Name: 근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 배우세요 근적외선 형광 및 고분해능 주사를 활용한 설치류 뇌 단백질 발현 정량화 방법을. 면역조직화학법으로 해마와 편도체에서 AMPA/NMDA 수용체 비율 및 인지 관련 분자 신호 경로를 효율적으로 분석할 수 있습니다.

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이 보고서에 대 한 연구는 DK에 게 부여 된 니 터 (1P20GM10363) 로부터 목표 보조금에 의해 투자 되었다.

다음 의정서는 델라웨어 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었다. 이 프로토콜에는 약 55 ~ 75 일이 사용 되었다.
1. 뇌 추출 및 조직 준비
<ol><li>쥐가 더 이상 발 핀치에 대 한 응답을 전시 하지 때까지 마 취 유도 챔버에 아이 소 루 레인으로 쥐를 마비.</li>
	<li>길로 틴을 사용 하 여 빠른 침 강을 통해 쥐를 희생.</li>
	<li>두개골 후부에 피부를 자르고 두개골 꼭대기에서 지웁니다.</li>
	<li>신중 하 게 두개골의 뒤쪽 부분을 제거 하기 위해 rongeurs를 사용 하 여, 두개골의 중간 선을 잘라 작은 해 부가 위를 사용 하 여, 뇌 조직의 손상을 방지 하기 위해 항상 두개골의 상단에 대 한 위로 밀어.</li>
	<li>사용 rongeurs 뇌를 노출 하는 두개골의 오른쪽 및 왼쪽 절반을 벗 겨.</li>
	<li>작은 주걱을 사용 하 여 뇌 밑으로 스 쿱과 신경을 절단 하 고 드라이 아이스 (최소 20°c)에서 획기적 차게 하 여 두뇌를 강화 하 고 두뇌를 동결 시키십시오. 그 후, 슬라이스 할 때까지-80 ° c 냉동 고에 뇌를 저장 합니다.</li>
	<li>-9 ° c와-12 ° c 사이에서 유지 되는 저온 상태에서 30 ~ 50 µm의 관심 영역에서 뇌를 슬라이스 합니다. 글라스 슬라이드에 슬라이스를 직접 마운트하고 면역 세포 화학 분석을 할 때까지-80 ° c 냉동 고에 보관 하십시오. 참고: 이 프로토콜에서 관심 있는 뇌 부위는 해 마와 복숭아 류 였다.</li>
</ol>2. 단일 면역 조직 화학 반응
참고: 이중 면역 조직 화학 반응의 경우,이 프로토콜은 단일 면역 조직 화학 반응과 동일 하며,이는 상이한 호스트 (예컨대, 토끼 및 마우스)의 2 개의 일차 항 체를 가지 며, 대응 하는 2 개의 이차 항 체 프라이 머리는 단일 호스트에서 해야 합니다 (예: 염소 토끼와 염소 안티 마우스). 이차 항 체는 또한 고해상 스캐너에서 이용 가능한 2 개의 다른 스펙트럼에서 이어야 합니다. 예를 들어, 680 nm에서의 발광 스펙트럼 피크와 1 차 항 체 800CW (780 nm에서의 방출 스펙트럼 피크)를 갖는 2 차 항 체.
<ol><li>냉장고에서 유리 슬라이드를 제거 하 고 30 분 동안 실 온으로 평형 화를 할 수 있습니다.</li>
	<li>연기 두건에서, 실 온에서 1 − 2 시간 동안 0.1 M 인산 완충 식 염 액 (PBS)에서 4% 파라 포름알데히드에 뇌 조직을 고정 합니다.</li>
	<li>0.1 M 트리 스 완충 식 염 분 (TBS)을 10 분 동안 세 번 헹 구 십시오. 30-60 분 동안 중성 세제 (예: 0.01% 세제)로 슬라이드를 배양 하 여 세포 막을 투과 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 15 분 동안 3 번 TBS로 헹 궈 주세요.</li>
	<li>정확한 농도에서 PBS에 관심 단백질에 대 한 1 차 항 체를 희석. 예를 들어, 즉시 초기 유전자 c-Fos를 검출 하기 위해, 1:500의 농도로 토끼 1 차 안티 c-포스 항 체를 제조 하였다.</li>
	<li>기본 항 체 용액을 뇌 조직에 직접 (약 200 µ L 3 인치 x 1 인치 슬라이드).</li>
	<li>커버 슬립을 사용 하 여 상 온에서 1 − 2 시간 동안 일차 항 체 희석에서 유리 슬라이드에 뇌 조직을 배양 하 고 4°c에서 하룻밤 (17 시간).</li>
