Name: 신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 신생아 쥐 뇌 조직을 이용한 고해상도 전자현미경 제작법으로 신경 말단의 시냅스 소포 분포를 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 시냅스 기능과 약물 효과 연구에 활용됩니다.

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이 원고는 NIH/니 치 K08 123321에 의해 지원 되었다 (N.L.에) 및 버지니아 대학의 마 취 학과에서 자금. 저자는 Alev Erisir에 게 감사를 기원 합니다 (생물학과 버지니아의 대학, 샤 러 츠 빌, VA)에 대 한 우수한 교육과 기술 지원을 위한 TEM, 그리고 그녀의 귀중 한 원고 비판. 저자는 또한 시 편 절편 및 사후 염색에 대 한 기술 지원을 위해 버지니아 대학의 고급 전자 현미경 검사 시설에 감사 드립니다.

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TEM에 대 한 표본 준비 중 조직 섹션의 처리는 상당한 기교, 집중력 및 인내심을 필요로 합니다. 마이크로 파이 펫을 사용 하 여 용액을 추가 하 고 제거 하는 경우, 시 편은 표면 장력에 의해 피 펫 팁으로 빨려 들어갈 수 있으므로 파이 펫에의 한 조직 손상을 방지 하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한, 탈수 서 열의 특정 단계는 1 분으로 빨리 할 수 있으므로 작업자는 다음 탈수 단계가 시간에 시작 되 고 시 편이 건조 하거나 주름이 되지 않도록 신속 하 게 작업 해야 합니다. 특별 한 주의가 요구 되는 한 가지 절차는 오 스미의 사후 고정입니다. 단면도는 오 스미와 처리 후에 단단 해지고 쉽게 손상 될 수 있습니다. 오 스미를 추가 하기 전에, 단면이 바이 알의 바닥에 평평 하 고, 다른 어떤 배는 조직 골절을 초래할 것이 필수적 이다. 평형 된 조직의 취급은 평면 임베딩을 위한 aclar 필름에 섹션을 전송할 때 특히 어렵습니다. 파편을 피하기 위해 바이 알의 바닥에서 시 편을 들어 올릴 때, 그리고 필름 샌드위치에...

