Name: 마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 배우세요 마우스 고환에서 RNA 결합 단백질의 RNA 표적을 식별하는 eCLIP 방법을 활용한 생식 세포 발달 연구. 이 비방사성 프로토콜은 높은 신호 대 잡음 비율로 정확한 결과를 제공합니다.

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우리는 원래 프로토콜에 도움이 되는 지침에 대 한 에릭 L 밴 Nostrand과 유전자 W 감사 합니다. K.Z.는 중국의 국가 키 R & D 프로그램 (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) 및 중국의 국가 자연 과학 재단 (31771653)에 의해 지원 되었다. L.Y.는 중국의 국립 자연과학 재단 (81471502, 31871503)과 강 소 지방의 혁신적이 고 기업가 프로그램에 의해 지원 되었다.

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<li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li>
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생물학적 및 병리학 적 맥락에서 rbps의 보편적 역할에 대 한 이해가 증가 함에 따라, 클립 방법은 rbps20,32,33의 분자 기능을 공개 하는 데 널리 활용 되 고 있습니다. 34,35. 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스 고환에 대 한 eCLIP 방법의 적응 된 응용 프로그램을 나타냅니다.
고환에서 eCLIP을 수행 하는 한 가지 과제는 신선한 고환 세포의 생존 성과 무결성을 유지 하는 것 이며,이는 효과적인 가교 결합에도 중요 합니다. 느슨한 유 봉을 사용 하 여 온화한 기계적인 힘으로 고환을 깎는 것은 세포 용 해32,</sup...

