Name: 전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 배우세요 전압에 민감한 염료를 사용한 뇌 슬라이스 광학 기록법으로 해마 신경 회로의 활동을 안정적으로 12시간 이상 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 신경 과학 및 전기생리학 연구에 활용됩니다.

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TT는 JSPS 카켄히 그랜트 (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K00038, JP15K00413) 및 후생노동성(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 및 H30 [1806216])의 보조금. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 도쿠시마 분리 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 슬라이스 준비를 위한 다음 프로토콜은 거의 표준 절차 27이지만, 수정은 VSD로 염색 및 기록의 프로토콜이었다.
1. 실험일 전준비
<ol><li>재고 A (표1),재고 B (표2),및 재고 C (표3)솔루션을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.</li>
	<li>인공 뇌척수액 1L(ACSF)(표4, 3단계 참조)를 준비하고 냉장고에 보관하십시오.</li>
	<li>수정된 ACSF 1L(표 5)을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.</li>
	<li>2 mL 바이알에 태아 소 혈청 (FBS)의 500 μL aliquots를 분배하고 냉동실에 보관하십시오.</li>
	<li>한천 분말의 4%를 전자레인지에 120mL에 녹여 90mm 일회용 페트리 접시에 붓습니다. 한천 플레이트는 추가 사용 전에 냉장 보관해야 합니다.</li>
	<li>실험 전날 냉동실에 다음 품목을 놓습니다: 수술용 트레이, 슬라이서 용기 및 알루미늄 냉각 블록(120x 120 x 20 mm 3).</li>
	<li>슬라이스 처리 시스템17,28(단계 6.12 참조)에 멤브레인 필터가 있는 플렉시 유리 링이 충분한지 확인하십시오.</li>
	<li>한천 파우더의 2%를 50 mL의 3M KCl에 전자레인지에 녹입니다. 접지 전극을 위한 마이크로파이펫을 사용하여 200 μL 팁에서 따뜻한 아가-KCl 용해물의 약 85 μL을 취하십시오. 팁을 따뜻한 한천 3M KCl 젤에 분리합니다. 이 단계를 반복하여 약 20-40개의 팁을 2% 한천으로 채웁니다.</li>
</ol>2. VSD (di-4-ANEPPS) 주식 솔루션의 준비
<ol><li>초순수로 1mL의 10% 폴리에톡설화 피마자유 용액을 준비합니다.</li>
	<li>디-4-ANEPPS(5 mg 바이알), 와류 및 초음파 처리재 10분 동안 1 mL의 에탄올을 바이알에 넣습니다. 용액은 di-4-ANEPPS 결정의 가능한 작은 잔류물로 깊은 붉은 색으로 변합니다. 참고: 이 단계에서 사용되는 에탄올은 새로 열어야 합니다.</li>
	<li>O 링이 있는 2mL 마이크로튜브로 솔루션을 전송합니다. 용액을 스핀다운하고 10% 폴리에톡설화 피조물 오일 용액 500 μL을 추가합니다. 참고: 염료는 매우 친유성입니다. DMSO 및 폴록사머는 di-4-ANEPPS를 용해시키는 데에도 사용될 수 있지만 멤브레인 전위 변화에 따른 광 신호의 관점에서, 우리는 에탄올-폴리에톡설화 피장 오일의 사용이 소음 비에 더 나은 신호를 제공한다는 것을 발견했습니다. 이는 세포막으로의 용매의 전달 속도와 관련될 수 있다.</li>
	<li>염료가 완전히 용해 될 때까지 소용돌이 및 초음파 처리하십시오.</li>
	<li>빛에 노출되지 않도록 하고 냉장고에 보관하십시오. 냉동실에 보관하지 마십시오. 주식은 몇 달 동안 지속될 수 있습니다. 참고: 실험 당일, 3-9단계를 따른다.</li>
</ol>3. ACSF의 일일 준비 (1 L) (표 4)
<ol><li>NaCl, NaHCO3및 플라스크에 포도당을 계량하십시오.</li>
	<li>플라스크에 950 mL의 증류수를 넣고 95% O 2/5% CO2 가스로 버블링을 시작합니다.</li>
	<li>2.5 mL의 스톡 A 용액을 플라스크에 넣고 실온에서 약 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>플라스크에 2.5 mL의 스톡 C 용액을 추가합니다.</li>
	<li>증류수를 추가하여 1L에 용액을 만듭니다.</li>
</ol>4. 염색 VSD 용액의 일일 준비
<ol><li>5분 동안 초음파 초음파 처리기에서 FBS 및 VSD 스톡 솔루션(2단계)의 500 μL 바이알을 초음파 처리합니다.</li>
	<li>FBS 의 유리병에 갓 준비된 ACSF 500 μL을 추가합니다.</li>
