Name: 면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 배우세요 마우스 망막 극저온 단면도 제작 방법을 면역 조직 화학 분석을 위해. 안구 적출, 파라포름알데히드 고정, OCT 매질 포매, 크리오스탯 절단 등의 기술을 활용하여 고품질 망막 단면을 확보하고 광수용체 및 다양한 망막 세포 마커의 정확한 면역염색이 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIH (RO1-GMO97327)와 대학 연구 재단 (UPenn)의 기금에 의해 지원되었다. 우리는 특히 면역 조직 화학 프로토콜, 고든 루텔 (펜실베니아 대학) 및 현미경 검사법과 레슬리 킹, 이 원고를 읽는 중요한 박사에 대한 지원을 위한 펜실베니아 수의사 이미징 코어를 개발하는 그녀의 도움에 대한 스베틀라나 사비나 감사 .

여기에 설명된 모든 방법은 실험실 동물 자원 연구소에서 제공하는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건 원의 권고사항에 따라 엄격하게 수행되었으며, 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회.
메서드에 대한 모든 도구와 장비는 그림 1에 나와 있으며 재료표에 나열되어 있습니다.
1 . 마우스 눈 핵, 눈 컵 해부 및 포함
<ol><li>이산화탄소 (CO2)를 가진안락사 마우스는 참수 (산후 마우스 P0 - P11) 또는 자궁 경부 탈구 (성인 >P11 마우스)에 의해 뒤따릅니다. P0-P14 마우스의 경우, 눈은 피부로 덮여 있습니다. 후속 단계 전에 피부를 제거하십시오.</li>
	<li>꼬리 소작기를 사용하여 각막을 약간 연소시켜 눈의 측두체 부분을 표시합니다(그림2A). 각막을 매우 가볍게 만져서 각막에 구멍을 뚫지 말고 소작으로 1 초 이상 두지 마십시오.</li>
	<li>구부러진 Dumont #5/45 포셉을 사용하여 마우스 눈을 즉시 enucleate합니다. 1.5 mL 저온 튜브에서 1mL의 파라포름알데히드(PFA)를 얼음 위에 인산완충 식염수(PBS)로 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4% PFA에서 15분 후, 곡선 포셉 듀몬트 #5/45를 사용하여 고정된 눈을 수정된 35mm 해부 접시(재료 표 및 그림 1C참조)로 옮기고 해부 현미경 으로 배치합니다.</li>
	<li>마이크로 나이프를 사용하여 팔다리 (각막의 테두리)에 수직으로 화상 자국에서 작은 절개를하십시오.</li>
	<li>절개에 곡선 가위를 삽입하고 팔다리 다음 각막의 원주 절단을 수행 (그림2B).</li>
	<li>각막을 제거하고 얇은 Dumont #5 집게로 렌즈를 추출하고 (그림2B)눈의 뒤쪽 부분에서 섬세하게 들어 올립니다. 렌즈와 망막 사이의 공간을 채우는 유리체, 클리어 젤은 렌즈 (그림2B)와함께 나올 것이며 망막은 후방 눈 컵의 내부를 덮는 흰색 표면으로 볼 수 있습니다. 구멍이나 눈물과 같은 망막에 눈에 띄는 손상이없는지 확인합니다(그림 2C).</li>
	<li>실온에서 10분 동안 PBS 1mL에 아이컵을 두 번 씻습니다.</li>
	<li>아이컵이 가라앉을 때까지 PBS에서 밤새 15% 자당용으로 평형화하여 아이컵을 냉동 보호</li>
	<li>아이컵이 가라앉을 때까지 2-3시간 동안 PBS에서 30% 자당으로 아이컵을 옮김시.</li>
	<li>10 x 10mm 크라이오몰드 (그림3A)에10 x 10mm의 눈 컵을 포함시다. 해부 현미경을 사용하여, 등쪽-복부 축을 따라 극저온에서 눈을 배향(그림 2D, 그림 3A)화상 마크가 상단에 될 때까지 눈을 회전시켜, 시신경은 왼쪽에 있고 금형의 절단 부분은 오른쪽을 향하고 ( 그림2D)를 참조하십시오. 조직 근처의 거품을 피하기 위해주의하십시오. 참고: 아이컵을 조작하려면 파이펫 팁에 부착된 티타늄 와이어로 만든 티타늄 프로브를 사용하십시오.</li>
	<li>망막 조직을 스냅 동결하려면, isopentane을 포함하는 금속 비커에 적어도 5 분 동안 cryomold를 담그고 액체 질소 또는 드라이 아이스 / 100 % 에탄올 목욕 (금속 비커 높이의 최대 1/3)에 비커를 놓습니다. 참고 : 크라이오몰드는 이소마에 잠겨있어야합니다그것의 높이의 절반 이상으로 opentane하지만 완전히 침수 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>냉동 블록을 제거하고 알루미늄 호일에 포장합니다.</li>