우리는 신경 말단1,2에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 심층 형태학 적 분석을 위한 고품질 전자 현미경을 얻기 위해 신생 쥐 뇌 조직의 준비를 위한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법에 따라 시 편을 처리 하 여 얻을 수 있는 고 콘트라스트 마이크로 그래프는 또한 다 수의 세포 성분 및 그들의 치수 구조 관계3,4의 상세한 형태학을 연구 하는데 사용 될 수 있다.
투과 전자 현미경 (TEM)은 세포 소기관 및 다른 세포 구조의 형태를 정량적으로 연구 하는 강력한 도구입니다. 이 10 년의 기준으로, 고압 동결에의 한 저온 고정을 제외 하 고는 면역 태그 추가 없이 지질 막과 소기관의 동일한 분해능을 제공할 수 있는 다른 조사 방법이 없습니다. 그러나, 동결 대체 기술은 널리 사용 되지 않고, 일반적으로 고가의 장비 및 긴 준비 시간을 필요로 한다.
TEM의 높은 분해 력을 이용 하기 위해서는 최적의 시 편 준비가 가장 중요 합니다. 표본 준비의 주요 목표는 살아있는 상태에서 최소한의 변경을 가진 조직 구조를 보전 하 고, 표본 대조를 강화 하 고, 처리 도중 세포 성분의 추출에 대하여 조직을 안정 시키고 전자에 노출 하기 위한 것입니다 빔. TEM 조직 준비를 위한 수많은 프로토콜이 수년간 여러 실험실에 의해 도입 되 고 완성 되었습니다. 그들 중 상당수는 시 냅 스 소포5,6,7,8,11의 최적의 시각화를 위한 방법에 초점을 맞추고 있다. 현재 사용 중인 여러 가지 잘 확립 된 금 표준 방법 중에서, 우리는 최적의 조직 구조를 보존 하는 것을 목표로 화학 고정, 사후 고정, en 블록 염색, 순차적 탈수, 수 지 매 립 및 사후 염색을 위한 절차를 선택 했습니다. 뛰어난 이미지 콘트라스트를 실현 합니다. 주의, 미세 울트라 구조의 보존 신생아 쥐 뇌 조직으로 작업 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 사실, 매우 젊은 동물의 중추 신 경계는 성인 뇌 보다 더 높은 수 분 함량, 세포 외 공간의 눈에 띄는 확대, 셀 간 패자 연결을 특징으로 합니다12. 이것은 신생 쥐 두뇌 조직은 오 스몰 농도에 있는 변화에 깊이 과민 하 게 하 고, 다른 탄력성12의 순차 해결책을 통해 처리 될 때 정교 하 게 아 티의 수축 및/또는 팽 윤에 경향이 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 쥐 신생 두뇌의 그것에 가능한 가까운 오 스몰 농도의 표본 처리를 위한 해결책을 채택 했습니다. 우리의 목표는 신경 말단에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 정량적 평가를 위한 고품질, 고 분해능 전자 현미경 이미지를 얻는 것 이었습니다. 구체적으로, 우리는 신경 말단 내 소포 수, 시 냅 스 전 혈장 막 으로부터의 시 냅 스 소포의 거리를 측정 하기 위해 모색 하 고 시 냅 스 전 막에 도킹 된 소 낭의 수 및 간 소포 거리1.
만족 스러운 화학 고정은 시 냅 스 소포 형태학과 공간 조직을 연구 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공 할 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위한 전제 조건입니다. 고정의 여러 모드가 존재 하지만, 혈관 관류에의 한 뇌 조직의 고정은 다른 방법 보다 확실히 우수 하다. 혈관 관류를 통한 고정은 전신 순환의 체포 직후에 시작 되기 때문에 뇌 조직의 탈 산소 및 고정과 단백질의 가교 사이의 간격을 단축 하 여 세포에서 최소 변형을 초래 합니다. 구조. 더욱이, 세포 외 및 세포 구획12,14에 대 한 혈관 내에서의 급속 한 고착의 흐름 때문에 빠르고 균일 한 침투를 수행 한다. 알데하이드로 1 차 고정 후 2 차 고정 (사후 고정)을 사용 하 여 미세 구조15,16,17의 우수한 보존을 산출 합니다. 알데하이드 및 파라 포름알데히드의 혼합물은 조직 (12) 내로의 보다 빠른 침투의 추가적인 이점을 가진다.
생물학적 조직은 수 지 매트릭스의 지지 없이 얇은 부분으로 절단 될 정도로 강성이 충분 하지 않기 때문에, 얇은 절편 전에 매 질에 포함 시켜야 합니다. 물-비 혼 화성 에폭시 수 지는 TEM에 있는 매 립 매체로 일반적으로 사용 됩니다. 이 유형의 매트릭스를 사용 하는 경우, 모든 시 편의 무료 물은 수 지 침투 전에 유기 용 매로 교체 해야 합니다. 물은 상승 된 농도의 에탄올 및/또는 아세톤 (12)의 일련의 용액을 통해 시 편을 통과 시 킴으로써 제거 된다. 이 프로토콜에서 표본은 플 렉 시 블 한 aclar 시트 사이에 먼저 평평 하 게 삽입 된 다음 캡슐에 포함 됩니다. 최종 결과는 원통형 수 지 블록의 끝에 위치한 조직으로, 마이크로 톰 절편 중에 발생 하는 진동의 영향을 최소한으로 받는 이상적인 형상을가지고 있습니다.