	<li>바이알에 VSD 스톡 용액의 20(마우스의 경우) 또는 40(쥐의 경우) μL을 첨가한다.</li>
	<li>용액이 옅은 주황색이 될 때까지 유리병을 초음파 및 소용돌이.</li>
</ol>5. 수술 준비
<ol><li>냉장 ACSF 100mL를 300mL 스테인리스 스틸 용기, 300mL 비커 및 플라스틱 용기에 별도로 넣고 냉동실에 보관하십시오. 다른 비커에 150 mL의차가운 변형 ACSF (표 2)를 부어 냉동실에 넣습니다. 솔루션이 냉각 될 때까지 기다립니다. 사전에 측정하고 결정해야 합니다.</li>
	<li>면도날(카본 강, 산업용 등급 0.13mm 두께, 양쪽 블레이드)을 슬라이서의 절반으로 부수도록 접습니다. 참고: 나머지 절반은 적절한 블레이드 홀더로 해부에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>ACSF 에서 블록을 준비 4% 한천 플레이트 조정지그 (그림 1).</li>
	<li>습한 인큐베이션 챔버(계면 형 챔버; 변형된 1.2L 밀봉 된 상자와 실리콘 패킹)를 준비하여 뇌 조각을 생리적으로 살아 있게 유지한다 (도2); ACSF를 95% O 2/5% CO2 가스로 작은 용기에 넣고 탄산염을 넣고 ACSF가 있는 90mm x 20mm 페트리 접시를 맨 위에 채웁니다. 참고: 작은 페트리 접시 (60mm x 20mm)는 접시에 여과 지를 지원하기 위해 90mm 접시의 중앙에 배치해야합니다.</li>
	<li>가열 장치에 상자를 넣고 28 °C까지 따뜻하게 20 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>분쇄된 얼음을 슬라이서 용기에 넣습니다. 얼음 위에 스테인리스 스틸 통(작은) 악기를 놓습니다: 메스, 블레이드 홀더, 링 핀셋, 한천 블록, 슬라이서 스테이지. 냉동 ACSF 및 수정 된 ACSF를 얼음과 거품에 95 % O2/ 5 % CO2 가스 (일명 카보겐)로 유지하십시오.</li>
	<li>가위(크고 작은), 핀셋, 주걱, 숟가락, 대각선 펜치 등 다음 악기를 통(큰 것)에 놓습니다.</li>
</ol>6. 수술 (생쥐)
<ol><li>연기 후드에 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취. 발가락 핀치시 동물의 페달 반사를 확인하여 마취 수준을 평가합니다.</li>
	<li>마우스를 참수하고 스테인레스 스틸 수술 트레이에 얼음 차가운 ACSF에 머리를 담급니다.</li>
	<li>1분 이내에 뇌를 추출하고 차가운 ACSF가 들어있는 비커에 5분 동안 넣습니다.</li>
	<li>비커에서 뇌를 꺼내 메스를 사용하여 뇌 블록을 다듬습니다 (그림3A).</li>
	<li>뇌 블록을 4% 한천 블록에 놓습니다(단계 5.3, 그림 3B). 두 반구는 한천 블록에 장착할 수 있습니다. 필터 용지로 블록에서 여분의 ACSF를 닦습니다.</li>
	<li>슬라이서 테이블에 얇은 접착제 (슈퍼 접착제)를 적용합니다. 한천 블록을 놓고 여과지를 사용하여 여분의 접착제를 닦아냅니다.</li>
	<li>뇌-한천 블록 상단에서 피펫을 사용하여 소량의 얼음 차가운 ACSF (~5 mL)를 부드럽게 바릅니다. 이것은 과잉 슈퍼 접착제를 고체화하고 접착제가 뇌를 덮고 슬라이스를 방해하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>슬라이서 테이블을 슬라이서 트레이(그림3C)에고정하고 수정된 ACSF를 붓습니다.</li>
	<li>슬라이서를 블레이드 주파수를 최대로 느린 속도로 설정합니다.</li>
	<li>슬라이스 두께를 350-400 μm로 설정하고 슬라이스를 시작합니다(그림3C). 슬라이스 트레이의 모서리에 슬라이스를 순서대로 배치하여 슬라이스의 깊이를 쉽게 구별할 수 있도록 합니다. 일반적으로 한 반구에서 3~5개의 슬라이스를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>30 G 바늘을 사용하여 뇌줄기부분을 잘라냅니다(그림 3D). 참고: CA3-CA1 경계 사이 절단과 같은 두뇌 슬라이스에 미세 수술은 필요한 경우에 쌍안경 현미경의 밑에 이 단계에서 행해져야 합니다.</li>
	<li>작은 기울어진 페인트 브러시를 사용하여 플렉시 글라스 링17 (외경 15mm, 내경 11mm, 두께 1mm, 그림 3E)으로보관된 멤브레인 필터 (0.45 μm 기공, PTFE 멤브레인, 13mm 직경)의 중앙에 슬라이스를 놓습니다. 링을 습한 회수 챔버에 놓고(그림 2) 커버를 고정하여 내부 압력을 높게 유지합니다. 참고: 슬라이스는 30 분 이내에 멤브레인에 달라 붙어 기록 챔버의 후속 단계에서 링으로 처리 할 수 있습니다. 슬라이스를 제자리에 유지하기 위해 가중치 나 다른 조치를 사용할 필요가 없습니다.</li>
	<li>링의 슬라이스 방향과 위치를 조정하여 잘 중앙에 배치되고 일관된 방향이 있는지 확인합니다(9.3 단계 참조).</li>