포유류 고환은 다 수의 정자를 생산 하기 위해 복잡 한 세포 분화 프로그램이 순환적으로 실행 되는 우수한 발달 모델을 나타낸다. 이 모델의 독특한 가치는 정자의 특정 단계에서 전사 불 활성화의 출현에 놓여 있으며, 일반적으로 meiotic 성 염색체 불 활성화 (MSCI)가 발생 하면1,2 및 둥근 spermatogenesis가 발생할 때 세정 동안 급격 한 핵 압축. 이 연속적인 전사 이벤트는 RNA 결합 단백질 (RBPs)이 전사체를 형성 하 고 남성의 비 옥을 유지 하는 중요 한 역할을 하는 전사 후 유전자 조절을 필요로 합니다.
생체 내에서 개별 rbp의 선의의 rna 표적을 규명 하기 위해, 상기 가교 면역 침전 (CLIP) 법은 통상의 rna 면역 침전 (RIP)을 넘어서는것을 기준으로4,5를 개발 하였으며,7 , 자외선 (UV) 가교 결합, 엄격한 세척 및 겔 전달을 포함 하는 주요 단계의 혼 입에 의해 신호 특이성을 향상 시킨다. 고 처리량 시퀀싱과 결합 된 클립의 진보 된 응용은 게놈 전체 수준8에서 단백질 RNA 상호작용을 프로 파일링 하는 것에 큰 관심을 불러 일으킨 것입니다. RBP 기능에 대 한 유전 연구 외에, 내 인 성 단백질과 RNA의 직접적인 상호 작용을 식별 하는 이러한 생화학 적 방법은 Rbp의 RNA 규제 역할을 정확 하 게 해명 하는 데 필수적입니다. 예를 들어, MOV10L1는 남성의 비 옥 및 Piwi 상호작용 RNA (피 르 나) 생물 발생9에 필요한 고환 특이 rna 헬 리 아 제 이다. 그것의 paralogue MOV10는 rna 생물학의 다 양상에서 역할을 가진 ubiquitously 표현 되 고 다기능 rna 헬 리 아 제로 알려져 있습니다10,11,12,13 , 15 , 16 , 17 , 18. 종래의 클립-서 열을 채용 함으로써, 우리는 MOV10L1이 초기 피 르 나 전 구체를 결합 하 고 조절 하는 것을 발견19,20, 그리고 MOV10 mRNA 3 ' utrs 뿐만 아니라 비 코딩 RNA를 개시 하기 위하여 고환 배아 세포의 종 (데이터가 표시 되지 않음).
그럼에도 불구 하 고, 클립은 원래 힘든, 클립 태그의 현저한 손실로 시퀀싱 라이브러리 준비 뒤에 방사성 절차. 종래의 클립에 있어서, cDNA 라이브러리는 양쪽 RNA 말단에서 결 찰 어댑터를 사용 하 여 제조 된다. 단백질 소화 후, 가교 된 짧은 폴 리 펩타이드는 RNA 단편에 부착 된 상태로 유지 됩니다. 이 가교 마크는 cdna 합성 동안 부분적으로 역방향 역전사 (rtase) 진행을 차단 하 여, cdna 라이브러리21,22의 약 80%를 나타내는 잘린 cdnas를 생성 한다. 따라서, 가교 결합 부위 (read)를 우회 하는 RTase에서 기인 하는 cDNA 단편만이 시퀀싱 된다. 최근에는 파 클립, iCLIP, eCLIP 및 uvCLAP와 같은 다양 한 클립 접근법이 살아있는 세포에서 RBPs의 크로스 링크 사이트를 식별 하는 데 사용 되었습니다. PAR 클립은 365 nm UV 방사선 및 광 활성화 가능한 뉴클레오티드 유사 체의 적용을 포함 하 고, 따라서 배양 살아있는 세포에 배타적 이며, 새로 합성 된 전사체에 뉴 클레 오 유사 체의 혼 입은 편견을 일으키기 쉽다 RNA가 물리적으로 단백질23,24와 상호 작용 하는 곳. ICLIP에서 단일 어댑터만이 가교 된 RNA 단편의 3 ' 말단에 결 찰 됩니다. 역 전사 (RT) 후에, 잘린 및 읽기-스루 cdnas는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭25,26에의 한 인트라 내 순환 화 및 재 선형화에 의해 얻어진 다. 그러나, 분 자체 순환의 효율은 상대적으로 낮다. 구형 클립 프로토콜은 방사성 동위 원소, 자외선 가교 결합 및 친화성 정제 (uvCLAP)와 함께 가교 된 RNA의 라벨링이 필요 하지만, 엄격한 탠덤 친화성 정제 과정을 통해 방사능27에 의존 하지 않는다. 그럼에도 불구 하 고, uvCLAP는 탠덤 친화성 정제를 위해 3x FLAG-HBH 태그를 운반 하는 발현 벡터로 형질 감염 되어야 하는 배양 세포로 제한 된다.
ECLIP에서, 어댑터는 RT의 3 인치 말단에서 먼저, 그리고 분자 간 모드에서 cDNAs의 3 가지 말단에서 다음으로 결 찰 되었습니다. 따라서, eCLIP은 모든 절단 및 판독을 통해 cDNA (28)를 캡처할 수 있다. 또한, 단일 뉴클레오티드 분해능을 유지 하면서도, 방사성 라벨링에 국한 되지 않고, 그 원리에 기초한 세포 주를 사용 하지 않는다.
여기서는 마우스 고환에 적합 한 eCLIP 프로토콜에 대 한 단계별 설명을 제공 합니다. 간단히 말해서,이 eCLIP 프로토콜은 고환 세관의 UV 가교 결합으로 시작 하 여 단백질 특이 적 항 체를 사용 하는 부분적인 RNase 소화 및 면역 침전이 이어집니다. 다음으로, 단백질 결합 RNA는 dephosphorylated이 고, 어댑터는 3 ' 말단으로 결 찰 된다. 단백질 겔 전기 영동 및 겔-막 전달 후, RNA는 예상 된 크기 범위의 멤브레인 영역을 절단 하 여 분리 된다. RT 후, DNA 어댑터는 PCR 증폭에 이어서 cDNA의 3 ' 말단에 결 찰 된다. 높은 처리량 시퀀싱 전에 서브 클론의 스크리닝은 라이브러리 품질 관리로 취합니다. 이 프로토콜은 두 개의 고환 발현 RNA 헬 리 아 제 MOV10L1 및 MOV10에 의해 예시 되는 RBPs의 단백질 결합 RNA의 주요 종을 식별 하는 데 효율적입니다.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse MOV10&nbsp; 항체</td><td>Proteintech, China</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse MOV10L1 antibody</td><td>Zheng et al.20109</td><td>polyclonal antisera UP2175</td><td>provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Beyotime, 중국</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Eppendorf, 함부르크, 독일</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>디지털 sonifier</td><td>BRANSON, 미국</td><td>BBV12081048A</td><td>450 와트; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>미니 블롯 모듈</td><td>Invitrogen,USA</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>미니 젤 탱크</td><td>Invitrogen,USA</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>Eppendorf, 함부르크, 독일</td><td>Thermomixer 편안함&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>티슈 그라인더, Dounce</td><td>PYREX, USA</td><td>1234F35</td><td>전용&nbsp; "느슨한" 