구를 실리콘 튜브로 조립된 장치의 입구와 연결합니다.</li>
	<li>솔레노이드 밸브를 기능 발생기로 연결합니다.</li>
	<li>함수 생성기에서 생성된 정사각형 파(예: 1Hz)로 솔레노이드 밸브를 조작합니다.</li>
	<li>에어 펌프를 켜서 장치를 공압으로 작동시려면</li>
</ol>6. 장치에 있는 연골 세포의 화상 진찰
참고 : 좋은 이미지 품질을 얻기 위해, 이미지 연골 세포 (또는 형광 구슬) 유리 플레이트를 통해 알긴산 젤 2 확장 PDMS 풍선 과 공기 챔버는 광학 이미지를 왜곡 할 수 있기 때문에. 반전된 현미경을 이미징에 사용하는 경우 유리 판 2가 아래쪽을 향하도록 장치를 설정해야 합니다.
<ol><li>이전 섹션과 같이 연골 세포 (또는 형광 비드)로 장치를 준비하십시오.</li>
	<li>각각 압축 전과 아래에 공초점 현미경으로 연골 세포 (또는 형광 구슬)의 z-스택 이미지를 가져 가라. 사용된 공초점 이미징 시스템의 피사계 심도에 따라 z-스텝 크기를 선택합니다.</li>
	<li>연골세포(또는 알긴산 비드 구조)의 높이는 이전 문헌26,35에나타난 자동 이미지 처리 방법으로 측정할 수 있다.</li>
</ol>

<ol><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li>
<li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li>
<li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+meet+cell+biology%3A+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li>
<li>García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71(2008).</li>
<li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li>
<li>Ménard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li>
<li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li>
<li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li>
<li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li>
<li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li>
<li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li>
<li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li>
<li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes%3A+A+study+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthopaedica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li>
<li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li>
<li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth%3A+implications+for+scoliosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Spinal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li>
<li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li>
<li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li>
<li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery%22%5BJournal%5D)">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li>
<li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li>
<li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes%3A+previous+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li>
<li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li>
<li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li>
<li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+%26+Physics%22%5BJournal%5D)">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224(2010).</li>
<li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve-based+microfluidic+compression+platform%3A+single+axon+injury+and+regrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li>
<li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li>
<li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable%2C+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li>
<li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

성장판 연골세포에 대한 압축 응력의 영향을 테스트하기 위해 미세유체 연골세포 압축장치(그림 1)를개발하여 알긴산 하이드로겔 스캐폴드의 연골세포에 다양한 수준의 압축 스트레스를 3D로 적용했습니다. 처리량이 높은 방식으로 문화를 전달합니다. 다른 연구자가 장치를 채택하거나 유사한 장치를 개발할 수 있도록 이 프로토콜 문서에서 장치 제작 단계에 대한 세부 정보를 제공했습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 1) 1층의 기포가 공압 마이크로채널을 손상시키지 않고 공압 마이크로채널(Layer 1)으로 PDMS 층을 제작하는 것입니다. PDMS 풍선의 탄성이 경화온도(36,3)에 의존하기 때문에 PDMS 풍선(Layer 2)을 경화하기 위한 일정한 온도(예를 들어, 80°C)는 신선한 아미노실란화된 유리를 사용하여 알긴산 겔 구조를 PDMS 풍선과 정렬하고 4)에 의존하는 것으로 알려져 있기 때...