	<li>시편을 28°C에서 30분 동안 방치한 다음, 슬라이스 회수를 위해 실온에서 10 내지 30분 이상 방치한다. 참고: 슬라이스는 이제 적어도 15 시간 동안 좋은 생리 적 상태를 유지할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 슬라이스의 염색 및 헹구기 (생)
<ol><li>마이크로파이펫을 사용하여 링의 각 슬라이스에 염색 용액(4단계)의 100-110 μL을 부드럽게 바릅니다. 4단계에서 제조된 하나의 염색용액으로 8~9개의 슬라이스를 염색할 수 있다. 얼룩을 위해 슬라이스를 20분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>용기에 ACSF 50-100 mL을 준비하고 염색 용액을 헹구기 위해 슬라이스 된 표본이있는 링을 넣습니다.</li>
	<li>헹위된 슬라이스를 다른 배양실에 보관합니다. 실험 전에 복구를 위해 1 시간 이상 기다립니다. 참고: 인큐베이션 챔버는 가스로부터 분리되고 단단한 밀봉 된 상태에서 기록장소로 이동될 수 있다. 슬라이스는 가스 공급없이 적어도 20 분 동안 살아 있을 수 있습니다. 이 기능은 기록을 위해 슬라이스를 다른 장소로 이동해야 하는 경우에 유용합니다.</li>
</ol>8. 실험 기구의 일일 준비
<ol><li>앰프, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 켜고 소프트웨어가 실행 중인지 확인합니다.</li>
	<li>ACSF를 50 mL 튜브에 놓고 카보겐으로 거품을 냅니다.</li>
	<li>연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시킴. 유량을 약 1mL/min으로 조정합니다.</li>
	<li>실험실 내부의 액체 레벨이 항상 일정하게 유지되도록 흡입 파이펫의 높이를 조정합니다. 참고: 용액의 레벨은 안정적인 기록을 얻기 위해 중요하므로, 조정은 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행해야한다.</li>
	<li>3M KCl 한천으로 채워진 노란색 칩으로 구성된 접지 전극 설치 (2%) (1.8단계)을 3M KCl 용액의 소량으로 Ag-AgCl 와이어를 가진 홀더에 넣습니다.</li>
	<li>소량의 ACSF(부피의 약 2/3)를 테이퍼된 얇은 튜브 옐로우 팁을 사용하여 유리 전극(1mm 외경, 0.78mm 내경 0.78mm 내경)에 채우고 전극 홀더에 넣습니다.</li>
	<li>조작기에 설치된 로드에 홀더를 부착합니다. 전극 저항이 약 1MΩ인 앰프를 사용하십시오. 참고: 긴 생크 와이드 개구부(4-8 μm 개구부) 패치 형 전극은 현장 기록 및 자극 전극으로서 양호해야 한다.</li>
</ol>9. 레코딩 세션 시작
<ol><li>집게와 촉촉한 챔버에서 슬라이스 준비를.</li>
	<li>슬라이스를 현미경 아래 실험 챔버에 빠르게놓습니다(그림 4).</li>
	<li>링의 가장자리를 실리콘 O 링에 단단히 밀어 넣습니다. 실험실의 막이나 바닥을 부러뜨리지 않도록 주의하십시오. 참고: 슬라이스의 방향은 시야에서 전극을 자극하고 기록하는 방향에 대하여 고려되어야 한다. 건강한 슬라이스는 멤브레인 필터에 달라붙어서 가중치 및 나일론 메세와 같은 슬라이스를 수정하기 위해 다른 장치를 사용할 필요가 없습니다.</li>
	<li>자극 전극의 팁과 필드 전위 기록 전극을 투과된 빛으로 현미경 아래의 슬라이스에 놓습니다.</li>
	<li>전기 생리학적 기록 시스템을 사용하여 응답을 확인합니다. 주어진 구성으로 일반적인 (얼룩이 없는) 전기 생리학적 기록을 확인합니다. 참고: 기록 전극은 생략할 수 있지만 슬라이스의 생리학을 확인하는 데 유용하다.</li>
	<li>5x 침지 대물렌즈와 1x PLAN APO 튜브 렌즈로 10kHz에서 샘플링할 때 시편에서 13-15mW/cm2에 해당하는 카메라의 최대 용량의 약 70-80%로 여기 광 강도를 조정합니다. 여기 광 파지는 530 nm이고 방출 필터는 > 590 nm이어야 합니다. 참고: 셔터를 사용하여 여기 빛의 양을 최소화합니다. 지속적인 빛 노출은 슬라이스 생리학을 악화시킬 수 있다. 빛의 가능한 유해한 효과는 빛의 강도와 지속 시간에 따라 달라집니다. 빛의 효과를 판단하기 위해 전기 생리학적 기록을 사용합니다. 13-15 mW / cm 2의강도의 경우, 약 1 s 노출 허용 오차의 상한이어야한다.</li>
	<li>형광광원을 이용하여 수집 시스템으로 초점을 조정하는 것은 초점이 파장에 따라 다를 수 있기 때문에 수집을 시작한다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어의 데이터를 검사합니다. 참고: 우리는 상세한 분석을 위해 수치 분석 소프트웨어의 원래 마이크로 프로그래밍 패키지를 사용했다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