내 인 성 조직 대비를 향상 시키기 위해 중 금속으로 염색 하는 것은 표본 준비의 또 다른 중요 한 측면입니다. TEM에서의 이미지 콘트라스트는 조직의 원자에의 한 전자 산란에 기인한 것 이다. 그러나, 생물학적 물질은 주로 낮은 원자 무게 분자 (즉, 탄소, 수소, 산소 및 질소)로 구성 됩니다. 따라서, 충분 한 산란 대비의 생성은 조직의 세포 성분에 높은 원자 무게 원자의 혼 입이 필요 하다. 이는 중 금속12,18,19로 시 편의 얼룩을 통해 달성 된다. 오 스미 늄은 지질에 강하게 결합 하는 우라늄 및 납, 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 일반적인 중 금속입니다.
오 스미 (원자 번호 76)는 현존 하는 가장 흔한 금속 중 하나 이다. TEM에서 주요 역할은 신뢰할 수 있는 픽스 쳐12이지만, 그것은 모두 고착과 얼룩입니다. 사용 중인 다양 한 고정 프로토콜 중에서 알데하이드가 뒤 따른 이중 고정 방법은 표본 준비 중에 세포 성분의 추출을 줄이는 데 가장 효과적입니다. 이러한 두 개의 고정 제가 분자의 상이한 종류의 최대 수를 안정화 시키는데 사용 되 고, 특히 단백질과 지질은, 조직 초고 구조 12,14,15의 우수한 보존 결과 16 , 17.
우라늄 (원자 번호 92)은 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 무거운 금속으로, 가장 전형적으로는 우르 닐 아세테이트의 형태 이다. 오 스미와 마찬가지로, 그것은 얼룩과 고정의 역할을 하지만 TEM에서의 주된 역할은 얼룩20,21입니다. 핵 산-함유 및 막 모양 궁 구조는 명백 하 게 알데하이드-고정 조직22,23의 우르 라 염으로 우선적으로 염색 된다. 우 라 닐 아세테이트를 사용한 조직의 치료 및 탈수 전에 막 모양 궁 및 핵 산 함유 구조물의 안정화를 초래 하 고, 콘트라스트를 향상 시키고, 일부 구조적 세부 사항을 식별 하 여 만12,24,25의 오 스미로 얼룩진 표본에서 쉽게 검출할 수 있습니다. 요로 닐 아세테이트는 오 스 설 하24시 지질 막에 증 착 되어 있는 환 원 질과 결합 하 여 미세 구조를 안정화 시킬 수 있다고 생각 된다. Uranyl 아세테이트를 포함 하기 전에 적용 하 고 얇은 섹션12에서 얼룩을 발생 시키면 최대 콘트라스트가 달성 됩니다.
납 (원자 번호 82)은 TEM에 사용 되는 가장 흔한 얼룩 이며 주로 얇은 단면의 후 염색에 채택 됩니다. 납 염은 높은 전자 불투명도를 가지 며 멤브레인, 핵 및 세포질 단백질, 핵 산 및 글 리 코겐26,27을 포함 한 광범위 한 세포 구조에 대 한 친화도를 보여줍니다. 이중 염색 방법이 채용 되는 경우 (즉, 우르 라 아세테이트로 염색 하 여 납으로 처리 한 후), 후자는 우르 라 아세테이트 염색의 현상 액으로 작용 한다. 예를 들면, 알데하이드로 결정 된 염색 질의 납 후 염색 질은 3 개의28,29,30,31의 인자에 의해 우 라 닐 아세테이트 흡수를 증가32. 납은 또한 오 스미 움과 같은 그밖 금속에 의해 부여 된 얼룩을 강화 합니다. 인지질의 존재 하에의 극성 기에 부착 하 여 고정 된 조직-오 스미 움의 막으로의 납 염의 얼룩을 감소 시키는 것으로 생각 된다33. Uranyl 아세테이트와 납 모두로 염색의 잠재적인 단점은 특히 장기간 지속 되는 경우, 많은 다른 구조적 요소가 동등 하 게 그리고 비 특이 적으로 염색 되 고, 따라서 서로 쉽게 구별 되지 않을 수 있다는 것입니다12 .
최근의 광학 슈퍼 해상도 사진 활성화 국 소화 현미경과 같은 대체 광원의 도입은 현저 하 게 개선 된 광 현미경 해상도34을 갖는다. 그러나, 가벼운 현미경 검사 법은 개별적인 라벨링 한 단백질 또는 효소를 구상 하기 위하여 조직학 및 면역 세포 화학 방법에 의존 하기 때문에, 한 번에 모든 구조상 요소를 표시 하는 TEM의 힘은의 깊이 있는 연구를 위해 타의 추종을 불허 남아 있습니다 조직 구조의 형태학 및 차원 관계. 특히 시 냅 시스 신경 boutons 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 수행 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공할 수 있는 다른 기술은 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 전자 현미경은 유기 체가 죽으면 조직의 구조를 포착 하는 것이 중요 합니다, 따라서 그들은 전 시 냅 스 소포 매매 및 exocytosis의 역학에 관하여 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서, FM 염료-라이브 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학 등의 다른 도구는 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 배설의 동적 및/또는 기능적 측면을 연구 하는 것입니다 때 고려해 야 합니다.