마이크로 엔지니어링 플랫폼은 물리적 및 화학적 미세 환경모두의동적 제어를 가능하게하기 때문에 분자, 세포 및 조직 수준 생물학을 연구하기위한 귀중한 도구입니다1,2,3 ,4,5,6,7,8. 따라서, 여러 가설은 동시에 엄격하게 통제된 방식으로 시험될 수 있다. 성장판 연골의 경우,성장판 연골9,10,11에대한 작용을 통해 뼈 성장을 조절하는 데 있어 압축 스트레스의 중요한 역할에 대한 증거가 증가하고있다. 12,13,14,15,16 ,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. 그러나, 압축 응력의 작용의 메커니즘 - 특히, 스트레스가 성장 판에 연골 세포 기둥의 형성을 안내하는 방법 - 제대로 이해되지 않습니다.
이 프로토콜의 목적은 성장판 연골세포에서 메카노바이오틱의 메커니즘을 해명하기 위해 공압작동 미세유체 연골세포압축장치(26)를 만드는것이다(도 1a-c). 이 장치는 공압 작동 장치와 알긴산 겔 구조의 두 부분으로 구성됩니다. 미세 유체 공압 작동 장치는 사진 및 연리소그래피에 기초하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 제작됩니다. 이 장치에는 직경에 따라 다르게 팽창 할 수있는 얇은 PDMS 멤브레인 풍선의 5 x 5 배열이 포함되어 있습니다. 상기 알긴산 겔 구조는 5 x 5 배열의 알긴산 겔 실린더에 내장된 연골세포로 구성되며, 전체 알긴산-콘드로시트 구조는 작동 장치와 함께 조립된다. 알긴산 겔 구문은 공압적으로 팽창된 PDMS 풍선에 의해 압축된다(도1b). 미세 유체 장치는 PDMS 풍선 직경의 차이에 따라 단일 플랫폼에서 동시에 다섯 가지 수준의 압축 응력을 생성할 수 있습니다. 따라서, 다중 압축 조건 하에서 연골세포 메카노생물학의 고처리량 시험이 가능하다.
본 프로토콜에 기재된 미세유체 장치는 외부픽서(14,21,23 및 거시적 압축장치)와같은 종래의 압축 장치에 비해 많은 장점을갖는다. 19세 , 27세 , 28 연골세포 메카노생물학을 연구하기 위한: 1) 미세유체 장치는 거시적 압축 장치보다 적은 양의 샘플을 소비하기 때문에 비용 효과적이며, 2) 미세 유체 장치는 여러 개의 샘플을 테스트할 수 있기 때문에 시간 효율적입니다. 압축 조건 동시에, 3) 미세 유체 장치는 마이크로 채널의 제한된 혼합에 기초하여 화학 물질의 농도 구배를 형성하여 기계적 및 화학적 자극을 결합 할 수 있으며, 4) 다양한 현미경 기술 (시간 경과) 현미경 검사법 및 형광 공초점 현미경 검사법)은 투명 PDMS로 만들어진 미세 유체 장치로 적용 할 수 있습니다.
우리는 Moraes 등7,29의 방법을 채택하고 개정하여 연골 세포 압박의 고처리량 메카노생물학 연구를 가능하게하기 위해 단일 장치에서 다른 압축 응력 수준을 생성합니다. 우리의 접근법은 3차원(3D) 배양 환경을 필요로 하는 세포(예를 들어, 연골세포)와 세포를 압축한 후생물학적 세포학적 인 세포에 적합합니다. 일부 미세 유체 세포 압축 장치는 2 차원 (2D) 기판(30,31,32)에배양 된 세포를 압축 할 수 있지만 2D 배양 연골 세포이기 때문에 연골 세포에 사용할 수 없습니다. 차별화. 광중합체 하이드로겔7,33에서3D 배양 세포를 압축하기 위한 미세 유체 플랫폼이 있지만 광중합체로부터 세포를 분리하기 때문에 압축 실험 후 세포를 분리하는 데 제한이 있습니다. 하이드로겔은 쉽지 않습니다. 추가적으로, 세포에 자외선 (UV) 노출 및 사진 가교 개시자의 효력은 평가될 필요가 있을 지도 모릅니다. 대조적으로, 우리의 방법은 알긴산 하이드로겔이 칼슘 킬레이트에 의해 신속하게 중합될 수 있기 때문에 포스트 생물학적 분석실험에 대한 압축 실험 후 세포의 신속한 분리를 허용합니다. 자세한 장치 제작 및 특성화 방법은 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 미세유체 연골세포 압축 장치를 제조하기 위한 간략한 절차는 도 2에나타내고 있다.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741442-100ML</td><td></td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane</td><td>United Chemical Technologies</td><td>T2492-KG</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 시트</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K354</td><td></td></tr><tr><td>에어 펌프</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td><td>2015년에 구입한 모델을 사용했습니다. 2016년 초에 에어 펌프(SP 500 EC-LC)의 내부 설계 및 성능이 변경되었습니다. 또한 공기 펌프 성능은 시간이 지남에 따라 변화해 왔습니다. 따라서 SP 500 EC-LC 공기 펌프에서 생성된 공기 압력은 사용하기 전에 보정해야 합니다.</td></tr><tr><td>알긴산 분말</td><td>FMC Corporation</td><td>Pronova UP MVG</td><td></td></tr><tr><td>미늘 스트레이트 커넥터(금속 튜브)</td><td>Pneumadyne</td><td>EB40-250</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>염색된 빨간색 수성 형광 입자</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0100</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>폼 패드</td><td>GRAINGER</td><td>항목 # 5GCE8</td><td></td></tr><tr><td>기능/임의 파형 발생기</td><td>Keysight Technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>피셔 케미컬</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>피셔 BioReagents</td><td>BP2633500</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>BDH1174-4LP</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-267-013</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>다우코닝</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Keysight Technologies</td><td>E3630A</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>솔레노이드 매니폴드</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>솔레노이드 밸브</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650Mz-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SU8 개발자</td><td>마이크로켐 주식회사</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>SU8-100</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131273 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8-5</td><td>마이크로켐 공사</td><td>Y131252 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosoxynimide)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>EMD Millipore</td><td>MSX12445</td><td></td></tr></tbody></table>

