하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

이 프로토콜은 단일 셀 해상도에서 후속 다운스트림 분석을 위해 혼합 셀 풀에서 단일 셀을 검출하고 선택할 수 있기 때문에 특히 관련이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고순도를 요구하는 분석의 범위에 대한 혈액 세포에서 개별 순환 종양 세포, 또는 CTC를 분리할 수 있는 잠재력입니다. 먼저 마이크로 조작기 소프트웨어를 시작하고 마이크로 조작기를 전환합니다.

마이크로 조작기를 컴퓨터에 연결하고 장치를 연결하고 초기화하여 현미경 단계에서 로봇 팔을 초기화합니다. 에탄올로 보호 캐비닛의 외부 및 내부 표면을 청소하고 컴퓨터를 통해 장치를 기동 할 수 있도록 기계의 모든 조작 후 보호 캐비닛을 닫습니다. 로봇 팔에 20~30마이크로미터 의 유리 모세관을 설치하고 시스템을 통해 시스템 오일을 플러시하여 튜브의 거품을 제거합니다.

멸균 탱크 1대는 70%에탄올, 멸균 뉴클레아제가 없는 물로 살균탱크 2개, 멸균 덜벡코의 PBS를 갖춘 완충탱크를 채우는 다. 70%에탄올로 모세관을 2회 살균하고 살균 탱크 를 살균 탱크 2로 대체하여 살균 기능을 사용하여 모세관을 3 번 이상 물로 세척합니다. 마이크로 조작기 소프트웨어에서 새 실험을 시작하고 자동 및 수동 선택 모드에서 피킹 실험 유형을 선택합니다.

갑판 트레이를 구성하여 멸균 탱크, 완충 탱크 및 증착 트레이의 위치를 지정하고 선택한 증착 트레이에서 액체 탱크의 온도를 섭씨 4도로 설정합니다. 마이크로 조작기 캐비닛 내부의 현미경 으로 방출된 CTC 용액을 포함하는 초저 부착 판을 배치합니다. 접시에서 뚜껑을 제거하고 캐비닛을 닫습니다.

원심분리기는 384웰 플레이트당 CTC 배양 배지 20마이크로리터를 함유하여 배지가 각 우물의 바닥에 격리되도록 하고 플레이트를 섭씨 4도 의 1개의 위치에 배치하여 선택된 증착 트레이를 배치한다. 수동으로 따기위한 현미경 목표와 필요한 모든 채널의 노출 시간을 선택합니다. 잘 네비게이터 표시를 선택하여 픽업 플레이트 유형을 시각화하고 선택합니다.

그런 다음 시야 의 중심에 셀없이 CTC 솔루션을 포함하는 우물의 중간에 픽업 위치를 보정합니다. 센서를 사용하여 모세관으로 플레이트 바닥을 부드럽게 터치하고 픽업 위치를 플레이트 바닥 의 0.05 mm 이상으로 설정합니다. 모세관을 손상시키지 않도록 로봇 팔을 한 번에 10 마이크로미터 로 조심스럽게 낮춥니다.

셀 유형 및 선택 매개 변수를 선택합니다. 단일 셀 피킹의 경우 수동 모드를 선택합니다. 조이스틱을 사용하여 우물 내의 유리 모세관을 탐색하고 모세관을 우물 국경에서 적어도 1 밀리미터 떨어진 단일 셀 위에 놓습니다.

그런 다음 수동으로 파티클을 추가하고 활성화된 파티클 선택을 선택하여 따기를 시작합니다. 모든 세포가 선택되었을 때, 각 우물의 바닥에 있는 세포를 퇴적시키기 위해 플레이트를 원심분리합니다. 항상피 세포 접착 분자 항체를 가진 생체 아미노산 염색은 CD45 양성 발생으로부터 정확한 구별을 가진 현탁액에서 암세포의 시각화를 가능하게 합니다.

정확한 CTC 절연은 주변 오염 물질 세포없이 원하는 대상의 포부를 특징으로한다. 의심되는 바와 같이, CTC 클러스터는 단일 CTC에 비해 증가 생존을 보여 주며, 체외 문화의 56 일 이내에 세포 식민지를 초래합니다. 특히, CTC 클러스터는 또한 더 높은 증식율을 나타내고 이렇게 더 높은 최종 세포 수에 도달하여 다른 종양 세포와의 직접적인 접촉이 종양 세포 생존가능성과 증식율 모두에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.

유방암 환자로부터 직접 분리된 CTC의 단일 세포 RNA 시퀀싱은 단일 CTC, CTC 클러스터 또는 CTC 백혈구 클러스터에서 유래한 단일 세포의 T 분산 스토카스틱 이웃 을 방출하는 것으로 나타났습니다. 마이크로 조작기의 유체 시스템 내에서 기포를 제거하고 효율적인 단일 셀 따기를 보장하기 위해 픽업 위치를 보정하기 위해 유리 모세관을 설치해야합니다. 단일 세포는 전이성 프로세스를 조사하기 위해 단일 셀 해상도에서 전 생체 분석 및 CTC 특성화를 가능하게 하기 위해 차세대 시퀀싱을 위해 시드 또는 추가 처리될 수 있다.