페슬은 이 프로토콜에서 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>TProfessional standard 96 Gradient</td><td>Biometra, 독일</td><td>일련 번호: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver&nbsp;</td><td>크리스탈, 미국</td><td>일련 번호: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV-light cross-linker</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-treated Culture Dish</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>튜브</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>마이크로튜브 튜브</td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><강력한>시약&nbsp; </강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>산성 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올&nbsp;</td><td>Solarbio, 중국</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzyme</td><td>Agilent, 미국</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidant</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; 유능한 박테리아</td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>18265017</td><td>이러한 경제적 인 세포는 >1 x 106 형질전환 체를 수득합니다./&micro; g 50 &micro 당 DNA를 통제하십시오; L 반응.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>ECL 시약</td><td>Vazyme, 중국</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche, 미국</td><td>04693132001</td><td>신선한</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, 미국</td><td>78201</td><td>PCR 제품 클린업 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP 효소</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS 샘플 버퍼</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>lonza, 스위스</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MiniElute 겔 추출</td><td>QIAGEN, 독일</td><td>28604</td><td>컬럼 4 μm에서 저장; 버퍼 QG=겔 용해 버퍼; 버퍼 PE= 세척 버퍼(14단계용)</td></tr><tr><td>MyONE 실란 비드</td><td>Thermo Scientific, 미국</td><td>37002D</td><td>핵산 추출 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, 미국</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 단백질 젤</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>NP0336BOX</td><td>4%&ndash; 12%,1.5mm, 15웰</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 버퍼 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, 미국</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>위상 잠금 젤 (PLG) 무거운 튜브&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, 중국</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, USA</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>NEB, 뉴잉글랜드&nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT 버퍼</td><td>QIAGEN, 독일</td><td>79216</td><td>RNA 정제 용해 버퍼&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA 클린 & 집중 장치-5 열&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, USA</td><td>R1016</td><td>RNA 정제 및 농도 컬럼</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>Promega, 미국</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega, 미국</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>샘플 환원제</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS 솔루션</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>30970</td><td>보호 가벼운</td></tr><tr><td>T4 PNK 효소</td><td>NEB, 뉴잉글랜드&nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 리가제 1 고농도</td><td>NEB, 뉴잉글랜드&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero 클로닝 믹스</td><td>Vazyme, 중국</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, 중국</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, 중국</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urea Sigma-Aldrich, 미국</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>X-ray Films</td><td>Caresteam, 캐나다</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 고환에서 단백질 결합 rna를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eclip) 방법