<table><tbody><tr><td>4% 오스뮴 테트록사이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19170</td><td>수성</td></tr><tr><td>50% 글루타르알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16310</td><td>EM 등급,</td></tr><tr><td>수성 Aclar 33 C 임베딩 필름</td><td>전자 현미경 과학</td><td>50425-25</td><td>7.8mil 두께, 크기 8"x10"</td></tr><tr><td>BEEM 캡슐 홀더</td><td>전자 현미경 과학</td><td>69916</td><td>보유 크기 "00" 캡슐</td></tr><tr><td>BEEM 임베딩 캡슐</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70021</td><td>" 크기 00, 평면(바닥 절단)"</td></tr><tr><td>버틀러 블록 트리머</td><td>전자 현미경 과학</td><td>69945-01</td><td></td></tr><tr><td>낙타 헤어 페인트 브러시</td><td>전자 현미경 과학</td><td>65576-01</td><td></td></tr><tr><td>디스크 펀치</td><td>전자 현미경 과학</td><td>77850-09</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 kit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Lead acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17600</td><td></td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Lead nitrate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>Leica UC7 ultracut microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro scale</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62091-23</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19208</td><td>EM 등급, 세분화된</td></tr><tr><td>정밀 Thelco 실험실 오븐</td><td>Thelco</td><td>51221159</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마-알드리히트</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StatMark 펜</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72109-01</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode 용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>11760-05</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>전자 현미경 과학</td><td>22400</td><td>분말</td></tr></tbody></table>