	<li>-80 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>펜이나 샤키를 사용하여 고정된 블록을 표시하여 블록의 방향을 기록합니다(그림3B).</li>
</ol>2 . 저온 극저온을 이용한 절제
<ol><li>저온 온도(--20~-25°C 사이)를 조정한 후, 내장된 아이컵이 포함된 몰드가 1시간 동안 저온 온도에 평형을 되도록 합니다.</li>
	<li>도르소 복부 방향(그림3C)으로블록을 설치하고 10 μm 두께의 직렬 섹션을 잘라냅니다. 주석이 달고 번호가 매겨진 현미경 슬라이드에 망막 절편을 조심스럽게 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드를 IHC 절차가 될 때까지 -20°C 또는 -80°C의 슬라이드 상자에 보관하십시오.</li>
</ol>3 . 슬라이드 랙을 이용한 형광 면역 염색
참고: 슬라이드 랙 시스템(예: Sequenza)은 커버 플레이트가 있는 유리 현미경 슬라이드를 수납하여 슬라이드와 플레이트 사이에 ~100 μL 모세관 간격을 만듭니다.
<ol><li>저온 섹션을 실온(RT)에서 2시간 에서 4시간 동안 해동하여 건조시키고 현미경 슬라이드에 부착할 수 있도록 합니다. 참고 : 30-37 °C에서 30 분 내지 1 시간 동안 건조할 수도 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 망막 부분을 100-200 μL PBS에서 2 분 동안 두 번 씻습니다.</li>
	<li>RT에서 5분 동안 PBS에서 0.25% 트리톤-X/0.05% NaN 3로배양하여 망막 절편을 투과한다.</li>
	<li>슬라이드에 차단 용액 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>슬라이드에 차단 용액에서 희석 된 1 차 항체 100 μL을 추가하십시오.</li>
	<li>4°C에서 하룻밤 동안 망막 절편을 배양한다. 참고: 이 시간 동안 슬라이드 랙을 덮어 섹션의 탈수방지를 피하십시오.</li>
	<li>망막 부분을 3회, 각각 15분 동안 200 μL PBS를 사용하여 세척합니다. 참고 : 0.001- 0.002 % 트리톤-X100을 PBS (PBS-T)에 추가하면 보다 엄격한 세척이 허용되지만 일부 멤브레인 및 세포 구조를 방해 할 수 있습니다.</li>
	<li>RT에서 1 시간 동안 형광 표지 된 이차 항체에서 망막 절편을 배양하십시오. 지금부터 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>망막 부분을 3 회, 각각 15 분 동안 씻으소서.</li>
	<li>Hoechst 33342 또는 DAPI 용액과 같은 핵 마커로 RT에서 망막 절편을 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>망막 부분을 15 분 동안 1 회 씻으하십시오.</li>
	<li>실험실 벤치에 종이 타월 위에 덮개를 놓습니다.</li>
	<li>커버슬립 중앙에 페이딩 방지 마운팅 미디어 2방울을 추가합니다.</li>
	<li>슬라이드를 뒤집어 망막 저온 섹션이 아래를 향하도록 합니다.</li>
	<li>커버슬립을 ~45° 각도로 천천히 천천히 장착하고 슬라이드를 장착 용지에 끼우십시오. 참고: 슬라이드를 제자리에 낮출 때 거품형성을 피하십시오.</li>
	<li>무거운 책이나 카탈로그(아래 참조)를 슬라이드 커버슬립 조합에 사용하여 압력을 균등하게 가하여 과도한 장착 매체를 제거합니다. 참고: 샘플 준비의 일관성을 보장하려면 항상 동일한 객체(즉, 동일한 책 또는 카탈로그)를 사용하여 슬라이드 장착 중에 커버슬립에 균등한 압력을 가하십시오.</li>
	<li>평평하게 유지하고 어둠 속에서 RT에서 하룻밤 동안 굳어지도록 하십시오. 슬라이드를 4°C에서 무기한으로 평평하게 보관하십시오.</li>
	<li>광시야 또는 공초점 형광 현미경 검사법을통한 이미지(그림 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

공개가 없습니다.