슬라이스 생리학은 올바른 신호를 수집하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에서 링 멤브레인 필터 시스템을 사용하면 절차 2,16및17에서 슬라이스가 건강하고 왜곡되지 않은 상태로 유지됩니다. 다른 시스템은 기록 하는 동안 슬라이스 생리학을 유지 하는 데 사용할 수 있습니다., 하지만 이미징 건강 한 슬라이스의 모든 부분을 필요로 하는 슬라이스는 언제 든 지 변형 되지 않아야. 링 멤브레인 필터 시스템은 필요한 염색 용액의 부피를 최소화하는 데 도움이하므로 염색에도 좋습니다. 시간 분획에 대해 낮어야 하므로 여기 빛의 강도를 제어하는 것도 중요합니다. 연속 조명은 시편을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 셔터를 적절히 사용해야 합니다.
VSD의 독성은 종종 29논의되었지만, 염료 농도, 여기 광 강도 및 빛에 대한 노출 기...

대량 염색 된 뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 감응염 (VSD) 이미징은 신경 회로 1, 2,3,4의 역학을 평가하는 유용한 정량적 도구가되었습니다. . 멤브레인 여기5,6,7,VSD 이미징으로 인한 광학 적 특성의 변화를 분석 한 후 1970 년대 초에 코헨 및 기타6,8에 의해 처음 기재되었습니다. 9. . 염료가 막 전위 변화(즉, 뉴런의 1차 신호)를 직접 프로브하기 때문에 실시간으로 뇌 기능을 모니터링하는 적절한 방법이다.
초기 VSD는 뇌 계통을 이해하는 바람직한 특성을 가지고, 이러한 빠른 시간 상수 와 같은 뉴런 막 전위 사건의 급속한 역학을 따르고, 멤브레인 전위 9의 변화와선형성 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14세 , 15. 다른 이미징 실험과 유사하게,이 기술은 원하는 결과를 달성하기 위해 카메라, 광학, 소프트웨어 및 슬라이스 생리학과 같은 광범위한 특정 튜닝을 필요로합니다. 이러한 기술적 함정 으로 인해 초기 노력 중 예상되는 이점은이 기술을 전문으로하지 않은 대부분의 실험실에서 반드시 구체화되지는 않았습니다.
기술적 난이도의 원초적 원인은 슬라이스 제제의 대량 염색에 적용될 때 멤브레인 전위 변화에 대한 VSD의 낮은 민감도였다. 광 신호의 크기(즉, 형광의 분수 변화)는 일반적으로 생리적 조건하에서 대조군(F0) 신호의 10-4-10-3이다. 뉴런의 막 전위 변화의 시간 척도는 약 밀리초에서 수백 밀리초까지입니다. 뉴런의 멤브레인 전위 변화를 측정하기 위해 레코딩에 사용되는 카메라는 고속(10kHz ~ 100Hz)의 이미지를 획득할 수 있어야 합니다. VSD의 낮은 감도와 신경 신호를 따르는 데 필요한 속도는 높은 신호 대 잡음 비 (S / N)2,16으로고속으로 카메라에서 많은 양의 빛을 수집해야합니다.
레코딩 시스템의 광학 장치는 충분한 빛의 수집을 보장하고 S/N을 개선하는 데 중요한 요소입니다. 광학에 의해 달성된 배율은 종종 국소 기능신경회로를 가시화하기 위해 1X ~ 10X와 같이 지나치게 낮습니다. 예를 들어, 해마 회로의 역학을 시각화하기 위해 약 5의 배율이 적합할 것입니다. 이러한 낮은 배율은 낮은 형광 효율을 가지고; 따라서 고급 광학은 이러한 기록에 도움이 될 것입니다.
또한 슬라이스 생리학도 필수적입니다. 이미징 분석에는 슬라이스가 손상되지 않도록 해야 하므로17. 또한, 더 긴 시간 동안 슬라이스 생존을 유지하기 위해 취한 조치는 중요하다18.
이 문서에서는 슬라이스, VSD 염색 및 측정을 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 또한 VSD, 이미징 장치 및 광학에 대한 개선 사항 및 이 방법을 간단하고 강력하며 정량적 분석으로 사용할 수 있게 한 실험 시스템에 대한 기타 추가 개선 사항에 대해 설명합니다. 뇌 기능의 수정19,20,21,22,23,24,25. 이 기술은 또한 해마 슬라이스1의CA1 영역에서 장기 적인 약식에 널리 사용될 수 있다. 더욱이, 이 기술은 단일 신경 세포(26)에서막 전위(26)의 광학 기록에도 유용하다.