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

기계적 자극은 세포와 조직의 생물학적 기능을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 연구는 압축 스트레스 성장 플레이트 연골 아키텍처를 변경 하 고 어린이의 긴 뼈의 성장 변조 결과 제안. 뼈 성장에 압축 응력의 역할을 결정하기 위해, 우리는 알긴산 하이드로 겔 실린더에 내장 된 동적으로 (또는 정적으로) 압축 성장 판 연골 세포에, 공압 압력에 의해 작동 미세 유체 장치를 만들었습니다. 이 문서에서는 이 장치를 조작하고 특성화하는 자세한 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜의 장점은 : 1) 압축 응력의 다섯 가지 크기는 하나의 플랫폼에서 다섯 개의 기술적 복제에 생성 될 수있다, 2) 기존의 빛 현미경을 통해 세포 형태를 시각화하기 쉽습니다, 3) 세포는 신속하게 분리 될 수있다 압축 후 디바이스로부터 다운스트림 어노세를 용이하게 하고, 4) 플랫폼은 하이드로겔에서 성장할 수 있는 임의의 세포 유형의 메카노생물학을 연구하기 위해 적용될 수 있다.

이 문서는 미세 유체 연골 세포 압축 장치 제조의 상세한 단계를 보여줍니다(그림 2). 이 장치는 원통형 알긴산-콘드로시트 구문 5개 어레이를 포함하며, 이러한 구문은 5가지 압축 크기로 압축될 수있다(그림 1, 그림 3 및 그림 4). 공압 마이크로채널의 높이는 약 90 μm이며 PDMS 풍선 직경은 각각 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 및 2.0 mm입니다. 장치의 성능은 정적 압축 조건 및 이미지 처리와 공초점 현미경으로 정량화되었다. 정적 압축은 공초점 현미경 검사법을 가진 z-stack화상 진찰이 몇 분 걸리기 때문에 현미경 화상 진찰을 위해 채택되었습니다, 그래서 동적 압축 도중 양적 화상 진찰을 위해 너무 느립니다.
<strong clas...