신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

우리의 실험실 및 많은 다른 사람 시 냅 스 소포의 형태와 공간 조직을 연구 하는 전송 전자 현미경의 높은 해결 능력을 착취 했다. 시 냅 스 소포 분포의 정량적 분석에 필요한 형태학 적 디테일의 정도를 얻을 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위해서는 최적의 시 편 준비가 중요 하다. 화학 고정은 표본 준비 과정의 첫 번째 단계 이며 미세한 미세 구조를 유지 하는 데 가장 중요 합니다. 알데하이드 포 름 알 데히드 용액을 사용한 혈관 고정, 오 스미 눔과 함께 구조 단면 시 편을 처리 한 후, 분자의 최대 수, 특히 단백질과 지질을 안정화 하 고 우수한 보존 효과를 냅니다. 구조입니다. 조직은 반대 염색, 순차 탈수 및 수 지 임베딩으로 처리 됩니다. Uranyl 아세테이트를 사용한 En 블록 염색 (즉, 수 지 매 립 전에 진동-절편 된 조직의 염색)은 내 인 성 대비를 강화 하 고 표본 처리 시 추출에 대 한 세포 성분을 안정화 시킵니다. 우 라 아세테이트를 초박형 단면에 후 얼룩으로 적용 하 여 콘트라스트를 더욱 높일 수 있습니다. 우 라 닐 아세테이트 처리 후에 리드 구 연산 염을 가진 극 박 단면의 이중 염색은 또한 이미지 해상도를 향상 시키며, 우 라 닐 아세테이트에 대 한 리드의 선택적 결합을 통해 핵 산 함유 구조의 전자 불투명도를 심화 시킨다. 투과 전자 현미경은 시 냅 스 소포의 형태학 적 세부 분석 및 터미널 bouton의 크기 및 공간 조직의 정량화를 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그것은 고정 조직을 사용 하기 때문에, 전송 전자 현미경은 살아있는 또는 발전 프로세스에 관하여 간접적인 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서, 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 해충 증의 동적인 또는 기능적인 양상을 공부 하는 때 그밖 기술은 고려 되어야 합니다.