	<li>커버 슬립을 제거 하 고 소량의 세제가 추가 된 TBS (예: 0.01% 세제, "TBS-T")를 15 분 동안 4 회 정도 세척 합니다.</li>
	<li>커버 슬립을 사용 하 여 2 시간 동안 실 온에서 이차 항 체의 뇌 부분을 배양 합니다. 참고: 2 차 항 체는 숙주 혈 청의 TBS, 세제 및 1.5%를 함유 하는 희석제에서 정확한 희석을 하 여야 한다. 예를 들어, 1:2000의 희석에서 염소 2 차 항 체는 1.5% 염소 세럼과 0.05% 세제를 함유 할 것 이다.</li>
	<li>슬라이드를 테이블스푼에서 20 분 동안 4 번, 각각 20 분간 테이블스푼으로 헹 구 십시오.</li>
	<li>밤새 어두운 곳에서 실내 온도에서 건조 한 슬라이드. 슬라이드가 건조 하면 이미징 준비가 완료 된 것입니다.</li>
</ol>3. 이미징
<ol><li>조직을 아래로 향하게 하 여 근 적외선 스캐닝 인터페이스에 슬라이드를 놓습니다. 선택 도구를 사용 하 여 한 번에 하나의 유리 슬라이드 또는 여러 슬라이드를 이미지 합니다.</li>
	<li>이미지 슬라이드는 오프셋이 0 nm이 고 해상도가 21 µm 최고 품질 설정을 사용 합니다. 스캐닝은 통상적으로 사용 되는 스캐닝 장비에 따라 13-19 시간을 소요 한다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어 (예: ImageStudio)로 화상을 가져와 반 정량적 단백질 분석을 확인 하 고 표시 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 발현 분석
<ol><li>이미지 분석 소프트웨어를 열고 이미지를 스캔 한 작업 영역 을 선택 합니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어에서 스캔 한 이미지를 열어 스캔을 확인 하 고, 볼 수 있는 파장을 조정 하 고, raw 이미지나 총 정량화 된 발광을 변경 하지 않고 표시 되는 대비, 밝기 및 배율을 조절 합니다.</li>
	<li>정량화 할 주요 영역을 식별 하 고 페이지 상단의 분석 탭을 선택한 다음 사각형 그리기 (또는 타원 그리기/자유형그리기)를 선택 하 여 정량화 될 영역 위에 직사각형을 그립니다.</li>
	<li>사각형의 크기를 보려면 화면 왼쪽 아래에 있는 모양을 선택한 다음 오른쪽 하단을 따라 열 을 선택 합니다. 높이 및 너비 열을 추가 하 여 모양 크기를 식별 합니다. 참고: 정량화를 비교할 때 모양 크기를 제어 하는 것이 중요 합니다. 해당 영역에 대 한 배출량의 정확한 샘플링을 얻기 위해 원하는 정량화 위치 내에 배치 된 동일한 형상을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>그런 다음 셰이프의 이름을 지정 하 고 반복 합니다. 모든 지역이 샘플링 되 면 열 탭에서 사용할 수 있는 데이터를 집계 하 고 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 기사에서 제시 된 결과는 근 적외선 면역 세포 화학이 고 분해능 스캐닝과 결합 하 여 뇌 조직에서 단백질 발현의 반 정량적 측정을 얻는 데 사용 될 수 있음을 보여준다. 또한 동일한 뇌 영역에서 동시에 두 개의 단백질을 라벨링 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 여러 뇌 영역에서 즉각적인 초기 유전자 발현을 측정 하기 위해 근 적외선 면역 조직 화학을 사용 하였다9,10. 즉각적인 초기 유전자는 신경 활동의 척도로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 즉각적인 초기 유전자 (IEGs)의 상관관계가 있는 수준으로 뇌 지역을 그룹화 하는 것을 허용 하는 통계적 인 분석에 단백질 표현의이 반 정량적 측정을 복종 시켰습니다. 이를 기능적 연결성의 척도로 사용 하 여 정서적 학습 및 메모리9,10동안 공포 회로 내에서 노...