<table><tbody><tr><td>고속 이미지 취득 시스템</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>MiCAM - Ultima</td><td>이미징 시스템</td></tr><tr><td>고속 이미지 획득 시스템</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>MiCAM 02</td><td></td></tr><tr><td>광시야 이미징을 위한 이미징 시스템 Macroscepe</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>THT macroscope</td><td>macroscope</td></tr><tr><td>사진 diodode stablilizer를 가진 고성능 LED 조명 체계</td><td>Brainvision co., 주식 회사.</td><td>LEX-2G</td><td>LED 조명</td></tr><tr><td>이미지 취득 소프트웨어</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>BV-ana</td><td>이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>다기능 전기 자극기</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>ESTM-8</td><td>자극 아이솔레이터 + AD/DA 컨버터</td></tr><tr><td>슬라이서</td><td>라이카</td><td>VT-1200S</td><td>슬라이서</td></tr><tr><td>라이</td><td>카</td><td>VT-1000</td><td>슬라이</td></tr>서 <tr><td>블레이드 슬라이서 용 날개</td><td>깃털 안전 면도기 (주)</td><td>#99027</td><td>탄소강 면도날</td></tr><tr><td>슬라이스 지원용 멤브레인 필터</td><td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td><td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &micro; m pores,membrane</td> <td>filter/0.45 13</td></tr><tr><td>수치 분석 소프트웨어</td><td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td><td>IgorPro</td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>자극 아이솔레이터</td><td>WPI Inc.</td><td>A395</td><td>자극 아이솔레이터</td></tr><tr><td>AD/DA 컨버터</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>AD/DA 컨버터</td></tr><tr><td>전압 민감형 염료 Di-4-ANEPPS</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>카탈로그 번호: D-1199</td><td>VSD: Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>Poloxamer</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Pluronic F-127 P30000MP</td><td>Poloxamer/Pluronic F-127 (DMSO의 20% 용액)</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 피마자 기름</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>크레 모퍼 EL C5135</td><td>폴리 에 톡 실 피마자 기름</td></tr></tbody></table>