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

정자 생성은 포유류에서 남성 생식 세포 분화의 고도로 주문 된 과정을 정의 합니다. 고환에서, 전사 및 번역은 결합 되지 않습니다, RBPs에 의해 조율 된 유전자 발현의 포스트 전사 조절의 중요성을 밑줄. RBP의 기계적 역할을 명료 하 게 하기 위해, 가교 면역 침전 (CLIP) 방법론은 내 인 성 직접 RNA 표적을 포착 하 고 실제 상호작용 부위를 정의 하는데 사용 될 수 있다. 향상 된 클립 (eCLIP)은 기존 클립에 비해 여러 가지 장점을 제공 하는 새롭게 개발 된 방법입니다. 그러나, eCLIP의 사용은 지금까지 확장 된 응용 프로그램에 대 한 호출, 셀 라인에 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 고환에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아 제를 연구 하기 위해 eCLIP을 사용 했습니다. MOV10 및 MOV10L1 예상한 바와 같이, 우리는 MOV10 우세 하 게 mRNA의 3 ' 미 번역 지역 (UTRs)에 결합 하 고 MOV10L1 선택적으로 Piwi 상호 작용 RNA (피 르 나) 전 구체 전사체에 묶는 것을 발견 합니다. 우리의 eCLIP 방법은 깊은 시퀀싱을 진행 하기 위한 영장으로 서브 클론의 소규모 시퀀싱 및 자격을 갖춘 라이브러리의 가용성을 통해 다양 한 RBPs에 의해 바인딩된 주요 RNA 종의 빠른 결정을 할 수 있습니다. 본 연구는 포유류 고환에서의 eCLIP에 대 한 적용 가능한 기초를 확립 한다.

상기 eclip 절차 및 결과는도 1,도 2,도 3에 도시 되어 있다. 마우스는 외과 용가 위를 이용 하 여 하복 부에 제조 하였으며 작은 절 개를 이산화탄소로 안락사 시켰다 (도 2a,B). 마우스 고환 제거, 디 툰 후 연 삭 후 UV 가교 (그림 2c-I). 고환 조직에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아...