TEM에 대 한 시 편의 만족 또는 결함 보전을 나타내는 것으로 대부분 인정 되는 일반 기준이 확립 되었다. 이러한 기준은 4 개의 선택 된 전자 현미경 (최적의 제제의 두 가지 예, 결함 있는 제제의 두 가지 예)에서 예시 되는데,이는이 프로토콜에 기재 된 방법에 따라 젊은 쥐 뇌 조직을 치료 함으로써 얻어진 다.
일반적으로, 상 질 전자 현미경 사진은 질서 있는, 독특하고 전반적인 회색 빛 이미지로 나타납니다. 만족 스럽게 준비 된 표본에서 멤브레인 사이의 공백은 세분화 된 물질로 채워져 있어야 하며 비워 둘 수 없습니다. 마찬가지로, 세포질 지상 물질 또는 소기관 내에서 빈 공간을 찾을 수 없습니다 (도 1a 와도 2a 를도 3 및도 4와 비교). 그럼에도 불구 ...

우리는 신경 터미널에서 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 위한 고해상도 전자 현미경을 얻기 위해 신생아 쥐 뇌 조직을 처리 하는 절차를 설명 합니다. 이러한 방법으로 얻은 마이크로 그래프는 다양 한 세포 구성 요소와 그 차원 구조적 관계의 형태를 연구 하는 데에도 사용 될 수 있습니다.