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 에민감한 염료(VSD) 이미징은 신경 회로의 기능적 연결을 평가하는 유용한 도구입니다. 광 신호의 분수 변화로 인해, 이 방법을 정량적 분석법으로 사용하기가 어려웠다. 이 문서에서는 이 기술을 안정적이고 신뢰할 수 있는 특수 광학 및 슬라이스 처리 시스템에 대해 설명합니다. 본 기사에서는 VSD 염색 해마 슬라이스의 슬라이스 처리, 염색 및 기록을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 좋은 염색과 함께 오랜 시간 동안 생리 적 조건을 유지하고, 기록 하는 동안 슬라이스의 기계적 움직임을 방지합니다. 또한 소량의 염료로 조각을 염색 할 수 있습니다. 광학 장치는 낮은 배율에서 높은 수치 조리개를 구현하여 100픽셀 x 100픽셀 공간 해상도로 최대 프레임 속도 10kHz에서 VSD 신호를 기록할 수 있습니다. 높은 프레임 속도와 공간 해상도로 인해 이 기술은 신경 회로의 변화를 평가하기에 충분한 신호 대 잡음 비를 제공하는 사후 기록 필터를 적용합니다.

도 5는 마우스 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 샤퍼 담보의 전기 자극 시 대표적인 광 신호를 나타낸다. 그림 5A의 연속된 이미지는 공간 및 시간 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 표시하는 반면, 그림 5B는 5 x 5 x 5 입방 필터(가우시안 커널 컨볼루션, 5 x 5 공간- 및 5)를 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 시간 차원) 두 번. 높은 프레임 속도(0.1 ms/frame)와 높은 공간 해상도(100픽셀 x 100픽셀)로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않고 노이즈를 필터링하여 단일 시험에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서도 관찰할 수 있습니다( 그림 5C,필터 없음; 도 5D,필터; 그...