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA 결합 단백질은 세포 생리학에 필수적입니다. 중요한 것은, RBP는 정자 발생을 통해 높게 표현되고 세균 세포의 모든 단계 도중 필수적인 전사 후 레귤레이터로 잘 문서화되었습니다. 바인딩 대상의 식별은 RBP의 기계주의 적 역할을 해명하는 데 중요합니다.이 프로토콜은 내인성 직접 RNA 표적을 포착하고 포유류 고환에서 eCLIP에 대한 적용 가능한 기초를 확립하기 위한 eCLIP 방법의 적응된 적용을 나타낸다. 이 방법의 주요 장점은 비방사성, 적은 시간 집약적이며, 크기 일치 입력이 본격적인 대상에 적합한 배경역할을 하기 때문에 더 강한 신호 대 잡음 비율을 제공한다는 것입니다. 마지막으로, 우리는 서브클론의 소규모 시퀀싱이 깊은 시퀀싱을 따르는 데 유용하다고 생각합니다.절차를 시연하는 것은 내 동료 인 쉬 치우시 (Xu Qiushi)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 각 면역 강수량 실험에 적합한 연령의 쥐로부터 약 100 밀리그램의 고환을 수확하십시오. 얼음 차가운 PBS에 조직을 배치합니다.미세 한 기울어진 핀셋을 사용하여 튜니카 알부진을 부드럽게 제거합니다. 3 밀리리터의 얼음-차가운 PBS를 조직 분쇄기에 추가하고 느슨한 유리 유봉을 사용하여 가벼운 기계적 힘으로 조직을 세트리알트합니다. 다음으로, 조직 현탁액을 세포 배양 접시에 옮기고, 최대 6밀리리터까지 얼음차가운 PBS를 추가한다.접시를 빠르게 흔들어 액체가 접시 바닥을 고르게 덮습니다. 254 나노미터에서 제곱 된 센티미터 당 400 밀리 줄로 얼음에 서스펜션을 세 번 크로스 링크. 각 조사 사이에 서스펜션을 혼합해야 합니다.이어서, 15밀리리터 원모형 튜브에서 서스펜션을 수집하고, 원심분리기는 1, 200배, 5분간 4도에서 수집한다. 상체를 제거하고 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 그 후 서스펜션을 1.5밀리리터 원심분리튜브로 옮기는다.원심분리기는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 폐기하고, 상주분리기를 폐기한다. 첫째, 125 마이크로리터의 단백질 A 마그네틱 비드를 시료당 신선한 원심분리기 튜브에 넣습니다. 구슬을 용액에서 분리하기 위해 자석에 튜브를 놓습니다.10초 후, 상체를 제거하고 얼음 차가운 용해 버퍼 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으시다. 10 마이크로그램의 eCLIP 항체를 가진 차가운 리시스 완충제의 100 마이크로리터에서 구슬을 재차질한다. 실내 온도에서 45분 동안 튜브를 회전시합니다.그런 다음 얼음 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터로 구슬을 두 번 씻으신다. 시작하려면, 50x EDTA 가없는 단백질 억제제 칵테일의 22 마이크로 리터와 RNase 억제제의 11 마이크로 리터를 포함하는 차가운 용해 완충제의 1 밀리리터에 조직 펠릿을 다시 중단합니다. 15 분 동안 얼음에 샘플을 lysing 유지합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플을 초음파 처리합니다. 다음으로 각 튜브에 4개의 마이크로리터를 추가하고 잘 섞습니다. 1, 200 rpm에서 흔들면서 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.그 후, 희석 된 RNase의 10 마이크로 리터를 추가하고 잘 혼합. 섭씨 37도에서 5분간 배양하면서 1, 200 rpm에서 흔들리면 됩니다. 그런 다음 15, 000 배 g및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심분리기를 제거하여 lysate를 지웁습니다.상체를 신중하게 수집하고 RWB 및 RRI 샘플에 대한 입력 샘플을 저장합니다. 먼저, 준비된 구슬에 용액 1밀리리터를 넣고 샘플을 섭씨 4도에서 2시간 또는 하룻밤 동안 회전시합니다. 그 후, 자기 스탠드와 구슬을 수집하고, 상체를 폐기.900 마이크로리터의 고염 완충제로 구슬을 두 번 씻은 다음 900 마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 두 번 씻습니다. 그런 다음 1x 탈포릴화 버퍼의 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻으시다. 먼저, 상체를 버리고 미세 파이펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 제거하십시오.각 샘플에 3프라임 리기션 마스터 믹스 25마이크로리터를 추가하고 조심스럽게 파이펫을 섞어 주세요. RNA 어댑터 X1A2.5 마이크로리터와 RNA 어댑터 X1B 2.5 마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 파이펫팅이나 플리킹으로 조심스럽게 섞으세요.75분 동안 섭씨 25도에서 배양하여 튜브를 10분간격으로 섞어보도록 합니다. 차가운 세척 버퍼 500 마이크로 리터로 구슬을 한 번 씻으시다. 다음으로, 차가운 고염 버퍼 500 마이크로리터로 구슬을 한 번 씻은 다음 500 마이크로리터의 냉세척 버퍼로 세척합니다.이 두 가지 세체를 다시 한 번 반복합니다. 