전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

RNA 중합효소와의 전사 인자 (TFs)의 상호 작용은 일반적으로 풀다운 검정을 사용하여 연구됩니다. 우리는 클라미다이얼 RNA 폴리머라제와 GrgA의 상호 작용을 특성화하기 위해 생체층 간섭측정기(BLI) 기술을 적용합니다. 풀다운 분석과 비교하여 BLI는 실시간 연결 및 해리를 감지하고 더 높은 감도를 제공하며 정량적입니다.

전사에 단백질 단백질 상호 작용은 전통적으로 포 투석을 사용하여 연구되었습니다. 그러나, 포 투석은 순전히 정량적입니다. 우리는 이 문제를 극복하기 위하여 생물층 간섭성, 또는 BLI를 이용합니다.

Por dan에 비해 BLI는 본딩 파트너 간의 실시간 연결 및 해리를 감지합니다. 또한 상호 작용 메커니즘을 나타내는 정량적 운동 매개 변수를 생성합니다. BLI 기술은 위협적인 것처럼 들릴 지 모르지만,이 기술을 사용하는 법을 배우는 것은 어렵지 않으며 BLI 기기 및 관련 소프트웨어에 액세스 할 수 있어야합니다.

이 비디오를 사용하면 BLI 기술에 쉽게 적응할 수 있습니다. 분석이 시작되기 약 10분 전에 BLI 버퍼의 파이펫 200 마이크로리터가 PCR 튜브로 들어갑니다. 장갑을 낀 손을 사용하여 바이오 센서의 넓은 부분을 잡고 원래 포장에서 니켈 NTA 바이오 센서를 제거합니다.

바이오 센서의 유리 끝만 BLI 버퍼에 침수되는 PCR 튜브 위에 바이오 센서를 배치합니다. 바이오 센서 팁을 10분 이상 잠수하여 완전한 수분을 공급하십시오. 블리츠 머신을 켭니다.

기기 뒷면의 USB 데이터 출력 포트를 통해 컴퓨터가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다. 컴퓨터에서 관련 소프트웨어를 열고 화면 왼쪽에 있는 고급 Kinetics를 클릭합니다. 소프트웨어에서 각 제목 아래에 실험에 대한 모든 적절한 정보를 입력합니다.

바이오 센서 유형을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 니켈 NTA를 선택합니다. 각 단계의 지속 시간은 필요에 따라 기본값에서 변경할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 초기 기준선과 기준선에 최소 30초, 연결 및 해리에 120초를 사용하십시오.

PCR 튜브에서 수화 니켈 NTA 바이오 센서를 제거하고 바이오 센서의 넓은 부분을 마운트에 밀어 서 기계의 바이오 센서 마운트에 부착합니다. 0.5 밀리리터 블랙 마이크로센심분리기 튜브를 기계의 튜브 홀더에 넣고 BLI 버퍼의 파이펫 400 마이크로리터를 넣습니다. 생체 센서 팁이 마이크로 센심 분리기 튜브의 완충제에 침수되도록 기계의 덮개를 닫습니다.

소프트웨어를 다음을 클릭하여 초기 기준선을 기록합니다. 초기 기준선 단계가 레코딩을 완료한 후 컴퓨터의 덮개를 엽니다. 드롭 홀더가 검은색 화살표 앞에 위치하도록 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다.

투석된 그의 태그가 달린 리간드의 피펫 네 마이크로리터가 드롭 홀더에 붙이고 기계의 덮개를 닫아 자동으로 로딩 단계를 기록하기 시작합니다. 로딩 단계가 녹화를 완료한 후 기기의 덮개를 엽니다. 슬라이더를 왼쪽으로 이동하여 튜브 홀더가 다시 한 번 검은 화살표 앞에 위치하도록 합니다.

기계의 뚜껑을 닫고 바이오 센서 팁이 튜브 홀더의 튜브의 BLI 버퍼에 침수되었는지 확인합니다. 기계와 소프트웨어가 자동으로 기준 단계 기록을 시작합니다. 기준선 단계가 레코딩을 완료한 후 컴퓨터의 덮개를 엽니다.

드롭 홀더를 제거하고 단백질을 피펫하고 총 5회 이중 증분물로 헹구어 청소하십시오. 마지막 세척 후 드롭 홀더의 표면을 청소하는 티슈 티슈를 사용합니다. 드롭 홀더를 다시 기기에 교체합니다.

드롭 홀더가 다시 한 번 검은 화살표 앞에 위치하도록 기기의 슬라이더를 오른쪽으로 이동합니다. 투석된 질량의 파이펫 4마이크로리터가 드롭 홀더에 있고 기계의 덮개를 닫아 자동으로 연결 단계를 기록합니다. 연결 단계가 녹음을 완료한 후 기계의 덮개를 엽니다.

튜브 홀더가 다시 검은 화살표 앞에 위치하고 자동으로 해리 단계를 기록하기 시작하는 기계의 덮개를 닫도록, 오른쪽으로 기계의 슬라이더를 이동합니다. 해리 단계가 녹화를 마친 후 기계의 덮개를 열고 드롭 홀더와 튜브 홀더를 제거합니다. 두 번 의 분수로 철저히 헹구어 단백질을 씻어냅니다.

바이오 센서를 제거하고 안전하게 폐기하십시오. 다른 해석기 농도를 사용하여 동일한 리간드 분석을 위해 이러한 단계를 반복합니다. 모든 실행이 완료되면 화면 왼쪽에 있는 파일 및 실험 저장을 클릭하여 소프트웨어의 데이터를 저장합니다.

데이터 실행 제목에서 단계 수정 및 피팅을 선택하고 분석을 클릭하여 운동 데이터를 생성합니다. 정량적 데이터를 워크시트로 추출하고 그래프를 생성하려면 CSV로 내보내기를 클릭하고 기록된 데이터를 CSV 파일로 저장합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 CSV 파일을 엽니다.

전체 길이 GrgA는 288 개의 아미노산으로 만들어집니다. 여기에 도시된 바와 같이, 28개의 아미노산 중간 부위가 시그마(28)를 직접 결합한다. 여기서 엔드 터미널로 태그된 중간 영역 His-tag는 니켈 NTA 바이오센서의 끝에 처음으로 고정된 리간드로 사용되었다.

리간드 바인딩 30초 전부터 3개의 다른 해석 농도를 가진 실험의 기록이 마지막 세척의 시작 후 2분 후에 끝나는 것을 보여 주었다. 리간드 별문자 연결 및 해리의 향상된 시각화는 처음 두 단계에서 값을 제거하고 기준선 재설정에 따라 표시됩니다. 바이오센서에서 언바운드 및 말기 GrgA 138~165를 세척한 후, 시그마(28)가 첨가된 후, 실분해와의 실시간 연관성이 기록되었다.

마지막으로, 실시간 해리는 세척 후 기록되었다. BLI 애사 전에, 글리세롤은 리간드와 문물에서 제거됩니다. 텍스트에서 설명한 대로 투석 후 곧 BLI를 수행하는 것이 좋습니다.

BLI와 전사에서 단백질 단백질 상호 작용을 특성화 한 후 상호 작용이 전사 개시, 신장 및 종료에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다.