마우스 망막 절제술은 마우스 눈의 작은 크기와 모양과 망막 조직의 취약성으로 인해 섬세한 과정입니다. 고품질 해부를 수행하는 것은 연습의 문제이지만, 상세한 프로토콜을 갖는, 효율적인 방법과 팁을 제공하는 것은 망막 절편과 IHC를 얻기 위해 필수적이다. 여기에 설명된 프로토콜 외에도 재현 가능한 IHC에 적합한 일관된 고품질 망막 섹션을 허용하는 몇 가지 팁이 있습니다.
해부를 시작하기 전에, 편안하고 편안하고 마우스 눈 미세 해부 동안 최적의 시력을 위한 실내 조명을 설정하는 것이 중요합니다. 눈을 해부하면서 마우스 아이 컵 모양을 유지하기 위해, 우리는 사용자 정의 만든 왁스 코팅 해부 접시에 PBS에 잠긴 눈을 유지하는 것이 좋습니다. 우리는 밝은 분홍색 색깔의 치과 왁스 (그림1C)로35mm 해부 접시를 코팅하는 것이 좋습니다. 실제로, 치과 왁스의 밝은 분홍색 색상은 해부 범위에서 쉽게 눈 구조를 볼 수있는 적절한 ...

면역 조직 화학 (IHC)는 1,2,3의조직에서 특정 단백질 과 세포 구조를 국소화하기위한 강력한 기술입니다. 복잡한 조직의 부적절한 고정 방법 및 최적 절편은 조직 구조를 방해하거나, 높은 배경 염색을 생성하거나 항체 에피토프 상호 작용을 감소시켜 유물을 염색하고 결과적으로 잘못된 해석을 초래할 수 있습니다. IHC 데이터4. 척추동물 망막은 상호 연결된 광수용체, 인터뉴런 및 신경절 세포의 지층으로 구성된 복잡하고 고도로 조직된 신경 기관이기 때문에 매우 취약하며 해부 및 절편 중에 쉽게 중단 될 수 있습니다. 마우스 눈 해부 및 면역 염색에 이르는 상세하고 표준화되고 검증된 프로토콜은 IHC 아티팩트를 크게 감소시켜 결과의 신뢰성을 높이고 보다 정확한 비교 데이터를 가능하게 합니다. 분석.
IHC를 위한 조직 준비를 위한 많은 프로토콜이 있습니다, 그러나, 모두가 망막 조직을 위해 적당하지 않습니다. 10 % 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강력한 고정제는 해부 및 절편동안망막 구조를 보존5 . 불행하게도, 강한 고정식은 종종 에피토프 6의 화학적 변형으로 인해 향상된 배경 형광및 에피토프 마스킹으로 이어질 . 다른 한편으로는, 온화한 고착제, 같은 4% 파라 포름 알데히드 (PFA) 이러한 유물의 일부를 완화 수 있지만 최적의 망막 구조를 보존하기 위해 세심한 해부 및 단면이 필요합니다. PFA는 조직을 빠르게 관통하지만 단백질을 매우 느리게 연결하여 에피토프 마스킹의 위험을 줄입니다. 짧은 시간 PFA 배양은 상대적으로 온화한 고정이기 때문에, 조직은 수시로 항원을 보존하기 위하여 급속한 동결을 요구합니다. 그들은 왜곡세포와 조직의 무결성을 손상으로 조직 동결 동안 얼음 결정형성을 방지하는 것이 중요하다 7.
여기서는 일관되고 신뢰할 수 있는 IHC 데이터를 산출하는 마우스 안구 후방 컵의 해부, 고정 및 냉동 보호를 위한 상세하고 표준화된 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>6qt. 스테인레스 스틸 비커 (185 x 218mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>액체 질소용 (그림 1E)</td></tr><tr><td>알루미늄 호일&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소작기&nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>눈 방향을 표시하기 위해 (그림 1A)</td></tr><tr><td>곡선형 집게, Dumont #5/45 핀셋, 45도 구부러짐&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학#</td><td>72703-D</td><td>마우스 눈 적출 및 유지 관리를 위한 (그림 1A)</td></tr> <tr><td>곡선형 가위, Vannas Spring 가위 - 2.5mm 커팅 엣지&nbsp;</td><td>고급 과학 도구&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>각막을 둘레로 자르려면 (그림 1B)</td></tr><tr><td>치과 왁스 코팅된 35mm 해부 접시</td><td></td><td></td><td>아이컵 해부용 (그림 1C)</td></tr><tr><td>해부 현미경&nbsp;</td><td>라이카, 휴스턴, 미국&nbsp;</td><td>MZ12.5 고성능 실체현미경</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 나이프 - 플라스틱 핸들&nbsp;</td><td>고급 과학 도구&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>탄 자국에 작은 절개를 만들기 위해 (그림 1A)</td></tr><tr><td>핑크 치과 왁스&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>#72660</td><td>코팅 