신경 과학의 연구는 두뇌에 있는 세포가 특정 기능을 중재 하는 방법1에 대 한 조사에 관련 됩니다. 이러한 세포가 중추 신 경계에서 면역을 부여 하는 방법과 같은 자연에서 세포가 될 수 있거나 등 쪽 해 마에서 뉴런의 활동이 공간적 탐색으로 이어지는 방법을 설명 하는 것을 목표로 하는 실험을 포함 할 수 있습니다. 광범위 한 의미에서, 세포 기능은 세포에서 발현 되는 단백질 및 이들 단백질2의 활성에 의해 결정 된다. 결과적으로 뇌 세포에서 단백질의 발현 및/또는 활성을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 중요 합니다.
두뇌에 있는 단백질 발현을 측정 하기 위하여 다 수 기술이 이용 가능 합니다. 이들은 작은 펩 티 드를 위한 수용 체 밀도3 및 미세 투 석을 위한 양전자 방출 지형과 같은 생체 내 방법을 포함 한다4. 보다 일반적으로, ex 생체 내 방법은 단백질 기능 및 발현을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이들은 질량 분석 법5, 웨스턴 블 롯 및 효소 결합 면역 흡수 법 (ELISA)6및 면역 세포 화학 물질7을 포함 한다. 면역 세포 화학은 신경 과학 분야에서 널리 사용 됩니다. 이 기법은 관심 있는 단백질 (또는 항 원)을 검출 하는 일차 항 체를 사용 하는 것을 수반 한다 (예컨대, c-Fos) 단백질을 검출 하는 공액 2 차 항 체 복합체 (도 1). 단백질-일차 항 체-이차 항 체 복합체의 검출을 가능 하 게 하기 위해, 2 차 항 체는 그들에 게 컨 쥬 게이 션 (과산화 효소)과 사비와 같은 산화 제를 갖는다. 이것은 빛 현미경 검사 법7을 사용 하 여 검출 될 수 있는 세포에 있는 침전 물의 대형을 허용 합니다. 이차 항 체는 또한 그들에 게 콘 쥬 게이 형광 화학 물질을 가질 수 있습니다 (즉, 형광 단). 이러한 화학 물질을 자극 하는 경우,이는 단백질-일차 항 체-2 차 항 체복합체를 검출 하는데 사용 될 수 있는 빛을 방출 한다. 마지막으로, 때로는 일차 항 체가 환 원제와 형광 화학 물질이 부착 되어 이차 항 체7 의 필요성을 직접적으로 부정 합니다 (그림 1).
흥미롭게도, 많은 면역 세포 화학 법은 특정 세포 또는 뇌 영역에서 단백질의 양을 정량화 하는 능력은 아니지만 뇌 세포내에서 단백질의 시각화를 가능 하 게 합니다. 광 현미경을 사용 하 여 환 원 반응에서 침전 물을 검출 하는 것은 뉴런 및 글 리아의 시각화를 가능 하 게 하지만,이 방법은 세포 또는 특정 뇌 영역에서 단백질 발현을 정량화 하는 데 사용할 수 없습니다. 이론적으로, 형광 현미경은 형광 성 이차 항 체 로부터 방출 되는 빛이 단백질-일차 항 체-2 차 항 체 복합체의 척도 이기 때문에이를 위해 사용 될 수 있다. 그러나, 뇌 조직에서의 자동 형광은 뇌 조직8에서 단백질 발현을 정량화 하기 위해 형광 현미경을 사용 하기 어렵게 만들 수 있다. 결과적으로 뇌 조직의 형광 이미지에서 방출 되는 빛은 거의 뇌의 단백질 발현을 정량화 하는 데 사용 되지 않습니다.
이러한 문제의 대부분은 고 분해능 스캐닝9,10과 함께 근 적외선 면역 세포 화학을 사용 하 여 해결할 수 있습니다. 본 문서에서는 근 적외선 방출 스펙트럼의 형광 단에 면역 세포 화학을 결합 하 여 고 분해능 스캐닝 (예: µm)과 결합 하 여 단백질의 반 정량화를 허용 하는 선명한 이미지를 얻을 수 있는 방법을 설명 합니다. 뇌 영역.