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

전압 에 민감한 염료를 가진 광학 기록 방법은 두뇌가 어떻게 작동하는지 시각화하는 이상적인 기술로 생각됩니다. 이 방법을 통해 우리는 12 시간 동안 안정적으로 신경 역학을 기록 할 수 있었습니다. 우리는 어머니에게 귀중한 산 응용 프로그램과 같은 개발의 모든 단계에서 화학 물질로 인한 회로 변화를 감지하기 위해 응용 프로그램을 확장하려고합니다.이 기술은 이미 잘 확립되어 있습니다. 여기에 제시된 방법을 따라 연구를 재현해 보십시오. 이 절차를 시작하려면, 스테인레스 스틸 수술 트레이에 얼음 차가운 ACSF에 참수 머리를 몰입.1 분 이내에 뇌를 추출하고 5 분 동안 차가운 ACSF를 포함하는 비커에 놓습니다. 다음으로, 메스와 미드 라인의 뇌 섹션을 분할하고 4 %의 천 블록에 두 반구를 배치합니다. 그런 다음 두 반구가 있는 뇌 블록을 4%의 한천 블록에 놓습니다.필터 용지로 블록에서 초과 ACSF를 닦아냅니다. 그 후 진동 플랫폼에 슈퍼 접착제를 적용합니다. 한천 블록을 위에 놓고 필터 용지로 과도한 접착제를 닦아냅니다.뇌 천 블록 상단에서 소량의 얼음 차가운 ACSF를 부드럽게 적용하여 과도한 초접착제를 고화시키고 접착제가 뇌를 덮고 슬라이스를 방해하지 않도록 합니다. 그 후, 진동 트레이에 플랫폼을 수정하고 수정 된 ACSF를 부어. 진동을 느린 속도로 설정하고 블레이드 주파수를 최대 설정으로 설정합니다.그런 다음 슬라이스를 시작합니다. 슬라이스 챔버의 순서를 쉽게 구별할 수 있도록 슬라이스 챔버의 모서리에 슬라이스를 순서대로 배치합니다. 일반적으로 3~5개의 슬라이스는 한 반구에서 얻을 수 있다.다음으로, 30 게이지 바늘을 사용하여 뇌 줄기 부분을 잘라. 작은 기울어진 페인트 브러시를 사용하여 플렉시글라스 링으로 유지되는 멤브레인 필터에 슬라이스를 놓습니다. 고리를 습한 복구 챔버에 놓고 커버를 고정하여 내부 압력을 높게 유지합니다.슬라이스를 멤브레인 필터에 배치할 때 링 내의 슬라이스의 방향과 위치를 조정하여 잘 중심이 되고 일관된 방향을 갖습니다. 표본을 섭씨 28도에서 30분 간 방치한 다음 실온에서 회복을 위해 최소 10~30분 간 둡니다. 슬라이스를 염색하려면 스테인링 솔루션 100마이크로리터를 각 슬라이스에 부드럽게 바르고 실온을 위해 20분 만에 배양합니다.다음으로 컨테이너에 50~100밀리리터의 ACSF를 준비합니다. 얼룩액을 헹구기 위해 시편과 링을 놓습니다. 그런 다음 헹도 된 조각을 다른 인큐베이션 챔버로 옮기습니다.실험 전에 복구를 위해 1시간 이상 기다립니다. 이 절차를 시작하려면 앰프, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 켜고 소프트웨어를 엽니다. 50 밀리리터 튜브에 ACSF를 붓고 카보겐으로 거품을 냅니다.연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시키고 유량을 분당 약 1밀리리터로 조정합니다. 그런 다음, 실험 챔버 내부의 액체 수준이 항상 일정하게 되도록 흡입 파이펫의 높이를 조정합니다. 접지 전극을 챔버에 놓습니다.그 후, 소량의 ACSF로 유리 전극을 채우고 전극 홀더에 놓습니다. 홀더를 조작자의 막대에 부착합니다. 앰프를 사용하여 전극 저항이 약 1 메가옴인지 확인합니다.레코딩 세션에서, 습한 챔버에서 실험 챔버로 슬라이스를 전송한다. 링 의 가장자리를 실리콘 o 링에 단단히 누릅니다. 실험 챔버의 막 이나 바닥을 부러 뜨리지 않도록주의하십시오.현미경의 밑에 자극전극의 끝과 필드 잠재적 기록 전극을 슬라이스에 놓습니다. 자극을 제공하여 호출된 응답을 확인합니다. 시야가 광학 기록 시스템의 오른쪽 신경 회로를 커버하는지 확인합니다.다음으로, 카메라의 최대 용량의 약 70~80%로 흥분광 강도를 조정합니다. 형광광원을 사용하여 획득 시스템으로 초점을 조정합니다. 그런 다음 수집 후 이미지 수집 소프트웨어에서 레코딩을 시작하고 데이터를 분석합니다.이 그림은 마우스 해마 슬라이스의 영역 CA1에서 샤퍼 콜라탈롤의 전기 자극시 대표적인 광학 신호를 나타낸다. 이러한 연속 이미지는 간격 및 측두엽 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 나타내며, 이러한 이미지는 5x 5 입방 필터를 두 번 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 높은 프레임 속도와 높은 공간 해상도로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않았지만 단일 평가판에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서 관찰할 수 있는 노이즈를 필터링했습니다.다음은 마우스와 쥐 사이의 해마 슬라이스의 영역 CA1의 전형적인 반응의 비교입니다. 작은 과극 반응은 마우스 해마 슬라이스에서 24 밀리초 후에 CA1의 단상 측에서 관찰되지만, 더 거대한 과극화 반응은 쥐 해마 슬라이스에서 탈극반응을 추월했다. 슬라이스가 염색되면 12 시간 이상 지속되어야하며 다른 전기 생리학적 기록을 수행 할 수 있습니다.