이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

이 공압 활성 미세 유체 압축 장치는 성장 판 연골 세포의 3D 하이드로겔 배양에서 메카노생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 미세 유체 장치는 소량의 샘플에 대한 압축의 여러 크기를 동시에 생성할 수 있기 때문에 비용과 시간 효율적이며, 다양한 현미경 이미징을 장치와 함께 적용할 수 있다. 우리의 방법은 또한 다른 세포 모형의 mechanobiology의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.마이크로 채널 층을 설정하려면 먼저 PDMS를 10개의 프리폴리머의 중량 비와 1개의 경화제에 5분 동안 혼합합니다. 다음으로 폼 패드에 금형을 놓고 혼합물을 마스터 몰드에 붓습니다. 진공 챔버에서 PDMS를 30분 동안 분해하고 변형된 PDMS를 투명 필름조각으로 샌드위치로 만듭니다.유리 판, 폼 패드 및 플렉시 유리 플레이트로 끼인 어셈블리를 고정합니다. 6시간 동안 PDMS를 섭씨 80도에서 치료하고 PDMS 층과 투명 필름을 끼워 진 구조로부터 분리합니다. PDMS의 표면과 플라즈마 클리너로 깨끗한 유리 판을 1분 동안 활성화한 후 PDMS를 80도 의 섭씨 오븐에서 유리 판에 30분 간 접합합니다.그런 다음 투명 필름을 제거합니다. 얇은 PDMS 멤브레인의 준비를 위해, 60 마이크로미터 두께의 PDMS 층을 얻기 위해 1 분 동안 분당 1, 000 회전에서 투명 필름에 경화되지 않은 PDMS를 회전합니다. 플라즈마 클리너를 사용하기 전에 20~30분 동안 80°C에서 스핀 코팅 PDMS를 부분적으로 치료하여 유리 판의 마이크로채널 PDMS 층과 얇은 PDMS 층을 1분 동안 활성화한다.그런 다음 얇은 PDMS 멤브레인 층을 마이크로 채널 PDMS 층에 결합하고 하룻밤 동안 80도 섭씨 오븐에 층을 배치합니다. 튜브 블록 준비를 위해 금속 튜브를 페트리 접시에 수직으로 놓고 경화되지 않은 PDMS를 접시에 부드럽게 붓고 약 3/4개의 튜브가 물에 잠기 때까지 접시에 부드럽게 붓습니다. 진공 챔버에서 30분 동안 PDMS를 탈퇴한 후 6시간 이상 60도의 오븐에서 PDMS를 치료합니다.경화 과정이 끝나면, 하나의 튜브를 포함하는 PDMS 블록의 조각을 잘라 입구에 대한 얇은 PDMS 층에 구멍을 펀치. 플라즈마 클리너로 PDMS 블록과 얇은 PDMS 층을 활성화합니다. 1분 후, PDMS 블록을 얇은 PDMS 층의 입구 구멍에 부착하고 전체 작동 장치를 하룻밤 동안 80°C의 오븐에 놓습니다.아가로즈 젤 몰드 제제를 위해 5%아가로즈와 200밀리머칼슘염화물을 탈수물에 넣고 아가로즈 젤 용액을 끓일 때까지 가열합니다. 삶은 아가로즈 젤 용액을 알루미늄 몰드에 붓고 금형을 유리 판으로 샌드위치합니다. 5분 후, 알루미늄 금형에서 고화된 아가로즈 젤을 제거합니다.알기네이트 콘드로사이클용액 150마이크로리터를 아미노실란화 유리 판에 넣고 3분간 아가로즈 겔 몰드로 용액을 덮습니다. 인큐베이션의 끝에서, 과도한 알자네이트 젤 용액을 제거하고 플레이트에서 아가로즈 젤 몰드를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다. 그런 다음 알기네이트-콘드로세포 구조를 염화 칼슘 50개와 염화 나트륨 140개가 함유한 교차 연결 용액에 1분 동안 탈온화된 물에 넣습니다.장치를 조립하려면 작동 장치의 얇은 PDMS 층의 네 모서리에 4 개의 1 밀리미터 두께의 PDMS 스페이서를 찾습니다. 연골세포 배양 배지의 700 마이크로리터로 얇은 PDMS 층의 공기 챔버를 덮는다. 스테레오 마이크로소페를 사용하여, 얇은 PDMS 층에 알기네이트 콘드로 세포 구조를 배치, 공기 챔버와 구조를 정렬하는 주의, 3D 인쇄 클램프로 장치를 고정.장치의 작동을 위해 실리콘 튜브 를 사용하여 공기 펌프의 콘센트와 솔레노이드 밸브의 입구를 연결하십시오. 솔레노이드 밸브의 콘센트와 조립된 장치의 입구를 연결하려면 튜브를 추가로 사용하십시오. 솔레노이드 밸브를 기능 발생기와 연결하고 기능 발생기에서 생성된 헤르츠 사각형 파를 사용하여 솔레노이드 밸브를 조작합니다.그런 다음 공기 펌프를 켜서 장치를 공압으로 작동시합니다. 미세 유체 연골 세포 압축 장치는 원통형 알기네이트 연골세포 구재의 5개 5개 배열을 포함하고 있으며, 이러한 구조는 5가지 압축 크기로 압축될 수 있다. 이 예에서, 겔 컬럼은 가장 큰 PDMS 풍선에 의해 높이33.8%로 압축되었고 겔 구분의 결과 압축 균주는 0.2밀리미터 증분당 약 5%의 증가와 PDMS 풍선 직경을 증가시켰다.연골세포의 압축 변형은 겔 구조 센터 근처의 613 x 613 x 40 ~ 55 마이크로미터 부피에서 세포를 이미징하여 결정하였다. 여기서 가장 큰 PDMS 풍선에 의해 16%에 의해 압축된 연골세포의 이미지가 표시됩니다. 이 그래프에서, 측정된 세포 압축 균주 값의 분포를 관찰할 수 있다.이 분석에서, 세포는 더 큰 PDMS 풍선에 의해 전체적으로 더 압축되었다. 종합하면, 이러한 데이터는 알기네이트 겔과 연골세포 압축의 양이 14킬로파스칼의 일정한 압력하에서 PDMS 풍선의 직경에 의해 제어된다는 것을 시사한다. 장치 성능의 반복성을 보장하기 위해 일정한 두께와 탄력을 가진 얇은 PDMS 멤브레인을 만드는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 면역 형광 및 시상 혼성화와 같은 다양한 생물학적 분석이 수행 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 성장 판 이나 관절 연골 세포에 mechanotransctionction에 대 한 많은 질문에 대답할 수 있습니다.