<table><tbody><tr><td>뇌 추출</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마취 유도 챔버</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Guillotine</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>두개골 뒤쪽을 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>섬세한 해부 가위</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-951-5</td><td>두개골의 중심선을 따라 위쪽으로 자르는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td>는 <td>뇌를 퍼내는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>면역조직화학 반응</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>은 파라포름알데히드에 고정된 후 세포를 투과시키는 중성 세제로 사용되며, 호스트 세럼 및 보조 항체와 함께 중성 세제로도 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>TBS&nbsp;에 첨가되는 소량의 세제로 사용되며, 주요 항체</td></tr><tr><td>Licor Odyssey 스캐너 Licor</td><td>Biotechnology Inc</td>.로 슬라이드를 커버슬립한 후 TBS-T를 처리하는 데 사용됩니다.<td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 스튜디오</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

신경 과학은 두뇌에 있는 세포가 각종 기능을 중재 하는 방법의 연구 결과입니다. 세포 기능이 세포 단백질의 조성과 활동에 의해 결정 되기 때문에 뉴런 및 글 리아에서 단백질 발현을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 매우 중요 합니다. 이 기사에서는 면역 세포 화학이 근 적외선 고 분해능 스캔과 결합 되어 별개의 뇌 영역에서 단백질 발현에 대 한 반 정량 측정을 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 동일한 뇌 영역에서 단일 또는 이중 단백질 발현에 사용 될 수 있다. 이러한 방식으로 단백질을 측정 하는 것은 실험 조작, 학습 및 기억력의 분자 서명, 분자 경로의 활성 및 여러 뇌 영역에서의 신경 활동으로 단백질 발현의 상대적인 변화를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 올바른 단백질과 통계 분석을 사용 하 여 뇌 영역 간의 기능적 연결성도 확인할 수 있습니다. 실험실에서 면역 세포 화학 작용의 용이성을 감안할 때, 근 적외선 고 분해능 스캐닝으로 면역 세포 화학을 사용 하는 것은 신경 과학자가 시스템 수준에서 신경 생물학 프로세스를 검사 하는 능력을 확장할 수 있습니다.

면역 조직 화학에 대 한 고해상도 스캐닝을 사용 하기 전에 프로토콜이 작동 하는지 확인 해야 합니다. 이는 동일한 동물의 뇌 부분이 1 차 및 2 차 항 체, 2 차 항 체가 단독으로 또는 1 차 또는 2 차 항 체와 함께 인큐베이션 되는 유효성 검사 분석을 사용 하 여 달성할 수 있습니다. 이러한 유효성 검사 분석에 대 한 결과는 도 2에 나타내 었 다. 이 반응에서 우리는 등 쪽 해 마 및 편도 체에서 즉각적인 초기 유전자 c 준을 검출 하였다. 3 월 발현은 뇌 조직에 일차 및 이차 항 체가 적용 되었을 때에만 관찰 되었다.
그림 3 은 편도 핵에서 이중 단백질 검출을 보여줍니다. 이 실험에서 우리는 동일한 뇌 조직에서 α-아미노-3-하이드 록 시 Gl...