해부 접시</td></tr><tr><td>슬라이드 랙 및 커버플레이트</td>용 <td>Ted Pella</td><td>#36107</td><td>망막 IHC (그림 1G)</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비커 (89 x 114mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>이소펜탄 욕조용 (그림 1E)</td></tr><tr><td>스티로폼 상자</td><td></td><td></td><td>절연 쿨러용</td></tr><tr><td>얇은 펜치 Dumont #5&nbsp; &nbsp;</td><td>고급 과학 도구&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>각막을 제거하고 렌즈를 추출하기 위해 (그림 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryomold&nbsp; (10mm x 10mm x 5mm)</td><td>전자 현미경 과학&nbsp;</td><td>#62534-10</td><td>OCT 임베딩용 금형</td></tr><tr><td>Buffers and Reagents</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish Skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in per메abilization buffer.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (안티페이딩 마운팅 미디어)</td><td></td><td></td><td>흄 후드 아래에서 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G)를 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01)에 용해시킵니다. 12N HCl(~ 5방울)로 pH 8-8.5로 조정합니다. 4&deg에서 호박색 드롭 병에 보관하십시오. 씨&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x 재고</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 62249</td><td>1 mg / ml PBS (1000x). 4&deg에서 어두운 곳에서 부분 표본 및 저장; C 최대 1 년 또는 -20°C; C는 장기 보관을 위한 것입니다. 신선하게 준비&nbsp; 1ug/mL(1x)에서&nbsp;</td></tr><tr><td>이소펜탄, 99%&nbsp;</td><td>GFS Chemicals</td><td>#2961</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> 전자 현미경 과학의 액체 질소 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA);</td><td></td><td>#15710</td><td>16% PFA 재고에서 신선한 4% PFA를 준비했습니다. 나머지 16% PFA를 4°C에 보관하십시오. 어둠 속의 C.&nbsp;</td></tr><tr><td>투과화 용액</td><td></td><td></td><td>PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&nbsp; 새로 준비하십시오.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&nbsp; 10x 재고에서 준비됨&nbsp;</td></tr><tr><td>자당 솔루션</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>적당량의 자당을 &nbsp; 37&deg; C PBS(용해하는 데 ~15분 소요). 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT-컴파운드&nbsp;</td><td>사쿠라</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>anti-calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>horinzotal 세포를 라벨링하려면&nbsp;</td></tr><tr><td>GAB를 표지하는 반대로 GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>GABAergic 무축삭 세포</td></tr><tr><td>반대로 GS</td><td>BD 형질주입</td><td>610517</td><td>M&uuml를 표지하기 위하여; ller 세포</td></tr><tr><td>anti-rhodopsin</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>막대를 라벨링합니다.</td></tr></tbody></table>