구슬을 자기로 분리하고 미세 파이펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 제거합니다. 100 마이크로리터의 냉세척 버퍼로 구슬을 재차 질주하고 20마이크로리터를 RWB 샘플로 새로운 튜브로 이동합니다.4x LDS 샘플 버퍼 7.5 마이크로리터와 10배 샘플 감소제 3개에 추가하여 나머지 시료에 추가합니다. 1, 200 rpm에서 흔들면서 10 분 동안 섭씨 70도에서 배양하십시오. 그 후, 1 분 동안 얼음에 샘플을 냉각하고 원심 분리기는 1, 000 배 g와 1 분 동안 섭씨 4도에서 냉각합니다.RWB 젤의 경우, 자석에 튜브를 놓고 비드에서 단백질을 분리합니다. 15 마이크로리터의 샘플을 각 우물에 적재합니다. 다음으로, 1x SDS 실행 버퍼의 500 밀리리터에 항산화제 500 마이크로리터를 추가합니다.젤을 200볼트, 1x SDS 러닝 버퍼로 50분 간 또는 염료 전면이 바닥에 다질 때까지 실행합니다. 10%의 메탄올을 사용하여 1x 전달 버퍼에서 70분 동안 10볼트에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질-RNA 복합체를 전달한다. 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 5 %의 우유로 RWB 멤브레인을 차단하십시오.TBST에서 막을 헹구고, TBST에서 1 차적인 항체로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 그 후 TBST로 두 번 씻고, 각 세척은 5분간 지속됩니다. 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 이차 항체와 함께 배양하십시오.그런 다음 TBST로 멤브레인을 세 번 씻으시면 됩니다. 다음으로, ECL 버퍼 A의 동일한 볼륨을 혼합하고 버퍼 B.멤브레인에이 혼합물을 추가하고 1 분 동안 배양합니다. 멤브레인을 플라스틱 랩으로 덮고 필름을 개발하기 전에 실온에서 2 ~3 분 동안 X 선 필름에 노출하십시오.이 연구에서는, RNase를 가진 성인 야생형 마우스의 고환에서 MOV10 eCLIP는 교차형 용재를 치료하고, 표적 단백질은 약 114킬로달톤인 성공적으로 농축된다. 다양한 샘플에서 1-10까지 희석된 cDNA의 qPCR 결과는 비교차식 샘플이 RNA 회수감소를 나타낸다는 것을 보여준다. 비교차 형 그룹의 Ct 값은 일반적으로 UV 크로스 링크 그룹보다 5 배 더 많은 것으로 관찰된다.아가로즈 겔 전기포진을 통한 PCR 증폭 및 크기 선택에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있다. 프라이머 이머 제품은 약 140개의 기본 쌍에 나타납니다. 두 개의 대표적인 서브클론 서열의 UCSC 게놈 브라우저 보기는 MOV10 바운드 eCLIP 태그가 유전자 Fto의 3-PRIME UTR 내에 있는 것으로 밝혀졌다는 것을 보여줍니다.3프라임 UTR 표적의 대략적인 비율은 75%를 차지하며 HEK293 세포 및 고환에서 의 MOV10 표적의 대부분과 일치합니다. 대조적으로, MOV10L1 바운드 eCLIP 태그는 piRNA 클러스터 내에 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MOV10L1이 piRNA 전구체를 대상으로 한다는 것을 나타낸다. piRNA 전구체 표적의 대략적인 비율은 이전 연구 결과에서 추세를 반영하는 42%를 차지합니다.MOV10L1 eCLIP은 밀리리터당 40단위 RNase I 소화로 20개 미만의 베이스 쌍으로 비교적 더 많은 시퀀스를 생성합니다. 여기서 설명된 이 프로토콜은 RNA-RBP 상호작용 지식이 다소 부족한 재생에 eCLIP 방법의 고용을 나타낸다.

enhanced-crosslinking-immunoprecipitation-eclip-method-for-efficient

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

성적표에서 RNA 결합 단백질의 공간적 배열이 포스트 transcriptional 규칙의 주요 결정자이다. 따라서, 우리는 RNA 결합 단백질의 바인딩 사이트의 정확한 게놈 차원의 매핑을 허용 개별 - 염기 해상도 자외선 crosslinking 및 immunoprecipitation (iCLIP)를 개발하였습니다.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

이 비디오는 마우스 고환에서 RNA 결합 단백질을 식별하기 위한 향상된 가교 면역침전(eCLIP) 방법을 보여줍니다. eCLIP을 사용하면 RNA 결합 단백질(RBP)이 표적 RNA와 상호 작용하는 결합 부위를 정확하게 식별할 수 있습니다.

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA의 효율적인 식별을 위한 향상된 교차결합 면역침전 방법

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

배우세요 마우스 고환에서 RNA 결합 단백질의 RNA 표적을 식별하는 eCLIP 방법을 활용한 생식 세포 발달 연구. 이 비방사성 프로토콜은 높은 신호 대 잡음 비율로 정확한 결과를 제공합니다.

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

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