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

이 프로토콜은 동일한 뇌 영역에서 두 단백질의 정량화를 허용하기 때문에 중요합니다. 이것은 실험자가 팬과 인포단백질을 속여 뇌 지구에 있는 분자 신호 통로에 있는 활동을 보는 것을 허용합니다. 그것은 또한 다른 인지 현상의 마커 인 단백질을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.우리는 면역 히스토케와 같은 비교적 간단한 기술을 사용하여 전형적으로 더 많은 관련 기술을 필요로하는 질문에 대답하고 있습니다. 분자 신호 경로의 활성을 검사하는 것을 포함하여 AMPA/NMDA 비율을 검사합니다. 영하 9도에서 영하 12도 사이 유지된 저온을 사용하여, 30-50 마이크로미터에서 관심 지역에서 이전에 고립되고 냉동된 쥐 뇌를 슬라이스합니다.유리 슬라이드에 슬라이스를 직접 장착하고 면역 세포 화학이 될 때까지 영하 80도에서 보관하십시오. 냉동실에서 유리 슬라이드를 제거하고 30 분 동안 실온에 평형 할 수 있습니다. 연기 후드 아래에서 작업, 조직 고정을위한 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 0.1 어금반 PBS에 4 %의 파라 포름 알데히드에 슬라이드를 배치합니다.그런 다음 슬라이드를 0.1 어금니 TBS에서 각각 10분 동안 세 번 헹구십시오. 세포막을 과소화하려면 슬라이드를 30-60 분 동안 가벼운 세제로 배양하십시오. 그리고 TBS에서 각각 15분 동안 세 번 다시 헹구십시오.원고에 기재된 바와 같이 올바른 농도에서 PBS에 관심이 있는 단백질을 위한 1차 항체를 희석시. 파이펫 1 차 적인 항체 용액은 뇌 조직에 직접. 슬라이드에 덮개 전표를 놓고 실온에서 1-2 시간 동안 1 차적인 항체 희석에 있는 두뇌 조직을 배양합니다.인큐베이션 후 커버 슬립을 제거하고 소량의 세제가 첨가된 TBS의 슬라이드를 각각 15분 동안 4회 세척합니다. TBS, 세제 및 숙주 혈청의 1.5%를 포함하는 희석제에서 이차 항체를 희석시. 슬라이드에 이차 항체를 추가하고 커버 슬립으로 덮고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, TBS-T에서 슬라이드를 각각 20분 동안 4회 헹구고 TBS에서 각각 20분 동안 4회 헹구십시오. 밤새 어둠 속에서 실온에서 슬라이드를 건조시다. 슬라이드를 근적외선 스캐닝 인터페이스에 배치하여 조직이 아래를 향하도록 합니다.선택 도구를 사용하여 한 번에 여러 슬라이드를 이미지합니다. 21 마이크로미터의 해상도로 최고 품질의 설정을 사용하여 슬라이드를 이미지합니다. 0 나노미터의 오프셋에서 이미지를 이미지 분석 소프트웨어로 가져와 반정성 단백질 분석을 보고 표시합니다.이미지 분석 소프트웨어를 연 후 이미지가 검색된 작업 영역을 선택합니다. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어에서 스캔된 이미지를 열어 원시 이미지 또는 총 정량화 방출을 변경하지 않고 표시된 파장, 대비, 밝기 및 배율을 조정합니다. 정량화에 대한 키 영역을 식별한 후 페이지 상단을 따라 분석 탭을 선택한 다음 그리기 사각형을 선택하여 정량화될 영역에 사각형을 그립니다.사각형 크기를 보려면 화면 왼쪽 하단을 따라 셰이프를 선택합니다. 그런 다음 오른쪽 하단을 따라 열을 선택합니다. 그런 다음 높이와 너비 열을 추가하여 셰이프 크기를 식별합니다.마지막으로 셰이프의 이름을 지정하고 반복합니다. 모든 영역이 샘플링되면 열 탭에서 사용할 수 있는 데이터의 결합 및 분석을 진행합니다. 이 프로토콜이 작동하는지 확인하기 위해 뇌 섹션은 1 차 및 이차 항체, 이차 항체 단독으로 또는 1 차 또는 이차 항체로 배양되었습니다.즉각적인 초기 유전자 c-jun 발현은 뇌 조직에 1차 및 이차 항체가 모두 적용될 때만 등막 해마와 편도체에서 검출되었다. AMPA 수용체의 GluR1 서브 유닛 및 NMDA 수용체의 NR2A 서브 유닛은 편도체 핵에서 대변 단백질 검출에서 분석되었다. 이것은 학습과 기억의 신경 생물학 서명인 편도체의 서브 핵에 있는 AMPA NMDA 수용체의 비율을 검토하는 것을 허용했습니다.단백질 발현의 평균 및 정규화 측정은 복부 해마에서 고해상도 스캔으로부터 얻어졌다. 영상 분석 소프트웨어를 이용하여, 직사각형은 관심 영역에 배치되고 형상으로부터의 빛의 평균 강도는 단백질 발현의 척도인 형광발현의 척도로서 사용되었다. 정규화된 곡선을 얻기 위해, 곡선 아래 영역에서 높은 신호와 낮은 신호를 표현하는 영역에 걸쳐 형상을 단백질 발현의 척도로 사용하였다.이 절차와 함께 가장 큰 투쟁은 항체를 찾아서 그것이 작동하는지 확인하는 것입니다. 응용 프로그램은 간단합니다. 내 충고는 먼저 정기적 인 면역 히스토케미컬 절차를 시도한 다음이 기술을 시도하는 것입니다.항상 먼저 유효성 검사 분석작업을 수행합니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 항체 희석을 확인하고 올바르게 적용되었는지 확인하는 것입니다. 이러한 단계가 없으면 프로시저가 실패합니다.