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

면역 조직 화학 (IHC)를 위한 고품질 마우스 눈 단면도의 준비는 망막 구조물 및 기능을 평가하고 망막 질병의 근본적인 기계장치를 결정하기를 위해 중요합니다. 조직 준비 전반에 걸쳐 구조적 무결성을 유지하는 것은 재현 가능한 망막 IHC 데이터를 얻는 데 필수적이지만 망막 세포아키텍처의 취약성과 복잡성으로 인해 어려울 수 있습니다. 10% 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강한 고착제는 망막 구조를 최적으로 보존하며, 종종 배경 형광을 향상시키고 항체-에피토프 상호작용을 감소시킴으로써 IHC 분석을 방해합니다. 온화한 고착제는, 4% 파라포름알데히드와 같이, 배경 형광 및 에피토프 마스킹을 감소시키고, 세심한 해부 기술은 망막 구조물을 보존하기 위하여 이용되어야 합니다. 이 문서에서는, 우리는 망막 구조 무결성의 손실 없이 대부분의 항체 에피토프 상호 작용을 보존하기에 충분한 IHC를 위한 마우스 안구 후방 컵을 준비하는 포괄적인 방법을 제시합니다. 우리는 최적이고 최적이 아닌 조건 하에서 조직 보존 및 방향을 설명하기 위해 다양한 망막 세포 유형 마커에 대한 항체를 가진 대표적인 IHC를 포함합니다. 우리의 목표는 안구 후방 컵 해부에서 IHC에 완전한 프로토콜을 제공하여 망막의 IHC 연구를 최적화하는 것입니다.

이러한 프로토콜이 IHC에 대한 최적의 망막 보존을 보장하는 방법을 설명하기 위해, 우리는 P28 WT 마우스 (C57BL / 6N)에서 로도프신(광수용체 마커)에 대한 항체로 망막 절편을 8, 글루탐산 데카르복실라제 65 (Gad65, amacrine 세포)를 조사했습니다. 마커)9, 글루타민 합성체 (GS, 뮐러 세포 마커)10,및 칼빈딘 (수평 세포 마커)11 (도 4). IHC는 우리의 프로토콜이 지속적으로 높은 품질과 잘 보존 된 망막 섹션을 산출한다는 것을 나타냅니다. 특히, 로도신이 풍부한 내부 및 외부 세그먼트는 망막 색소 상피 (RPE)(그림 4A)를 겹치게하는 것을 거의 또는 전...

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC). 설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