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

전염 전자 현미경 검사법을 위한 조직 준비를 위한 몇몇 기존 프로토콜 중, 우리는 사전 시냅스 단자에서 시냅스 소포 분포의 형태측정 분석을 능력을 발휘하기 위하여 최적 구조 보존 및 고해상도 현미경 을 산출하는 방법을 선택했습니다. 이러한 방법으로 얻은 고대비 이미지는 사전 시냅스 막 및 간 소포 거리에 도킹된 소포의 사전 시냅스 멤브레인 수로부터의 시냅스 소포의 거리와 같은 파라미터를 정량화할 수 있게 한다. 이러한 모든 매개 변수는 시냅스 함수를 나타냅니다.시냅스 소포의 공간 적 조직에 있는 변경은 시냅스 기능의 중단과 연관될 수 있기 때문에, 이러한 방법은 시냅스 발달에 대한 일반적인 마취제의 효력을 검사하기 위하여 이용되었습니다. 이러한 방법은 또한 그들의 기능에 대 한 통찰력을 제공 하기 위해 시 냅 스의 상세한 형태에 어떤 약물 또는 치료의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다. 이전에 혈관 관류를 통해 파라 포름알데히드와 글루타랄데히드로 고정 쥐 뇌 섹션의 포스트 고정을 위한 osmium 테트록사이드를 준비하 음 부로 시작합니다.섹션은 osmium 테트산화물로 치료 후 강성된다. 따라서 조직 처리는 그 때부터 주의가 필요합니다. 또한 osmium을 추가하기 전에 어떤 주름이 조직 골절로 인해 평평해졌는지 확인하십시오.4%의 오스뮴 테트옥사이드와 물의 5밀리리터 유리 앰뮬을 열고 갈색 유리 병 안에 떨어뜨립니다. 0.2 개의 어금니 산염 버퍼의 5 밀리리터를 추가한 다음 0.1 개의 어금반 버퍼의 10 밀리리터를 추가하여 1 % 최종 솔루션을 달성하십시오. 긴 바늘이 장착된 20 밀리리터 주사기를 사용하여 1% 오스뮴 테트옥사이드를 그린 다음 알루미늄 호일로 덮인 갈색 유리 항아리에 오스뮴 테트옥사이드를 추가합니다.시편이 전개되고 평평해졌는지 확인한 후, 시편 바이알에 1%오스뮴 테트옥사이드와 0.1 어금니 PB를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 osmium 테트옥사이드에서 표본을 배양하십시오. 인큐베이션이 완료된 후 마이크로파이프로 오스뮴 테트옥사이드를 추출하고 프로토콜에 설명된 바와 같이 단면을 헹구는다.uranyl 아세테이트를 준비하려면 교반 접시에 70%에탄올 100밀리리터가 들어 있는 200밀리리터 체피 유리 플라스크를 놓습니다. 플라스크에 4그램의 우라닐 아세테이트를 넣고 알루미늄 호일을 감싸빛으로 강수량을 방지하고 지속적으로 저어줍니다. 50%에탄올로 단면을 탈수합니다.1 시간 동안 4 %의 uranyl 아세테이트를 준비 한 스테인은 원고에 설명 된 바와 같이 연쇄 탈수 및 헹구기를 따릅니다. 60 밀리리터 게이지 주사기에서 주사기 플런저를 제거하고 안전 바늘로 캡. 주사기를 열린 면으로 놓고 수지 믹스의 각 성분을 하나씩 추가합니다.파이프와 DMP30의 525 마이크로 리터를 추가하여 마무리합니다. DMP가 매우 점성이 있기 때문에 파이프의 플런저를 매우 느리게 이동합니다. 플런저를 주사사기에 다시 넣습니다.주사기를 몇 번 반전하여 내용을 혼합합니다. 색상은 노란색에서 황색으로 변경됩니다. 주사기 내부의 공기를 대피시다.그런 다음 적어도 30 분 동안 연속 흔들림으로 로커에 놓습니다. 에폭시 수지 1부와 아세톤 1부로 환멸바이알을 넣고 흔들어 섞어줍니다. 아세톤 증발을 피하기 위해 덮여 마지막 아세톤 린스 후 조직 섹션에 아세톤 혼합물에 하나의 수지에 이 것을 적용하십시오.2~4시간 후에 수지와 아세톤의 혼합물을 제거하고 전체 수지로 교체하고 4시간 동안 배양합니다. 모든 수지 폐기물을 후드 아래에 수거 용기에 넣고 중합하고 나중에 폐기하십시오. 투명 폴리 클로로트리플루오로로틸렌 필름 의 두 직사각형 조각을 잘라 70 %에탄올로 닦아.섹션의 모든 측면에 티슈가 없는 플라스틱이 1.5센티미터 이상 되도록 트리밍하여 너비가 동일하지만 상단시트의 높이는 아래시트의 약 2/3입니다. 바이알을 천천히 기울이고 미세한 낙타 페인트 브러시와 유연한 마이크로 주걱을 사용하여 바닥에서 표본을 매우 부드럽게 들어 올립니다. 그런 다음 조심스럽게 유리병 벽을 따라 섹션을 이동하고 하단 PCTFE 시트로 전송합니다.마이크로 주걱으로 여분의 수지를 제거하고 부드럽게 상단 시트로 표본을 덮습니다. 티슈 섹션에 직접 압력을 가하지 않고 갇힌 기포를 부드럽게 밀어 내고 과도한 수지를 닦아냅니다. 용매 내성 펜을 사용하여 시트에 라벨을 부착하고 오븐에 60도의 오븐에 넣고 2~3일 동안 중합합니다.샌드위치된 PCTFE 시트를 부드럽게 떼어 내어 엽니다. 용매 내성 펜을 사용하여 조직 근처에 표시하는 서납 절이 들어 있는 시트의 측면을 표시합니다. 디스크 펀치를 사용하여 펜 마크가 펀치 아웃 조직의 일부인지 확인하는 섹션의 원 샘플을 얻습니다.표본에 빛이 비추면 펜 마크가 빛난다. 캡슐 홀더에 캡슐 측의 캡슐 캡을 올려 놓습니다. 캡에 수지 한 방울을 놓고 티슈 섹션이 위를 향하여 캡 내부에 펀치 디스크를 삽입합니다.부드러운 코르크 스크류 무브먼트를 사용하여 캡슐을 캡에 삽입합니다. 미세한 핀셋을 사용하여 캡슐에 인쇄된 2센티미터 길이의 종이 라벨을 롤앤하느라 캡슐의 측면 벽의 곡률에 맞는지 확인합니다. 캡슐 내부에 포함 된 수지를 붓고 캡슐의 가장자리까지 채우고 뾰족한 나무 막대기를 사용하여 조직 표본을 바닥으로 밀어 넣습니다.중합을 위해 2 ~3 일 동안 60섭씨에 캡슐을 오븐에 놓습니다. 그런 다음 프로토콜에 설명된 대로 단면화 및 염색을 계속합니다. 신경 세포 구조의 만족스러운 보존의 전자 현미경 사진은 휴식없이 층화된 세포막을 보여줍니다.세포질은 마침내 세분화되고 빈 공간이 없습니다. 미토콘드리아는 부어오르거나 수축되지 않으며 보존된 외부 이중 멤브레인과 그대로 내부 cristae로 축소되지 않습니다. 시냅스 소포를 시각화하고 사전 시냅스 멤브레인에서의 거리를 측정하기 위해서는 신경 초구조학적 미세 구조와 미세한 형태학적 세부 사항의 최적의 보존이 필수적입니다.시냅스 소포는 뚜렷하고 깨지지 않는 단일 멤브레인에 의해 줄 지어 있어야합니다. 시냅스 소포 분포의 형태학적 분석을 용이하게 하기 위해서는 사전 시냅틱 및 포스트냅스 멤브레인이 유지되는 연속성에서 평행해야 합니다. 조직 구조의 결함 보존의 전자 현미경 사진은 신경 세포막의 왜곡 및 파손과 현저하게 확대 된 세포 외 공간의 존재를 보여줍니다.미토콘드리아는 불만을 토로하고 부은 크리스테를 가지고 있다. 결함이 있는 조직 구조 보존의 또 다른 예에서는 세포세포 공간이 확대된 미세하게 세분화된 세포질 물질 대신 세포질 내의 큰 흰색 빈 공간이 있었습니다. 인공 막은 글루타랄데히드로 고정하는 동안 지질의 동원으로 인해 발생할 가능성이 높습니다.젊은 뇌 조직을 작업 할 때 1 어금니 인산염 버퍼를 모든 용액용용으로 사용하여 신생아 쥐 뇌의 뇌에 가능한 한 가깝게 토니시티를 유지하고 관절 조직 수축 및 또는 붓기를 최소화하십시오. 이러한 방법으로 얻은 현미경 그래프는 시냅스 소포 이외의 다수의 세포 성분의 상세한 형태및 차원 구조 관계를 연구하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아, 골기 장치 및 핵 크로마틴.이 프로토콜의 여러 단계는 독성이 있을 수 있는 화학 물질이 필요합니다. 알데히드, 오스뮴, 우라늄 및 납 화합물을 취급할 때 항상 연기 후드 아래에서 작업하고 개인 보호 장비를 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

배아 쥐의 두뇌 집합의 문화 시스템을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 집계에 Multipotent progenitors 개발하고 뉴런, astrocytes 및 oligodendrocytes로 구별하실 수 있습니다.

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유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

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이 프로토콜 모두 시각적으로 통신 brainstem 척수 준비 하 고 포괄적인 단계별 방식 brainstem 가로 조각의 준비를 명확히. 그것은 재현성을 증가 하 고 brainstem의 호흡 영역에서 신경 출력 기록 가능한, 오래 지속, 컬 활성 분할 영역 취득의 가능성을 강화 하도록 설계 되었습니다.

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평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

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뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

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신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조

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