using-near-infrared-fluorescence-high-resolution-scanning-to-measure

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

이 비디오는 특정 시냅스전 단백질의 분포를 정량화하기 위해 마우스 뇌 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 프로세스에는 비특이적 부위를 차단하고, 표적 단백질에 대한 1차 항체와 참조 마커를 적용한 다음, 2차 항체 라벨링 및 핵 counterstaining이 포함됩니다. 참조 마커는 일관된 기준선을 제공하여 정확한 정량화를 보장하며, 공초점 현미경을 사용하여 뇌 영역 전반에 걸쳐 시냅스전 단백질의 분포를 분석합니다.

면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016). 이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

출처: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. 근적외선 형광 및 고해상도 스캐닝을 사용하여 설치류 뇌의 단백질 발현을 측정합니다. J. Vis. 특급. (2019) 이 비디오는 단백질 발현을 측정하기 위한 근적외선 형광 및 고해상도 스캐닝 방법을 보여줍니다. 설치류의 뇌에서.

Measuring Protein Expression in the Rodent Brain Using near-infrared Fluorescence and High-Resolution Scanning(근적외선 형광 및 고해상도 스캐닝을 사용한 설치류 뇌의 단백질 발현 측정) 

출처: Lacin, E., et al. 생체 내 신경 전달 물질의 광학 검출을 위한 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)의 구성. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 피질에 사전 주입된 특수 리포터 세포인 세포 기반 신경 전달 물질 형광 공학 리포터(CNiFER)를 사용하여 생체 내 신경 전달 물질 방출을 이미징하는 기술을 보여줍니다. 2광자 현미경 아래에 위치한 마우스는 형광 방출을 통해 신경 전달 물질 유도 칼슘 신호를 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 CNiFER의 G-단백질 결합 수용체에 대한 신경 전달 물질 결합을 활용하여 칼슘 방출 및 형광을 유발하여 신경 전달 물질 활성을 실시간으로 감지합니다.

세포 기반 신경 전달 물질 형광 조작 리포터를 사용한 이미징 신경 전달 물질 방출

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 세포 유형별 유전자 발현, 후성유전학적 마커 및/또는 단백질 발현의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 것입니다.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

배우세요 근적외선 형광 및 고분해능 주사를 활용한 설치류 뇌 단백질 발현 정량화 방법을. 면역조직화학법으로 해마와 편도체에서 AMPA/NMDA 수용체 비율 및 인지 관련 분자 신호 경로를 효율적으로 분석할 수 있습니다.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

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