마우스 망막 해부는 눈의 크기와 모양과 망막 섹션의 취약성으로 인해 정말 섬세한 과정입니다. 효율적인 방법과 팁을 제공하는 상세한 프로토콜을 갖는 것이 고품질 망막 해부 및 섹션의 핵심입니다. 우리는 연구원이 일반적인 함정을 피하고 면역 조직화학에 적합한 몇몇 고품질 망막 단면도를 얻는 것을 돕기 위하여 팁 과 조언을 제공합니다.각막을 매우 가볍게 만지고 약간 각막을 태우고 구멍을 만드는 것을 피하기 위해 분할 초 이하의 경우, 꼬리 소작을 사용하여 안락사 마우스의 눈의 시간 적 부분을 표시합니다. 그 직후 마우스 눈을 방출하기 위해 곡선 듀몬트 545 집게를 사용했다. 1.5 밀리리터 냉동고튜브에 4%의 PFA와 PBS1밀리리터를 배치하고 얼음 위에 15분 동안 배양합니다.그런 다음, PBS로 채워진 변형된 35mm 해부 접시에 구부러진 Dumont 545 집게를 사용하여 고정된 눈을 전송하고 해부 현미경의 밑에 놓습니다. 마이크로나이프를 사용하여 각막의 림푸스 경계 바로 위에 수직으로 화상 마크에 작은 절개를 합니다. 절개에 곡선 가위를 삽입하고 림푸스 다음 각막의 할례 컷을 수행합니다.그런 다음 얇은 Dumont 5 포셉을 사용하여 각막을 제거하고 렌즈를 추출한 다음 눈의 후방 부분에서 섬세하게 들어 올립니다. 유리체 몸은 렌즈와 함께 나올 것이고 망막은 후방 눈컵의 내부를 덮고 있는 흰색 표면으로 볼 수 있습니다. 실온에서 10 분 동안 PBS의 1 밀리리터에 고립 된 눈 컵을 두 번 씻으시다.눈컵을 보호하려면 15%의 자당과 PBS를 4도에서 섭씨 4도에서 상량화하여 가라앉을 때까지 평형화합니다. 그런 다음 안구컵을 30% 자당과 PBS로 2~3시간 동안 옮겨 가라 앉을 때까지 옮겨넣습니다. 10월에 아이컵을 10mm에서 10mm 의 냉동 금형으로 배치합니다.해부 현미경하에서, 화상 자국이 위에 올 때까지 눈을 회전하여 등쪽 복부 축을 따라 냉동 금형의 눈을 방향을 지정합니다. 시신경은 왼쪽이고 금형의 잘라낸 부분은 오른쪽에 있습니다. 망막 조직을 고정하려면, isopentane을 포함하는 금속 비커에 적어도 5 분 동안 냉동 금형을 침지 한 다음 비커의 높이의 1/3까지 액체 질소에 비커를 놓습니다.냉동 블록을 제거하고 알루미늄 호일에 싸서 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 펜 이나 Sharpie를 사용 하 여 고정 된 블록을 표시 하 여 방향을 기록 합니다. 영하 20도에서 영하 25도 사이의 저온을 조정한 후, 내장된 눈컵이 들어 있는 금형을 내부에 놓고 1시간 동안 저온 온도에 평형할 수 있도록 합니다.등대 복부 배향으로 극저온에 블록을 설치하고 10 마이크로미터 두께의 직렬 섹션을 절단하십시오. 주석이 주석이 추가된 현미경 슬라이드에 망막 섹션을 조심스럽게 배치한 다음 면역 염색을 준비할 때까지 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도의 슬라이드 박스에 보관하십시오. rhodopsin, 광수용체 마커, 글루타믹 산 데카르복실라제 65, 및 아맥린 세포 마커, 글루타민 신디사이저와 뮬러 세포 마커, 및 칼빈딘, 수평 세포 마커를 가진 면역 조직 화학은 망막 섹션에서 수행되었다.결과는 이 프로토콜이 다른 프로토콜에서 얻은 열악한 품질 망막 섹션과 달리 고품질의 잘 보존된 망막 섹션을 산출한다는 것을 나타냅니다. Rhodopsin 풍부한 내부 및 외부 세그먼트는 망막 색소 상피를 오버레이에서 거의 또는 전혀 분리와 수직 및 그대로 남아있다. Gad65 양성 막시 세포와 같은 인터뉴런은 내부 핵 층 및 내부 플렉시폼 층 내에서 적절하게 계층화되어 있습니다.또한, 뮬러 세포는 신경절 세포 층에서 외부 핵 층까지 에 걸쳐 세포질 공정에 제대로 정렬 된 소마로 잘 보존 되어 있습니다. 더욱이, 잘 정의된 수평 세포는 내부 핵층 및 외부 플렉시폼 층 테두리에서 검출할 수 있다. 눈의 토퍼 영역을 표시하고 포함하는 동안 방향을 유지하는 것이 중요합니다.항상 적절한 개인 보호 장비와 후드 아래 파라 포름 알데히드를 준비합니다.

preparation-of-mouse-retinal-cryo-sections-for-immunohistochemistry

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

이 프로토콜은 망막의 시냅스 회로 및 단백질 국소화를 탐색하는 데 중점을 두고 면역전자 현미경을 사전 삽입하는 세부 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating retinal circuits and molecular localization by pre-embbedding immunoelectron microscopy (면역전자 현미경 사전 임베딩을 통한 망막 회로 및 분자 국소화 조사)

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

마우스 망막 동결절편을 준비하고 광수용체에서 면역염색을 수행하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 논문을 통해 연구자들은 잘 보존된 형태와 고품질 면역염색 결과를 가진 마우스 망막 동결 절편을 일관되게 생성할 수 있습니다.

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 마우스 망막 극저온 단면도 제작 방법을 면역 조직 화학 분석을 위해. 안구 적출, 파라포름알데히드 고정, OCT 매질 포매, 크리오스탯 절단 등의 기술을 활용하여 고품질 망막 단면을 확보하고 광수용체 및 다양한 망막 세포 마커의 정확한 면역염색이 가능합니다.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

더 많은 동영상 탐색