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Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

우리는 관절 연골 결손에 이전의 이식 연골의 BioComposite을 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수 있습니다 소설 기계적 하중 생물 반응기를 설계했습니다.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 관절염, 유전 요인 및 다른 로드 regimens 영향 chondrocytes 제자리에서 의 취약점을 조사 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

여기서는 랩 온 어 칩 플랫폼 내에서 뼈 리모델링을 분석하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 3D 프린팅 된 기계적 로딩 장치는 셀룰러 매트릭스를 변형시킴으로써 골혈구 기계화 변환을 유도하기 위해 플랫폼과 페어링 될 수 있습니다. 이 플랫폼은 또한 파골 세포와 파골 세포 (재흡수 / 형성)에서 뼈 리모델링 기능 결과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

골연세포 메카노트랜스덕션 을 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과 분석을 위한 Lab-On-A-Chip 플랫폼

우리는 인간 무릎 관절의 연골, 뼈, 지방 패드 및 활막을 재현하는 데 사용되는 인간 중간엽 줄기 세포에서 4가지 유형의 조직을 생성하는 자세한 방법을 제공합니다. 이 4 개의 조직은 맞춤형 생물 반응기에 통합되고 미세 유체를 통해 연결되어 무릎 관절 온 칩을 생성합니다.

관절 질환 모델링 및 약물 테스트를 위한 무릎 관절 칩 생성

본 연구는 중력을 이용하여 저접착 조건에서 세포를 스페로이드로 응집한 후 생성된 스페로이드를 미니 생물반응기에서 배양하여 연골세포 스페로이드를 생산하는 방법을 설명합니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

배우세요 연골 세포 역학 생물학 연구를 위한 미세 유체 압축 장치 사용법을. 이 방법은 3D 하이드로겔 배양에서 다양한 압축 강도를 동시에 적용하여 비용 효율적인 세포 분석을 가능하게 합니다.

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

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