wide-field-single-photon-optical-recording-brain-slices-using-voltage

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 염료가 조정 해상도 등 기니 돼지 장용 신경계의 plexuses으로 손상 신경망에서 전기 활동의 광학 녹음을 활성화하는 방법 전압에 민감한 개념 단일 세포에서 다중 ganglionic 회로 등을 꼽을 수 있습니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

대뇌 피질의 기능이 뉴런의 인구의 수준에 발생하기 때문에 척추 중추 신경계의 기능을 이해하는 것은 많은 뉴런의 녹음이 필요합니다. 다음은 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도로 suprathreshold 신경 활동을 기록 할 수있는 광학 방법을 설명, 랜덤 액세스 검사는 디더링. 까지의 높은 시간적 해상도 100 뉴런이 방법을 기록 체세포 형광 칼슘 신호. 최고 확률이 알고리즘은 체세포의 형광 칼슘 신호의 기본 suprathreshold 신경 활동을 deconvolves. 이 방법은 안정적으로 높은 검출 효율과 잘못된 반응의 낮은 속도로 스파이크를 감지하고 신경 인구를 공부하는 데 사용할 수...

단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 suprathreshold 신경 활동의 광 기록

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

이 비디오는 전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편에서 신경 활동의 변화를 관찰하는 절차를 보여줍니다. 염료는 형광 강도를 변경하여 뉴런의 막 전위의 변화를 반영합니다. 전기 자극과 고급 이미징 기술의 적용을 통해 이 프로세스를 통해 VSD 형광을 기반으로 신경막 전위의 실시간 변화를 시각적으로 추적할 수 있습니다.

전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편의 신경 활동에 대한 광학 기록

이 비디오는 뉴런 특이적 형광 단백질을 포함하는 형질전환 뇌 절편에서 전기 활동을 동시에 이미징하고 기록하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 폭기된 인공 뇌척수액이 있는 관류 챔버에서 뇌 절편을 유지하고, 광원을 사용하여 형광 표지된 세포를 여기시키고, 다중 채널 프로브 및 패치 클램프로 전기 신호를 기록하는 것이 포함됩니다.

뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

이 비디오는 내측 전전두엽 피질(mPFC) 축삭을 광유전학적으로 자극하고 LEC에서 피라미드 뉴런의 반응을 기록하여 외측 내후각 피질(LEC)의 시냅스 효율성을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 녹음과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합합니다.

쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

배우세요 전압에 민감한 염료를 사용한 뇌 슬라이스 광학 기록법으로 해마 신경 회로의 활동을 안정적으로 12시간 이상 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 신경 과학 및 전기생리학 연구에 활용됩니다.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

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